鄧珊珊，曹琦琛，馬成，白海紅，任曉君，應(yīng)萬濤，蔡耘

1.安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 合肥 230032；2.蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京蛋白質(zhì)組研究中心，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 102206；3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032

蛋白質(zhì)糖基化是最常見的翻譯后修飾之一[1]。它不僅在蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、溶解性、折疊和功能方面起著關(guān)鍵作用，還在細(xì)胞內(nèi)參與蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、定位和分子識(shí)別[2-3]。此外，異常糖基化也被證明和癌癥等疾病相關(guān)[4-5]，許多糖蛋白可以作為臨床生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[6]。因此，糖蛋白和糖肽的分離、發(fā)現(xiàn)和鑒定變得越來越重要，它可以幫助我們更好地理解許多生物過程，并找到一些新的潛在的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。以生物質(zhì)譜技術(shù)為主的規(guī)模化糖肽定性與定量分析，已成為當(dāng)前蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究的一個(gè)重要內(nèi)容。由于糖肽僅占所有酶解后肽段的小部分（2%～5%）[7]，其質(zhì)譜響應(yīng)很容易被高豐度非糖肽抑制。另外，由于糖鏈的微觀不均一性，一個(gè)糖基化位點(diǎn)上的糖鏈類型可能多達(dá)幾十種，進(jìn)一步降低了糖肽的相對(duì)量而使得它們很難被檢測(cè)到。因此，針對(duì)糖肽的特異性富集就顯得至關(guān)重要。目前，最常用的糖肽富集手段是凝集素親和[8-9]。不同的凝集素可以特異性地識(shí)別不同的糖型，如伴刀豆凝集素ConA對(duì)于高甘露糖型和雜合型N-糖都顯示出了很好的親和性。除凝集素親和富集外，其他手段如分子排阻[10]、親水色譜[11-12]、酰肼富集[13-14]也都廣泛應(yīng)用于糖肽的富集。但是，各種富集手段都存在一定的缺點(diǎn)。例如，凝集素不能針對(duì)所有糖型富集；親水富集會(huì)帶來假陽性和假陰性的鑒定結(jié)果；肼化學(xué)富集法操作繁瑣，特異性不強(qiáng)。這些都使得糖蛋白組學(xué)研究的進(jìn)展相對(duì)落后于磷酸化、泛素化等翻譯后修飾。

樹枝狀聚合物由于具有高度支化的三維球狀立體結(jié)構(gòu)和眾多的末端基團(tuán)，顯示出與相應(yīng)線型分子截然不同的性質(zhì)[15]，如低黏度、良好的溶解性和大量可修飾的末端官能團(tuán)等，使其具有廣泛的應(yīng)用前景，而且合成相對(duì)簡(jiǎn)單、成本低，因此成為近年來聚合物科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[16-17]。聚酰胺-胺［poly（amido?amine），PAMAM］型樹枝狀聚合物是其中較典型的、也是當(dāng)前研究和應(yīng)用較多的一類[18]。由于樹枝狀聚合物具有大量端基、分子間無纏結(jié)、低黏度和優(yōu)異的流動(dòng)性質(zhì)，并且其表面官能團(tuán)隨相對(duì)分子質(zhì)量和分子尺寸遞增，近年來已有很多將樹枝狀聚合物應(yīng)用到蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的例子[19-21]。在此，我們首次嘗試把PAMAM固定于溴化氰活化的瓊脂糖凝膠表面，并將之用于糖肽的選擇性分離。

1 材料和方法

1.1 材料

5～6周的雄性C57小鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；第6代PAMAM型樹枝狀聚合物（PAMAM-G6，10%）、第4代PAMAM型樹枝狀聚合物（PAMAM-G4，10%）購自山東威海晨源新材料有限公司；溴化氰瓊脂糖凝膠（CNBr-activated Sepha?rose 4B）、牛血清白蛋白（BSA）、馬心肌蛋白（MYO）、牛胎球蛋白（fetuin）、N-糖酰胺酶 F（PNGase F）、α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA，95%）、三氟乙酸（TFA，99%）、氰基硼氫化鈉（NaCNBH3）、高碘酸鈉（NaIO4）、尿素、十二烷基硫酸鈉（SDS）及己二酸二酰肼瓊脂糖（adipic acid dihydrazide-Agarose）均購自Sigma公司；甲酸（FA）購自Acros公司；色譜級(jí)乙腈（ACN）、甲醇（CH3OH）購自J.T.Baker公司；1，4-二硫蘇糖醇（DTT，98%）、碘乙酰胺（IAA，98%）、測(cè)序級(jí)胰蛋白酶（15 276 U/mg）購自Promega公司；Amicon Ultra-0.5、30 kD超濾管購自Millipore公司；膜離心吸附柱購自Thermo公司；Sep-Pak C18固相萃取小柱購自Waters公司；所有實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q純水系統(tǒng)提供；其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDITOF-TOF/MS，AB Sciex公司）；Agilent 1100毛細(xì)管高效液相色譜-電噴霧-線性離子阱-傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀（nanoLC-ESI-LTQ-FT，Thermo Finnigan公司）；Milli-Q純水系統(tǒng)（Millipore公司）；PB-10型pH計(jì)、BP211d分析天平（Sartorius公司）；DH-Ⅱ旋轉(zhuǎn)混合器、HS-3垂直混合儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；QL-901型渦旋混合儀（其林貝爾儀器制造有限公司）；NanoDrop 2000c超微量紫外分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific公司）；3K30型高速離心機(jī)（Sigma公司）；電熱恒溫水浴箱（北京醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2 合成固定化的樹枝狀聚合物材料

取400 μL 1 mmol/L HCl活化60 mg溴化氫瓊脂糖凝膠15 min，轉(zhuǎn)至膜離心吸附柱內(nèi)，用1 mmol/L HCl、結(jié) 合 溶 液（0.5 mol/L NaCl和 0.1 mol/L CH3COONa，pH8.3）各洗滌3次（每次200 μL），均分成2份，分別加入50 μL PAMAM-G6凍干粉和50 μL PAMAM-G4凍干粉，加入結(jié)合溶液400 μL，室溫結(jié)合過夜，然后用200 μL結(jié)合溶液離心清洗5次，加入 0.1 mol/L 封閉溶液（0.1 mol/L Tris-HCl，pH8.0）常 溫 封 閉 2 h，用 清 洗 溶 液 1（0.1 mol/L CH3COONa 和 0.5 mol/L NaCl，pH4.0）、清洗溶液 2（0.1 mol/L Tris-HCl和0.5 mol/L NaCl，pH8.0）各洗4次（每次 200 μL），加入 80%ACN/0.1%TFA 至PAMAM終濃度為2 μg/μL，儲(chǔ)存于4℃冰箱。

1.3 蛋白酶切

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA和牛胎球蛋白酶切 將標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品溶解于 50 μL 50 mmol/L NH4HCO3，加入0.5 μL 1 mol/L DTT，蛋白終濃度為 10 mmol/L，95℃變性10 min；加入2.5 μL 1 mol/L IAA，室溫暗處放置45 min烷基化，蛋白終濃度為50 mmol/L；加入 1 μL 1 mol/L DTT，封 閉 剩 余 的 IAA；加 入NH4HCO3至蛋白終濃度為2 μg/μL；按蛋白∶酶為1∶50的比例加入胰蛋白酶，37℃水浴酶切過夜；樣品存放于4℃冰箱待用。

1.3.2 鼠腦組織蛋白提取及酶切 C57小鼠于實(shí)驗(yàn)前16 h禁食，自由飲水；斷頸處死后迅速取出鼠腦，浸入冰冷的PBS緩沖液中，洗凈殘血，去除結(jié)締組織，稱重；將腦組織剪碎，加入5倍體積的裂解液（8 mol/L 尿素，4%SDS，0.1 mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L DTT，pH7.6），并在研缽內(nèi)勻漿10次，達(dá)到充分碎裂細(xì)胞的目的；將樣品加入15 mL離心管中，在4℃條件下混勻，15 min后進(jìn)行超聲波提取及離心；超聲波儀設(shè)置為脈沖工作模式，即工作1 s、間隔1 s，總時(shí)間為30 s，循環(huán)8次；4℃下混懸30 min，使蛋白充分溶解，最后在10℃下以40 000 r/min離心1 h，取上清液（含有胞漿蛋白和部分亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的膜蛋白）用NanoDrop 2000c測(cè)量蛋白濃度后備用。

參照過濾-輔助的樣品制備（FASP）[22]方法酶切鼠腦蛋白：取50 μL鼠腦蛋白提取液，加入50 μL 100 mmol/L DTT［用 4%SDS、100 mmol/L Tris/HCl（pH7.6）溶解］，95℃變性5 min，轉(zhuǎn)移至30 kD超濾管中，加入200 μL尿素，4℃、14 000 r/min離心15 min，重復(fù)1次；加入100 μL 50 mmol/L IAA溶液，550 r/min振蕩1 min，室溫下暗處烷基化20 min，14 000 r/min離心15 min；加入200 μL尿素，同樣轉(zhuǎn)速離心15 min，置換多余的IAA；加入100 μL 50 mmol/L NH4HCO3，14 000 r/min離心10 min，重復(fù)2次，棄去濾液；最后加NH4HCO3至蛋白終濃度為2 μg/μL，按蛋白∶酶為1∶50的比例加入胰蛋白酶，37℃烘箱過夜酶切，酶切結(jié)束后，14 000 r/min離心10 min；繼續(xù)加入 100 μL NH4HCO3，14 000 r/min離心10 min；合并濾液，存于4℃冰箱待用。

1.4 糖肽富集

1.4.1 肽段脫鹽 用Sep-Pak C18固相萃取小柱對(duì)富集前的肽段脫鹽。先用1 mL ACN活化小柱，再用1 mL 0.1%TFA溶液平衡小柱，然后將酶切樣品溶液（用TFA調(diào)整pH值為3）加載于脫鹽柱上，并用1 mL 0.1%TFA 溶液 沖洗 1 次 ，最后 用 600 μL 80%ACN/0.1%TFA溶液洗脫肽段，取5 μL洗脫溶液置熱干機(jī)中熱干，等體積水溶后用NanoDrop 2000c定量。

1.4.2 糖肽富集 加入終濃度為10 mmol/L NaIO4至脫鹽后的肽段溶液，4℃避光氧化l h，使其將糖單元上的鄰二羥基氧化為醛基；向氧化后的溶液中加入0.1%TFA降低ACN濃度，脫鹽后溶于400 μL 80%ACN/0.1%TFA；加入一定量的固定化的材料后，于垂直混合儀上混合過夜，取出，稀釋至ACN濃度低于10%，轉(zhuǎn)入30 kD超濾管，14 000 r/min離心30 min，用合適的清洗溶劑去除非特異性吸附，直至濾液質(zhì)譜信號(hào)低于50。

1.4.3 糖鏈切除 按照酶/蛋白為1 U/10 μg的比例將PNGase F加入富集得到的糖肽中，常溫酶切3 h，將N-糖基化肽段從聚合物上釋放，離心收集，進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定。

1.5 質(zhì)譜采集方法

1.5.1 MALDI-TOF-TOF/MS分析 樣品與基質(zhì)溶液（CHCA溶于50%ACN/0.1%TFA，5 g/L）以1∶1的體積比混合均勻，取0.8 μL點(diǎn)靶，用馬心肌紅蛋白的胰蛋白酶酶切肽段作為標(biāo)準(zhǔn)物對(duì)儀器進(jìn)行外標(biāo)校正，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜10 ppm，進(jìn)行質(zhì)譜分析。采用正離子反射檢測(cè)模式進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析。一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集采用MS-1kv反射模式，加速電壓20 kV，掃描范圍m/z為1000～4000，激光能量4500，每張譜圖由1750個(gè)亞譜累加獲得。

1.5.2 HPLC-ESI-LTQ-FT MS 分析 高效液相色譜采用Agilent 1100毛細(xì)管液相色譜儀，自動(dòng)進(jìn)樣器上樣。通過該色譜系統(tǒng)將樣品組分進(jìn)行色譜分離后，由ESI離子源進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行分析。液相色譜流動(dòng) 相 A 為 2%ACN、0.1%FA，流 動(dòng) 相 B 為 80%ACN、0.1%FA。洗脫梯度：0～90 min，6%～40%B；90～105 min，40%～100%B；105～120 min，100%B；用100%A平衡30 min后進(jìn)行下一次分離。上樣量25 μL，流動(dòng)相流速300 nL/min。質(zhì)譜選用正離子模式采集數(shù)據(jù)，掃描范圍設(shè)置為375.0～1500.0（m/z），采集時(shí)間為110 min。選取一級(jí)質(zhì)譜中10個(gè)信號(hào)最強(qiáng)的離子進(jìn)行二級(jí)分析，其碰撞能量為35 V，采用動(dòng)態(tài)排除功能（dynamic exclusion），排除時(shí)間30 s。

1.6 數(shù)據(jù)庫檢索與分析

MALDI-TOF-TOF/MS儀器控制軟件為4800 Explorer software。ESI-LTQ-FT MS質(zhì)譜譜圖數(shù)據(jù)檢索均使用pFind軟件；數(shù)據(jù)庫為UniProtKB mouse（2013-04-01更新），胰蛋白酶為蛋白質(zhì)水解酶，且最多允許2個(gè)漏切位點(diǎn)；半胱氨酸烷基化設(shè)置為固定修飾；將甲硫氨酸氧化設(shè)置為可變修飾；母離子質(zhì)量偏差（mass tolerance）為20 ppm；碎片離子設(shè)置為0.8 Da。搜索的數(shù)據(jù)結(jié)果用PEAKS軟件合并計(jì)算，軟件參數(shù)設(shè)置：假陽性率（FDR）≤1%，Deltacn=0.1。糖基化位點(diǎn)通過2個(gè)規(guī)則確定：①天冬氨酸殘基有0.9840 Da質(zhì)量位移；②天冬氨酸殘基必須在N-XS/T/C的結(jié)構(gòu)域中。

2 結(jié)果和討論

2.1 糖肽富集策略的建立及材料表征

本研究目的在于利用PAMAM大量末端氨基來開發(fā)一種糖肽富集新材料。首先利用親和加成反應(yīng)，將大量N端的樹枝狀聚合物固定到溴化氰活化的瓊脂糖凝膠上，單糖結(jié)構(gòu)中的順式鄰位羥基可以被高碘酸氧化產(chǎn)生醛基，醛基可以與氨基形成希夫堿，高密度的氨基有利于提高反應(yīng)效率，從而實(shí)現(xiàn)糖肽的高效富集。用膜離心吸附柱阻截結(jié)合糖肽的聚合物，經(jīng)PNGase F處理從固相載體上釋放糖肽，并采用質(zhì)譜對(duì)糖肽進(jìn)行序列鑒定和位點(diǎn)確認(rèn)。由于希夫堿的生成反應(yīng)是可逆反應(yīng)，為使反應(yīng)向正方向進(jìn)行，提高反應(yīng)轉(zhuǎn)化率，通常加入一定的還原劑，或通過優(yōu)化反應(yīng)條件，如反應(yīng)時(shí)間、溫度、pH值和溶劑系統(tǒng)及反應(yīng)試劑的比例來實(shí)現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)中，我們首先對(duì)該聚合物富集條件進(jìn)行優(yōu)化，并利用優(yōu)化后的方法，開展復(fù)雜體系中糖肽的特異性富集和鑒定試驗(yàn)。

2.2 材料表征結(jié)果

瓊脂糖凝膠經(jīng)第4代和第6代樹枝狀聚合物修飾前、后的凝膠掃描電鏡結(jié)果如圖1，用放大200倍的掃描電鏡能看出凝膠顆粒表面光潔度已有不同，放大1000倍后發(fā)現(xiàn)修飾后的顆粒粒徑增大了0.1 mm，顆粒表面也凹凸不平，證明材料被成功地固定到固相載體上。進(jìn)一步以不同放大倍數(shù)的透射電鏡驗(yàn)證，顆粒修飾前呈均一陰影，而修飾后有很多不均勻的黑點(diǎn)，材料表面凹凸不平，說明不同代數(shù)的樹枝狀聚合物材料都被成功地固定化。

2.3 富集條件的優(yōu)化

2.3.1 還原劑的考察 PNGase F酶切是最普遍的N-糖鏈釋放方法，幾乎可以水解糖肽和糖蛋白中所有的N-糖鏈，它可以切割分離與糖肽/糖蛋白天冬酰胺殘基直接相連的N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc），使天冬酰胺（Asn）轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼幔ˋsp），產(chǎn)生0.9847的質(zhì)量變化。對(duì)于氨基和醛基的反應(yīng)，一方面反應(yīng)完全程度隨反應(yīng)溫度升高而不斷提高，另一方面當(dāng)溫度大于50℃則易導(dǎo)致PAMAM環(huán)化成己內(nèi)酰胺，造成結(jié)構(gòu)缺陷[23]。因此，所有反應(yīng)要在低溫（25℃～50℃）下進(jìn)行?？紤]到PNGase F的活性，所有實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行。富集條件的考察均由PAMAM-G6對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白牛胎球蛋白的富集結(jié)果確定。

由于醛基與氨基之間為可逆反應(yīng)，溫度并不是影響此反應(yīng)完全程度的關(guān)鍵，該反應(yīng)的核心問題是使反應(yīng)不斷向正向進(jìn)行，提高產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率。牛胎球蛋白是一個(gè)研究較多的糖蛋白，它的胰酶酶切肽段包括3個(gè)N-連接和至少3個(gè)O-連接糖基化肽段[24]。圖2A為30 μg牛胎球蛋白溶于100 μL NH4HCO3經(jīng)PNGase F酶切得到的質(zhì)譜圖，只能檢測(cè)到1個(gè)糖肽信號(hào)（m/z 1741.7），加入 90 μg PAMAM-G6 富集后，糖肽信號(hào)峰1741.7有了明顯提高（圖2B），但仍然不能檢測(cè)到另外2條糖肽信號(hào)，而在偶合反應(yīng)中加入還原劑NaCNBH3后可以檢測(cè)到3條糖肽峰（圖2C），分別是 m/z 1741.7、m/z 3018.4 和 m/z 3673.7，所以還原劑可以促進(jìn)反應(yīng)不斷向正向進(jìn)行。

圖1 溴化氰活化的瓊脂糖凝膠修飾前后掃描電鏡結(jié)果A：修飾前；B：經(jīng)PAMAM-G4修飾后；C：經(jīng)PAMAM-G6修飾后

圖2 牛胎球蛋白酶切肽段在糖肽富集前后的質(zhì)譜圖A：未富集；B：未加還原劑富集；C：加入還原劑富集；N#表示N-連接糖肽序列中的天冬氨酸殘基

2.3.2 反應(yīng)體系酸度的考察 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，醛基和氨基在二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亞砜（DMSO）和ACN中反應(yīng)專一，雜質(zhì)峰少，因甲醇和四氫呋喃（THF）毒性較大，所以我們選擇ACN作為反應(yīng)溶劑。對(duì)于氨基試劑，在堿性催化劑下的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率很低，在酸性催化劑存在下反應(yīng)轉(zhuǎn)化率較高，實(shí)驗(yàn)選取30 μg牛胎球蛋白肽段加入90 μg凝膠材料，考察在不同酸度條件下的富集情況，結(jié)果見表1。牛胎球蛋白酶切后產(chǎn)生3條糖肽，當(dāng)結(jié)合溶液pH值不斷降低（從3.08到2.18）時(shí)，酸度提高，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率增加，從只能檢測(cè)到1條糖肽到3條糖肽均能被檢出；當(dāng)溶液pH值繼續(xù)降低（從2.18到0.45）時(shí)，質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果中非特異性吸附的肽段明顯增加，這些干擾造成低豐度糖肽被抑制，只能檢測(cè)到高豐度的糖肽 1741.7。結(jié)果表明，以 80%ACN/0.1%TFA（pH2.18）作為結(jié)合溶液時(shí)，可以特異地富集3條糖肽，最終選擇此反應(yīng)體系。

2.3.3 清洗條件的考察 低代的樹枝狀聚合物分子具有擴(kuò)展的或“開放式”結(jié)構(gòu)，隨著代數(shù)增加，末端基團(tuán)變得很擁擠，導(dǎo)致了樹枝狀聚合物采取致密的球狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)部具有廣闊的空腔，材料在與糖肽結(jié)合過程中除了共價(jià)結(jié)合糖肽分子以外，也可能會(huì)非共價(jià)包裹一些非糖肽分子，必須采用合適的洗脫溶劑才能有效去除非特異性吸附的非糖肽。我們考察了不同清洗溶劑的清洗情況，依次用500 μL的1.5 mol/L NaCl、8 mol/L 尿 素 、60%CH3OH、50 mmol/L NH4HCO3各洗脫1次，收集每次洗脫得到的溶液，脫鹽處理后進(jìn)行質(zhì)譜分析，在給定質(zhì)譜能量下質(zhì)譜檢測(cè)信號(hào)低于50，我們認(rèn)為非特異性結(jié)合的肽段被去除干凈。

表1 牛胎球蛋白胰蛋白酶酶切肽段在不同pH值結(jié)合溶液中富集獲得糖肽的結(jié)果

2.3.4 反 應(yīng) 試 劑 比 例 的 考 察 取 不 同 量 的PAMAM-G6對(duì)等量的牛胎球蛋白肽段（30 μg）進(jìn)行富集（質(zhì)量比分別為0.5∶1、2.5∶1、5∶1、7.5∶1、10∶1），MALDI-TOF-TOF/MS 分析表明糖肽m/z 1741.7峰的強(qiáng)度隨PAMAM-G6的用量發(fā)生變化（圖4），PAMAM-G6富集蛋白的最優(yōu)比為5∶1，此時(shí)基峰強(qiáng)度不再增加，富集效果也達(dá)到最好。

2.4 樣品復(fù)雜性對(duì)富集效果的影響

在優(yōu)化好相關(guān)富集條件后，我們探索PAMAMG6針對(duì)糖肽富集的選擇性，以保證聚合物材料能夠從一個(gè)較復(fù)雜的體系中選擇性地分離富集糖肽。將糖蛋白牛胎球蛋白和非糖蛋白BSA的胰蛋白酶酶解產(chǎn)物按一定比例（1∶50，質(zhì)量比）混合后進(jìn)行富集，富集前、后的質(zhì)譜圖如圖5?？梢钥吹剑肞AMAM-G6進(jìn)行富集前只能檢測(cè)到大量強(qiáng)度很高的非糖肽峰，經(jīng)過聚合物材料富集之后，糖肽峰被保留，非糖肽峰減弱，說明材料具備很好的糖肽選擇性。

2.5 鼠腦裂解液糖肽富集

圖3 不同清洗溶劑質(zhì)譜圖A：1.5 mol/L NaCl；B：8 mol/L尿素；C：60%CH3OH；D：50 mmol/L NH4HCO3

圖4 不同PAMAM-G6用量條件下的糖肽回收情況

通過以上標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白考察實(shí)驗(yàn)，我們初步建立了優(yōu)化的PAMAM-G6富集糖肽的新方法：選擇反應(yīng)體系為80%ACN/0.1%TFA，并在結(jié)合過程中加入還原劑，材料過量5倍，以 1.5 mol/L NaCl、8 mol/L尿素、60%CH3OH、50 mmol/L NH4HCO3為清洗溶液。我們將這一優(yōu)化的富集條件應(yīng)用于200 μg鼠腦全蛋白裂解液液中糖肽的富集，同時(shí)采用PAMAM-G4和PAMAM-G6按同樣的操作流程富集，作為對(duì)比，取市售酰肼化瓊脂糖凝膠50 μL用于同量鼠腦全蛋白裂解液中糖肽的富集。利用PEAKS軟件搜索質(zhì)譜raw文件，手動(dòng)篩選出打分高于15的肽段，得到的結(jié)果按照1.6中的規(guī)則處理。

結(jié)果表明，鼠腦全蛋白裂解液在富集前糖肽占全部肽段比例不到1%，經(jīng)過商業(yè)化酰肼材料富集后鑒定到的糖肽比例增加到14%，說明商業(yè)化酰肼材料可以提高糖肽的富集效率。經(jīng)PAMAM-G4富集后，從鼠腦198條肽段中鑒定出56條非冗余糖肽，占總肽段數(shù)目的28%；經(jīng)PAMAM-G6富集后，從鼠腦632條肽段中鑒定出204條非冗余糖肽，占總肽段數(shù)目的32%。很明顯，不同代數(shù)聚合物對(duì)糖肽的選擇性均高于商業(yè)化酰肼材料。從圖6可知，等量的鼠腦全蛋白裂解液經(jīng)PAMAM-G4富集后鑒定到56條非冗余糖肽，經(jīng)PAMAM-G6富集后鑒定到204條非冗余糖肽，PAMAM-G4鑒定到的糖肽數(shù)目低于PAMAM-G6。我們推測(cè)這主要是因PAMAM獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征所致，1個(gè)分子PAMAM-G6含末端氨基256個(gè)，而1個(gè)分子PAMAM-G4含末端氨基64個(gè)，前者的末端官能基團(tuán)數(shù)目是后者的6倍，這種差異導(dǎo)致后者的糖肽結(jié)合數(shù)目大于前者，富集效率也得到了提高。

圖5 牛胎球蛋白和BSA肽段混合物經(jīng)PAMAM-G6富集前（A）、后（B）的質(zhì)譜圖N#：N-連接糖肽序列中的天冬氨酸殘基

2.6 結(jié)論

圖6 鼠腦糖肽鑒定結(jié)果的相關(guān)性

目前，有關(guān)樹枝狀聚合物的研究不僅集中在揭示其獨(dú)特的性質(zhì)和性能方面，而且逐步轉(zhuǎn)移到功能化和應(yīng)用上，其應(yīng)用研究是一個(gè)新興的、很有吸引力的領(lǐng)域。在本研究中，我們首次將不同代數(shù)的樹枝狀聚合物材料PAMAM固定化于溴化氰活化的瓊脂糖凝膠表面，并將之用于糖肽富集，采用優(yōu)化的方法，在鼠腦中富集并鑒定到218條非冗余糖肽，無論是富集糖肽的特異性還是鑒定到的糖肽總數(shù)，均較商業(yè)化材料顯示出更好的效果。我們推測(cè)，基于樹枝狀聚合物的新材料的開發(fā)，包括將其固化于納米磁珠材料、選擇更新代數(shù)的聚合物和不同的表面反應(yīng)基團(tuán)等，將有望更好地實(shí)現(xiàn)對(duì)糖肽的針對(duì)性富集。

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