宋健 邱雨 蘇迎春

[摘 要] 卵清蛋白是在鳥類卵清中大量存在的一種功能未知的蛋白。令人驚訝的是，卵清蛋白屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑（serpin）家族，盡管它缺乏任何的抑制活性。卵清蛋白是鳥類卵清中最主要的蛋白，也是最早分離提純的蛋白之一。由于它具有可迅速大量制備的性質(zhì)，因此，在蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)研究以及過敏實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械玫綇V泛的應(yīng)用。卵清蛋白在雞輸卵管中的合成以及它受到類固醇激素的調(diào)節(jié)，為蛋白合成與分泌研究提供了一個(gè)模型。

[關(guān)鍵詞] 卵清蛋白 絲氨酸蛋白酶 活性 免疫學(xué)機(jī)制

[中圖分類號] Q5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號] 1003-1650 （2014）07-0234-01

一、絲氨酸蛋白酶抑制劑

絲氨酸蛋白酶抑制劑是一個(gè)含有300個(gè)以上同源蛋白的家族；它們在除了原核生物以外的動(dòng)物、植物、昆蟲以及病毒中都有發(fā)現(xiàn)。它們包括人血漿中控制酶的凝固、溶血纖蛋白、補(bǔ)體以及激肽級聯(lián)的主要的絲氨酸蛋白酶抑制劑，以及激素結(jié)合球蛋白、血管緊張肽原和卵清蛋白等不具有任何抑制活性的蛋白。

作為蛋白酶抑制劑，serpins的功能活性依賴于它們獨(dú)有的一個(gè)能力，即與進(jìn)攻的蛋白酶作用時(shí)發(fā)生戲劇性的構(gòu)像轉(zhuǎn)變。天然serpin （圖1.1 a）具有一個(gè)極為柔軟的肽環(huán)，即反應(yīng)中心環(huán)，它具有反應(yīng)中心，能很好的模仿蛋白酶水解的底物。應(yīng)用Schechter和Berger命名法，將被蛋白酶攻擊的中心肽鍵表示為P1-P1'，P1是切點(diǎn)的N端，P1'是C端。與大多數(shù)蛋白質(zhì)不同的是，天然serpin的折疊并不是熱力學(xué)支持的構(gòu)像，而是一個(gè)亞穩(wěn)態(tài)的折疊中間體。它與靶蛋白酶作用時(shí)釋放結(jié)構(gòu)張力導(dǎo)致反應(yīng)中心環(huán)作為中間鏈插入中心-折疊（圖1.1 b）。環(huán)插入形式的穩(wěn)定性是天然構(gòu)像體的兩倍。近來有報(bào)導(dǎo)表明反應(yīng)中心環(huán)完全插入到-折疊中，是使蛋白酶失活所必需的。構(gòu)像轉(zhuǎn)變釋放的能量被用來動(dòng)搖和扭曲始終通過酯鍵在P1位與serpin結(jié)合的蛋白酶。Serpins產(chǎn)生構(gòu)像轉(zhuǎn)變的能力允許對它們的活性進(jìn)行嚴(yán)格的調(diào)控，并且提供了清除serpin-蛋白酶復(fù)合物的機(jī)制。然而，抑制性機(jī)制對這種復(fù)雜的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的依賴性導(dǎo)致serpins對于以下突變異常敏感：即阻礙環(huán)插入或是在蛋白水解攻擊時(shí)導(dǎo)致環(huán)插入（未成熟環(huán)插入）而導(dǎo)致功能喪失。未成熟環(huán)插入可能發(fā)生在分子內(nèi)（分子內(nèi)環(huán)插入）或兩個(gè)分子之間（分子間環(huán)插入）。導(dǎo)致serpin聚合的分子間環(huán)插入與多種疾病狀態(tài)有關(guān)，例如肝病和癡呆等。

抑制性serpins的這種復(fù)雜的控制機(jī)制顯示了這個(gè)家族在高等生物體中作為主要的蛋白酶抑制劑進(jìn)化的成功。但是沒有抑制抑制功能的serpins又怎么樣呢？許多非抑制性serpins具有簡單的任務(wù)：激素結(jié)合球蛋白在循環(huán)中作為配體；血管緊張肽原唯一已知的功能是它的氨基端被腎素切割后會(huì)釋放一個(gè)短肽，在血壓控制中起作用。但是，卵清蛋白的功能至今未知。這是很有意思的。試想為什么這樣一個(gè)大而復(fù)雜的分子作為serpin卻只被賦予如此明顯簡單的任務(wù)？這吸引我們推測serpin結(jié)構(gòu)可能具有未知的調(diào)整功能。

在公認(rèn)的非抑制性serpin中，可以通過與典型的抑制性serpin序列比較來確定反應(yīng)中心。在卵清蛋白中，反應(yīng)中心是殘基353-354位的Ala-Ser，同時(shí)也是通過序列預(yù)測的胰肽酶E的唯一切點(diǎn)。有趣的是，一些非抑制性serpins明顯的保留了典型抑制性家族成員的反應(yīng)中心環(huán)的可塑性。激素結(jié)合球蛋白，皮質(zhì)類固醇激素結(jié)合球蛋白及甲狀腺素結(jié)合球蛋白被活性噬中性粒細(xì)胞釋放的酶在其公認(rèn)的反應(yīng)中心處切割時(shí)，會(huì)產(chǎn)生特有的serpin構(gòu)像轉(zhuǎn)變。在皮質(zhì)類固醇激素結(jié)合球蛋白中，構(gòu)像的轉(zhuǎn)變伴隨著激素結(jié)合親和性的降低，這可能是發(fā)炎位點(diǎn)皮質(zhì)醇釋放的一個(gè)生理機(jī)制。其它非抑制性serpin，包括血管緊張肽原和卵清蛋白，沒有表現(xiàn)出在假定反應(yīng)中心切割會(huì)產(chǎn)生大的構(gòu)像轉(zhuǎn)變現(xiàn)象，這表示它們已經(jīng)喪失了它們抑制性祖先的極端可塑性。

二、卵清蛋白的應(yīng)用研究

目前國內(nèi)外對于卵清蛋白的性質(zhì)研究不多，多用于致敏實(shí)驗(yàn)。如研究速發(fā)型哮喘及晚發(fā)型哮喘與細(xì)胞因子關(guān)系，了解不同的細(xì)胞因子對不同類型哮喘的調(diào)節(jié)作用，探討其免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制，以卵清蛋白致敏，激發(fā)建立小鼠哮喘模型。用BN 大鼠模型探討不同蛋白的過敏性，通過腹腔注射或口服給予BN 大鼠卵清蛋白（OVA） 或牛血清白蛋白（BSA）， 時(shí)間為6周在不同時(shí)間取血清，進(jìn)行被動(dòng)皮膚致敏試驗(yàn)（PCA）；分離血漿進(jìn)行組胺測定；此外，對OVA 組和對照組的大鼠進(jìn)行血壓測定。結(jié)果：PCA試驗(yàn)結(jié)果表明OVA 特異性IgE抗體滴度較高（1P32～1P128） ，而BSA特異性IgE抗體滴度較低（1P2～1P4）。與對照組相比，腹腔注射或口服OVA均使組胺水平升高?？诜﨩VA對大多數(shù)大鼠的血壓沒有明顯的影響。還有觀察口服卵清蛋白（OVA） 和滋養(yǎng)細(xì)胞膜抗原（TMA） 誘導(dǎo)小鼠妊娠免疫耐受效果的研究， 經(jīng)口服途徑給自然流產(chǎn)小鼠模型以適當(dāng)劑量的抗原OVA 和TMA2 后，能有效誘導(dǎo)小鼠妊娠免疫耐受形成，降低小鼠的胚胎丟失率。國外近年來對卵清蛋白性質(zhì)和功能的研究很少。

三、本研究的目的和意義

盡管卵清蛋白占卵清中總蛋白的60-65%，它的功能卻仍然未知。盡管卵清蛋白的序列與抗胰蛋白酶和其它serpin家族的功能型抑制劑具有30%同源性，它卻沒有表現(xiàn)出任何的蛋白酶抑制劑活性。它的公認(rèn)反應(yīng)中心環(huán)的Ala-Ser鍵表現(xiàn)出對彈性蛋白酶的特異性，但是它僅僅是作為底物而不是抑制劑。

近來，卵清蛋白已成為研究影響蛋白變性、重折疊的因子的理想模型。其間，對非抑制性卵清蛋白向抑制性卵清蛋白轉(zhuǎn)變的研究可能對serpins的結(jié)構(gòu)與功能間的關(guān)系提供重要證據(jù)。將卵清蛋白引入酵母中表達(dá)可以提高宿主的營養(yǎng)價(jià)值。以前關(guān)于將卵清蛋白引入真菌的嘗試有引入釀酒酵母。

卵清蛋白在卵中含量如此之高，不可能僅僅是作為孵化的營養(yǎng)物質(zhì)。關(guān)于它的不為人知的潛在功能，需要我們進(jìn)一步的研究。另外，卵清蛋白屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族，卻不具有抑制活性的原因，尚需要更深入的探討。

由于卵清中蛋白種類較多，不易純化。而畢赤酵母能夠高效表達(dá)外源蛋白，且分泌的內(nèi)源蛋白種類很少，背景蛋白影響小，易于純化和大量制備卵清蛋白高純度樣品，為揭示卵清蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。