陳申秒等

摘 要：對(duì)東營(yíng)地區(qū)規(guī)?；怆u養(yǎng)殖場(chǎng)近兩年送檢的病死雞進(jìn)行分子檢測(cè)，確定NDV和IBV的發(fā)生率很高，針對(duì)具有典型特征的NDV和IBV分離株分別進(jìn)行了F基因和S1基因的測(cè)定和分析，確定為腎型傳支和基因7型新城疫，通過與流行毒株和疫苗毒株的分析為以后該地區(qū)的防疫提供幫助。

關(guān)鍵字：NDV；IBV；進(jìn)化分析

2012年初至2013年7月，本單位收到東營(yíng)多個(gè)規(guī)模化肉雞場(chǎng)送檢的病死肉雞近1000例，經(jīng)剖檢、分子生物學(xué)檢測(cè)﹑分離鑒定及測(cè)序分析，確診為腎性傳支IBV和基因7型NDV病毒的流行。將具有代表性的IBV分離株命名為DY717-IBV；NDV分離株命名為DY717-NDV，從分子學(xué)上對(duì)其進(jìn)行了遺傳分析，希望為該地區(qū)傳染性支氣管炎和雞新城疫的防治提供幫助。

1 剖檢病變

腎臟腫大，尿酸鹽大量沉積，“花斑腎”十分典型，沿腎臟出現(xiàn)明顯的尿酸鹽沉積線，干酪物，氣管出血和支氣管出血（圖1、2、3）。

2 分子生物學(xué)檢測(cè)診斷

3 分離毒株DY717-IBV、DY717-NDV測(cè)序分析結(jié)果

將分離得到的DY717-IBV、DY717-NDV經(jīng)分子生物學(xué)方法分別對(duì)IBV的S基因進(jìn)行基因克隆，送至北京華大基因測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，將獲得的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了比對(duì)分析。

3.1 DY717-IBV的S基因分析

DY717-IBV與本實(shí)驗(yàn)室自行分離的IBV野毒株及保存的相關(guān)疫苗毒株，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增其S1基因，測(cè)序后與傳統(tǒng)的經(jīng)典毒株共同進(jìn)行基因和推導(dǎo)的氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，其中H120，IBV-H52株，W491株，W93株均為疫苗毒株；LC株，IBX株，SC0901株（四川），zhejianghuzhou8株（浙江），Taiwan株（臺(tái)灣），SD10株，RZ株（日照）CAL99-07株，LNX株均為近些年國(guó)內(nèi)流行毒株。DY717-IBV為東營(yíng)分離株；以上毒株的S1基因序列均被本實(shí)驗(yàn)室送往北京華大基因測(cè)序結(jié)果。

由圖5可知，DY717-IBV分離株與H120株，CH-LNX株，RZ株，浙江株，四川株等國(guó)內(nèi)毒株的核苷酸序列同源性較高，都在96%～98.6%之間。江蘇分離株與M41株的同源性為77.8%，與491株的同源性為78.4%。

由圖6可知，S基因的裂解氨基酸序列分別為HRRRR、RRFRR、RRLRR；根據(jù)S1基因的序列和分子遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)：HRRRR是中國(guó)IBV腎型毒株近年新出現(xiàn)的裂解位點(diǎn)。疫苗株M1與491株，CAL99株，臺(tái)灣株的裂解位點(diǎn)為RRF/LRR；H120株，LNX株，SD10株，浙江株的裂解位點(diǎn)均為HRRRR。東營(yíng)肉雞DY717-IBV分離株的裂解位點(diǎn)同樣也為HRRRR，DY717-IBV分離株為典型的腎型毒株。

3.2 DY717-NDV的測(cè)序分析結(jié)果

新城疫是由雞副黏病毒引起的一種急性，高度接觸性傳染和致死性的傳染病，是嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的重要疫病之一。新城疫病毒囊膜上的融合蛋白基因（F基因）是決定毒力和免疫應(yīng)答的主要因素，F(xiàn)基因裂解位點(diǎn)區(qū)的氨基酸組成是NDV致病力的分子基礎(chǔ)。NDV強(qiáng)毒株裂解區(qū)域氨基酸序列為112R-R-Q-K/R-R-F117，弱毒株的裂解區(qū)域氨基酸序列組成為112G-K/R-Q-G-R-L117。

基因2型參考毒株：LaSota，Clone 30，HB92 V4，XD-Shandong08均來(lái)自Genbank中已經(jīng)證實(shí)的基因2型NDV弱毒株；基因7型參考毒株：SD09，SDWF02，SG-Liaoning2009，TianJin08均來(lái)自Genbank中已經(jīng)證實(shí)的基因7型NDV強(qiáng)毒株；東營(yíng)肉雞分離株：DY717-NDV。

圖7中，DY717-NDV與基因7型NDV強(qiáng)毒參考毒株的同源性在96.2%～99.8%之間，同源性較高。DY717-NDV分離株與LaSota，Clone 30，HB92 V4，XD-Shandong08等基因2型NDV弱毒參考毒株的核苷酸同源性在82.1%～82.7%之間，同源性相對(duì)較低。DY717毒株與LaSota，Clone 30等的疫苗毒株的同源性分別為82.5%和82.7%，也預(yù)示著二者與DY717毒株具有一定程度的交叉保護(hù)，免疫LaSota和Clone 30的雞群不能夠完全抵御DY717毒株的攻擊。

由圖8可知，分離株DY717-NDV和基因7型NDV強(qiáng)毒參考毒株SD09，SDWF02，SG-Liaoning2009，TianJin08等全部位于一個(gè)較大的共同的分支之上（圖8內(nèi)上方黑框位置），這表明DY717-NDV為基因7型的毒株，毒力相對(duì)較強(qiáng)。

LaSota，Clone 30，HB92 V4，TYQ-Shanxi07，XD-

Shandong08等基因2型NDV弱毒參考毒株共同處于一個(gè)進(jìn)化分支之上（圖8內(nèi)下方黑框位置），與DY717-NDV以及基因7型NDV強(qiáng)毒參考毒株有著明顯的區(qū)別和界限。

由圖9可知，綜上所述，DY717-NDV與分離株SD09，SDWF02，SG-Liaoning2009，TianJin08均為基因7型NDV強(qiáng)毒毒株。這也表明當(dāng)前ND的流行仍以基因7型為主。對(duì)不同基因型的NDV毒株進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，不同基因型之間，其核苷酸同源性較低，這也表明我國(guó)當(dāng)前許多雞群的免疫效果不佳或僅能部分保護(hù)，與NDV的基因7型流行有關(guān)。

4 小結(jié)

通過對(duì)IBV東營(yíng)分離株S基因的分析，該地區(qū)分離株與國(guó)內(nèi)毒株的核苷酸序列同源性較高，與M41株、491株的同源性相對(duì)較低；其S基因的裂解氨基酸序列為近年來(lái)新出現(xiàn)的腎型毒株的裂解位點(diǎn)，流行于該地區(qū)的毒株多為腎型傳支，且與部分疫苗毒株的同源性較低，正確篩選疫苗毒株具有很重要的臨床意義。

分離株DY717-NDV和基因7型NDV強(qiáng)毒參考毒株全部位于一個(gè)較大的共同的分支之上，確定DY717-NDV為基因7型的毒株，且毒力相對(duì)較強(qiáng)。對(duì)不同基因型的NDV毒株進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，不同基因型之間，其核苷酸同源性較低，這也表明我國(guó)當(dāng)前許多雞群的免疫效果不佳或僅能部分保護(hù)，可見基因7型新城疫在雞群特別是肉雞群規(guī)?；B(yǎng)殖中的危害較大，對(duì)此類毒株開展深層次的研究乃至疫苗的研發(fā)亟待進(jìn)行。（編輯：郭遠(yuǎn)）