王霜霜，董林利，湯建新，李文

（湖南工業(yè)大學(xué)綠色包裝與生物納米技術(shù)應(yīng)用重點實驗室，湖南株洲412007）

p73基因多態(tài)性與非小細胞肺癌遺傳易感性分析

王霜霜，董林利，湯建新，李文

（湖南工業(yè)大學(xué)綠色包裝與生物納米技術(shù)應(yīng)用重點實驗室，湖南株洲412007）

采用兩對引物-聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-CTPP）方法分別對100例非小細胞肺癌患者和120例健康對照者進行p73基因多態(tài)性檢測，DNA測序驗證基因分型結(jié)果，對p73基因多態(tài)性與非小細胞肺癌的相關(guān)性進行分析，探討湖南省地區(qū)人群中p73基因多態(tài)性與非小細胞肺癌遺傳易感性的關(guān)系。試驗結(jié)果表明，PCRCTPP法和測序得到的基因分型結(jié)果完全吻合，100例肺癌患者的p73基因型分布如下：GC/GC型60例（60%）、GC/AT型36例（36%）、AT/AT型4例（4%），與攜帶p73 GC/GC基因型者比較，攜帶AT/AT基因型者的肺癌患病風(fēng)險增加3.4倍（OR=3.387，95%CI=1.055～10.875，P=0.032），而攜帶GC/AT基因型者肺癌風(fēng)險也呈增加趨勢，但是無顯著性差異（OR=1.183，95%CI=0.672～2.082，P=0.561）。p73基因多態(tài)性可能與湖南省地區(qū)人群非小細胞肺癌遺傳易感性相關(guān)。

NSCLC；p73基因多態(tài)性；PCR-CTPP 法

0 引言

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC）是肺癌的主要類型，為全世界最常見的惡性腫瘤之一，特別是在男性中容易發(fā)生[1]，嚴(yán)重地威脅著人類的健康。肺癌是一個與環(huán)境、職業(yè)、吸煙等因素高度相關(guān)的生物學(xué)復(fù)雜疾病，遺傳因素也起了重要作用，個體間細胞周期、DNA修復(fù)能力和凋亡控制能力的差異可能決定不同個體腫瘤的遺傳易感性[2]。研究肺癌與基因多態(tài)性之間的相關(guān)性有助于闡述肺癌的發(fā)病機制，包括它的形成和發(fā)展，對肺癌病人的診斷和預(yù)后起著重要作用。

p73基因位于人類染色體1p36.33位置，研究發(fā)現(xiàn)在p73第2外顯子起始密碼子AUG上游一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)中存在2個自然關(guān)聯(lián)的單核苷酸多態(tài)性（G4C14-A4T14），可能影響基因表達[3]。已有研究對這2個多態(tài)性與其他腫瘤的相關(guān)性進行了探討[4-6]，但結(jié)論不一致。有研究發(fā)現(xiàn)，中國北方人群[7]和非西班牙裔白人AT單倍型患肺癌風(fēng)險比GC/GC型顯著增加[8]；相反，另一研究發(fā)現(xiàn)，中國人群中攜帶AT單倍型者患肺癌風(fēng)險顯著降低[9]；還有研究發(fā)現(xiàn)，在韓國[10]和日本人群[11]中此多態(tài)性與肺癌患病風(fēng)險無顯著相關(guān)性。這些研究結(jié)果表明，不同的人群中p73 G4C14-A4T14多態(tài)性與肺癌患病的相關(guān)性可能不同。

目前，檢測基因突變的方法有很多種，如PCRRFLP、PCR-CTPP、PCR-SSCP、測序等。其中PCRRFLP法操作復(fù)雜且費事，要考慮酶切位點是否存在；PCR-SSCP法只能做篩查，結(jié)果必須經(jīng)DNA測序確定；測序法是檢測DNA突變的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是因其費用高，無法普遍應(yīng)用于臨床。而PCR-CTPP技術(shù)成本較低、操作簡便且結(jié)果穩(wěn)定，所以本文基于病例-對照研究，采用PCR-CTPP（polymerase chain reaction with confronting two-pair primers）法結(jié)合直接測序法對湖南省地區(qū)100例肺癌患者和120例正常對照者血樣進行了p73多態(tài)性檢測，進而分析了其與肺癌的相關(guān)性，探討湖南地區(qū)人群中p73基因多態(tài)性與肺癌遺傳易感性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本文收集湖南省株洲市中心醫(yī)院和湖南省腫瘤醫(yī)院腫瘤科2013年1月—2014年4月住院患者的血液樣品，包括100例肺癌患者和120例健康對照者。血樣分裝在抗凝管中于-80℃超低溫冰箱中保存。所有研究對象均知情并同意，本研究獲醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.2 主要材料與儀器

主要試驗試劑有：KI、異戊醇、無水乙醇、異丙醇、硼酸、氯化鈉、三氯甲烷（氯仿）、溴化乙錠（ethidium bromide, EB）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、濃鹽酸等，均為國產(chǎn)分析純，上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；瓊脂糖，西班牙Biowest公司生產(chǎn)；PCR Master Mix, DNA Marker 100 ladder, DNA Marker 5000 ladder，Tris-base，上海生工生物工程有限公司生產(chǎn)。

主要試驗儀器有：IF300-150制冰機，IIshin Lab公司；XMT-DA恒溫水浴鍋，余姚市亞星儀器儀表公司；Centrifuge541離心機，Eppendof公司；101-1AB電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；S0100振蕩器，美國Labnet公司；WD-900SL 23-2微波爐，格蘭仕有限公司；DYY-10C電泳儀，北京六一儀器廠；11200328凝膠成像儀，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；9700基因擴增儀，ABI公司。

1.3 DNA的提取

本試驗從外周血提取基因組DNA采用的是改良的KI法[12]，具體操作為：將-80℃冰凍的抗凝血置于37℃恒溫水浴鍋中解凍，取300L于1.5 mL EP管中，加入無菌雙蒸水（ddH2O）900 uL，混勻后以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心3 min，棄上清液；加入100L濃度為5 mol/L的KI溶液，振蕩30 s使其充分混勻；加入300L 0.9 % NaCl溶液，750L氯仿/異戊醇（體積比為24:1）混合液，立即振蕩30 s，充分混勻后以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min；吸取400L上清液于另一EP管中，各加400L異丙醇，輕輕混勻后以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清；加1 mL70 %乙醇，以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min；棄乙醇，烘干至無乙醇味；加入80L TE緩沖液，在55 ℃下水浴10～20 min，使其溶解，間隔5 min搖勻一次；提取完后采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測，用凝膠成像儀觀察并記錄結(jié)果，提取成功的DNA樣品放入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR-CTPP法對p73基因分型

檢測p73基因第2外顯子G4C14-A4T14位點的PCR-CTPP引物列于表1，各引物均由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為15L:7.5L PCR master mix混合液，2.5L ddH2O，兩對引物各加0.5L，1L模板DNA。PCR反應(yīng)條件是：在95℃預(yù)變性5 min，在95℃變性40 s，在60℃退火處理40 s，在72℃延伸40 s，共35個循環(huán)，最后在72℃延伸5 min?；驍U增完后，取10LPCR產(chǎn)物與溴酚藍混勻，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%瓊脂糖凝膠梳孔里，凝膠成像儀觀察并記錄結(jié)果。統(tǒng)計每個樣本的p73基因分型結(jié)果，各抽取1份p73的3種不同基因型（GC/GC型，AT/AT型，GC/AT型）的普通PCR擴增產(chǎn)物，送至上海生工生物公司測序驗證。

表1 PCR-CTPP法兩對引物Table 1The two pairs of primers by PCR-CTPP

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

以x2檢驗方法比較病例組和健康組中基因型和等位基因的分布差異，采用多因素Logistic回歸通過ORs值、95%CI值分析p73基因多態(tài)性與肺癌遺傳易感性的相關(guān)性。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0處理，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 基因組DNA的鑒定

圖1為提取的基因組DNA電泳圖。采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖所示，9個DNA樣品均具有一條較清晰的亮帶，且DNA樣品紫外檢測A260/A280在1.5～2.2之間，說明基因組DNA提取成功，可以用于下一步PCR-CTPP擴增實驗。

圖1 DNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1The agarose gel electrophoresis of DNA samples

2.2 PCR-CTPP法對p73基因分型鑒定

圖2為PCR-CTPP擴增產(chǎn)物的電泳圖。如圖所示，p73基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，與DNA Marker條帶相比較，各泳道中均有清晰的亮帶，圖中可見3種DNA片段，其中擴增出428, 270和193 bp三個條帶的為GC/AT型；428, 193 bp兩個條帶的為GC/GC型；428, 270 bp 兩個條帶的為AT/AT型。

圖2 p73 PCR-CTPP電泳結(jié)果Fig. 2The electrophoresis of p73 gene by PCR-CTPP

2.3 直接測序驗證

針對上述p73基因分型3種結(jié)果，選取樣品S1， S2，S3送至上海生工生物工程公司測序部直接測序，結(jié)果如圖3所示。在230和240 bp兩處（如圖方框標(biāo)注），樣品S1檢測到單一的G峰和C峰，顯示其為GC/ GC基因型；樣品S2在230 bp處同時檢測到G峰和A峰，在240 bp處同時檢測到C峰和T峰，顯示其為GC/AT基因型；而樣品S3檢測到單一的A峰和T峰，表明其為AT/AT基因型。測序結(jié)果可表明DNA直接測序法與PCR-CTPP法基因分型結(jié)果完全一致。

圖3 p73基因 PCR產(chǎn)物測序圖Fig.3The sequencing pattern of p73 gene PCR product

2.4 統(tǒng)計分析

2.4.1 研究對象的基本資料分析

本文中100例病例組和120例對照組的統(tǒng)計學(xué)特征見表2。表中數(shù)據(jù)顯示年齡和性別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.824，x2=0.049；P=0.225，x2=1.471），喝酒因子在病例組和對照組中也無顯著差異性（P=0.596，x2=0.281）。但是吸煙人群中病例組明顯高于對照組，兩者有顯著性差異（P=0.000，x2=15.450）。表明吸煙顯著增加了肺癌的患病風(fēng)險，是湖南地區(qū)研究人群的肺癌危險因子。

表2 肺癌病例組和正常對照組的一般性狀分析Table 2General character analysis of lung cancer cases and controls

2.4.2 p73基因多態(tài)性與肺癌風(fēng)險的相關(guān)性分析

病例組和對照組中p73基因型和等位基因分布頻率見表3。結(jié)果表明，100例肺癌患者GC/GC基因型為60%，GC/AT基因型為36%，AT/AT基因型為4%，而120例對照組中GC/GC, GC/AT和AT/AT基因型頻率分別為52%, 37%和12%，2組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.032, x2=4.594）。多因素Logistic回歸分析顯示，與攜帶p73 GC/GC基因型者比較，攜帶AT/ AT基因型者的肺癌患病風(fēng)險增加3.4倍（OR=3.387，95%CI=1.055～10.875，P=0.032），而攜帶GC/AT基因型者肺癌風(fēng)險也呈增加趨勢，但是無顯著性差異（OR=1.183，95%CI=0.672～2.082，P=0.561），攜帶p73 AT單倍型基因型者的肺癌患病風(fēng)險比GC單倍型基因型者增加1.6倍（OR=1.519，95%CI=0.985～2.345，P=0.058）。

表3 p73基因型和等位基因的分布與肺癌風(fēng)險的相關(guān)性Table 3The correlation of p73 Genotype and allele frequencies with the risk of lung cancer

3 結(jié)論

本研究的測序結(jié)果顯示PCR-CTPP技術(shù)得到的基因分型結(jié)果和DNA直接測序得到的基因分型結(jié)果完全一致，說明PCR-CTPP是一種非常省時且操作簡單的SNP等位基因分型方法，具有較高的應(yīng)用價值。

統(tǒng)計結(jié)果表明，病例組和對照組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.032, x2=4.594）。分析顯示與攜帶p73 GC/GC基因型者比較，攜帶AT/AT基因型者的肺癌患病風(fēng)險增加3.4倍，而攜帶GC/AT基因型者肺癌風(fēng)險也呈增加趨勢，但是無顯著性差異。攜帶p73 AT單倍型基因型者的肺癌患病風(fēng)險比GC單倍型基因型者增加1.6倍。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)p73基因多態(tài)性可能與湖南地區(qū)人群非小細胞肺癌遺傳易感性有關(guān)，因其樣本量不太多，還不能證實這一相關(guān)性，后期試驗需擴大樣本量，p73基因在非小細胞肺癌中發(fā)生發(fā)展中的具體作用也需進一步研究。

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（責(zé)任編輯：申劍）

p73 Gene Polymorphism and Genetic Susceptibility to Non-Small Lung Cancer

Wang Shuangshuang，Dong Linli，Tang Jianxin，Li Wen
（Key Laboratory of Green Packaging and Biological Nanotechnology Application，Hunan University of Technology，Zhuzhou Hunan 412007，China）

Used PCR-CTPP to detect the p73 gene polymorphism among 100 patients with NSCLC and 120 healthy controls respectively and DNA direct sequencing verified the results of genotypes. Analyzed the association between p73 gene polymorphism and NSCLC, and explored the correlation between p73 gene polymorphism and susceptibility to NSCLC in the Hunan population. The experiment results showed that the results of PCR-CTPP and the sequencing genotyping results were consistent, p73 genotype distribution in 100 lung cancer patients are as follows: GC/GC 60 cases (60%), GC/AT 36 cases (36%), AT/AT 4 cases (4%). Compared with the carriers of GC/GC genotype, the carriers of AT/AT genotype significantly increased 3.4 times the risk of NSCLC (OR=3.387, 95%CI= 1.055～10.875, P=0.032), also the carriers of GC/AT genotype tended to increase the risk of NSCLC, but had no significantly difference (OR=1.183, 95%CI= 0.672～2.082, P=0.561). The p73 gene polymorphism may have the relation with the susceptibility to NSCLC in the Hunan population.

SCLC；p73 gene polymorphism；PCR-CTPP

Q75

A

1673-9833(2014)06-0013-04

10.3969/j.issn.1673-9833.2014.06.003

2014-08-17

國家自然科學(xué)基金資助項目（61171061），湖南省自然科學(xué)青年基金資助項目（12JJ4082，14JJ2049)，湖南工業(yè)大學(xué)自然科學(xué)研究基金資助項目（2013HZX04），湖南省教育廳科學(xué)研究基金資助項目（14B050）

王霜霜（1989-），女，湖南益陽人，湖南工業(yè)大學(xué)碩士生，主要研究方向為分子生物學(xué)，E-mail：997747598@qq.com

李文（1980-），男，湖南望城人，湖南工業(yè)大學(xué)講師，博士，主要從事生物醫(yī)學(xué)工程方面的教學(xué)與研究，E-mail：liwendream@sohu.com