秦曉紅

【摘要】目的總結生物測定分子遺傳標記技術在中藥材鑒定領域的應用。方法查閱、歸納、整理近年來國內外有關中藥生物測定的研究文獻。結果DNA分子遺傳標記技術具有微量、快速、特異性強、準確可靠、對樣本要求較低的特點。結論DNA分子鑒定對中藥種類與資源等方面的研究起到重要作用。

【關鍵詞】DNA分子遺傳標記；PCR；RAPD

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2014.01.574文章編號：1004-7484（2014）-01-0472-01

中藥治療疾病在中國已有幾千年歷史，特別是治療慢性、消耗性疾病具有獨特的、西藥不可替代的作用。中藥品種繁多，同一種中藥，由于物種及產地的不同，其質量差異較大，而質量（品質）與中醫(yī)臨床療效密切相關。因此，為了保證臨床用藥的安全及質量和療效的穩(wěn)定，準確、迅速、簡捷的中藥鑒定方法的建立已成為當務之急。中藥鑒別所依據的遺傳標記主要有形態(tài)標記、生化標記（包括免疫學標記）、組織細胞標記。這些標記都是基因表達的產物，易受生理狀態(tài)、生長環(huán)境、貯藏加工、生長期、品種等的影響，且標記數目有限，急需新的遺傳標記技術。自從Bostein和White等于1980年利用RFLP作為遺傳標記，開創(chuàng)了直接應用DNA多態(tài)性發(fā)展遺傳標記的新階段。近年來，隨著分子生物學技術的進步，DNA分子標記的新技術不斷涌現，DNA分子標記技術在中藥的應用報道逐漸增多。由于DNA分子標記技術具有快速、微量、特異性強、準確可靠等特點，且不受生育階段、供試部位、環(huán)境條件、貯藏等因素的影響，在中藥研究中展示了廣闊的應用前景。

1DNA遺傳標記的應用范圍

1.1鑒定植物種類隨著分子生物學技術的發(fā)展，DNA分子遺傳標記技術已廣泛應用于植物品種的整理研究。我國南方部分省區(qū)有多種菊科不同屬的植物如地膽草、一點紅、苦荬菜、毛大子草、山萵苣、苦苣菜以“土公英”混作蒲公英使用。曹暉等[1]利用Ap-PCR和RAPD分子標記技術對蒲公英及六種土公英混淆品進行了DNA指紋鑒別研究，結果顯示它們的DNA指紋圖譜存在明顯差異，利用這種差異可以從分子水平上鑒別蒲公英及其混淆品此外，淫洋藿屬八種植物、云南八種木藍屬植物、山冬麥屬四種植物等用RAPD技術也得到了準確地鑒定。

1.2鑒定藥材道地性道地藥材的優(yōu)良品質是道地藥材基因型與特定的環(huán)境條件長期作用的結果，特定的基因產生特定的酶，進而調控次生代謝產物等有效成分的產生，因而特定的基因是藥材道地性形成的關鍵。由于道地藥材與非道地藥材來源于相同或相近的物種種類，在形態(tài)、生藥性狀及化學成分等特征上也常表現出高度的相似性，因而采用傳統(tǒng)的方法進行道地藥材的鑒別是十分困難的，具有很大的主觀性。隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，作為現代分子生物學技術重要手段的RAPD技術的應用，使從分子水平進行道地藥材的快速、準確鑒定成為可能。近年來應用RAPD技術進行道地藥材的鑒定已取得了一些有價值的研究成果，例如枸杞、姜黃、溪黃草、當歸、金銀花等藥用植物道地性的研究。枸杞主產于寧夏、甘肅、青海、內蒙等地，以寧夏產為最佳道地藥材。李軍等[2]比較了來自寧夏和內蒙兩地的枸杞的RAPD指紋，結果表明，RAPD方法可以很好地鑒定不同來源的枸杞材料。王朝暉[3]等研究了4個來源的穿心蓮RAPD圖譜。結果各穿心蓮RAPD圖譜之間可見差異條帶，表明不同產地的穿心蓮基因確已發(fā)生了微小的變異，這種變異可能是導致不同產地穿心蓮質量差異的基礎之一。

2DNA遺傳標記的類別

根據目的基因所在細胞器的不同可分為核DNA標記、線粒體DNA標記和葉綠體DNA標記。線粒體DNA標記主要用于動物的起源進化、親緣關系、遺傳變異、物種鑒別等研究；核DNA和葉綠體DNA分子標記主要存在于高等植物中，尤以核DNA分子標記的應用最多。

DNA分子標記是近年來隨著核酸分子技術的發(fā)展而研發(fā)的，在基因定位、品種鑒定、遺傳圖譜構建等方面得到了廣泛的應用。根據DNA分子標記所采用的核心技術大體上可分為兩大類。一是以PCR為基礎的DNA分子標記技術，另一類是以分子雜交（southern雜交）為基礎的DNA分子標記技術。

基于PCR技術的DNA分子標記鑒別的研究方法依據分析對象可分為兩類：其一是采用檢測基因組DNA的多態(tài)，如隨機擴增多態(tài)性DNA、AP-PCR、擴增內切酶片斷多態(tài)性等方法，又稱為PCR-DNA指紋法；其二是檢測特定片斷DNA的多態(tài)，即以特定的基因（或短片斷的DNA）為研究對象，如PCR產物的限制性片斷長度多態(tài)性、等位基因特異PCR、DNA直接測序等方法。

3對PCR的影響因素

3.1植物核DNA的提取目前多采用CTAB法。CTAB是一種去污劑。它能跟核酸形成復合物，這些復合物在高鹽溶液（0.7mol/lNacl）中可溶并且穩(wěn)定存在，但如果降低鹽的濃度（0.3mol/INacl），CTAB與核酸的復合物就會因溶解度降低而沉淀出來，但大部分蛋白及多糖仍溶于液中。

3.2模板純度各濃度等對PCR的影響王培訓等[4]以各地產西洋參為研究對象，對影響中藥材隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）的若干問題進行了探討。研究發(fā)現，中藥材DNA模板的降解程度、純度、濃度，酶的濃度，M92+濃度以及循環(huán)參數等諸多因素皆會不同程度的影響擴增結果，同時推薦一個較為適用的循環(huán)參數。模板純度對PCR的影響：分子生物學的各類研究，通常需獲得高純度的DNA，然而在中藥飄揚的RAPD研究中，當模板中含有一定量的雜質時，并不影響擴增結果。模板濃度對PCR的影響：對PCR有一定影響，但在一定范圍內其擴增結果基本相同。反應介質：BSA能影響PCR擴增結果，不加BSA雖能進行的增，但其條帶數少于加少BSA的反應。BSA濃度在0.5-2.0g/l其條帶基本一致。此外根據經驗，中藥材的RAPD擴增Tap酶通常須1.5U/25uL以上方能進行較好擴增，這可能與各廠家Tap酶活性和我們提取的模板中帶有某些抑制成分有關。Mg2+、dNTP對擴增結果影響不大，主要是對弱帶的影響。

3.3引物的篩選問題商品中藥材基因組DNA降解程度差別較大，但合適的引物可得到基本一致的DNA指紋圖譜。通常RAPD的產物在200.3000bp形成指紋圖，但能使中藥材擴增出200.1500bp條帶的引物較為合適，因為在此范圍內，不同時間樣品易出現相同條帶即重現性好。

3.4擴增條件在其他參數條件相同時，樣品DNA降解相對較為重的模板，在用某些引物擴增時，反應循環(huán)數要適應增加，才能得到有效擴增。

3.5污染由于PCR的強大功能與檢測的靈敏性，極微量的污染便可導致假陽性結果。故每次PCR反應一定要設立陰性對照孔，檢測污染情況。

4小結與展望

中藥走向世界，質量保證是一個重要的方面。DNA分子遺傳標記技術在中藥鑒定及其相關研究方面具有獨到的優(yōu)勢和廣闊的應用前景，但目前尚處于探索階段。各種DNA分子遺傳技術存在一定的局限性，有待進一步規(guī)范和完善。利用DNA分子遺傳標記技術，開發(fā)有關藥用動物遺傳背景與化學成分相關性的研究，實現中藥品種——質量標準化、基因工程生產天然活性成分尋找和擴大新藥源；開發(fā)中藥重要性狀包括品質、產量和抗性的分子標記，實現中藥材分子育種及品質人工調控，將是中藥分子鑒定學的挑戰(zhàn)又是現實意義的大課題。

參考文獻

[1]曹暉，畢培曦，邵鵬柱.香港市售蒲公英及其混淆品蒲公英的DNA指紋鑒別研究[J].中國中藥雜志，1997，22（4）：197.

[2]李軍，郭晏海，秦雪梅.DNA隨機擴增多態(tài)性分析技術在枸杞道地藥材鑒定中的應用[J].中醫(yī)藥研究，2002，18（3）：48-49.

[3]王朝暉，李勁平，王培訓.不同產地穿心蓮藥材的RAPD鑒別初步研究[J].中醫(yī)藥導報，2006，12（5）：4-5，8.

[4]王培訓，黃豐，等.商品西洋參DNA指紋圖譜鑒別[J].中藥新藥與臨床藥理，1999，10（6）：367.