盧乃會 嚴玉寧 何紅 黃勤知

摘 要 以熒光顯微計數(shù)法和平板分離法分別對桐花樹根莖葉內(nèi)生細菌總量和可培養(yǎng)細菌數(shù)量進行周年動態(tài)初步測定，并對拮抗植物病原菌的可培養(yǎng)細菌菌株進行篩選鑒定。結(jié)果表明：桐花樹根莖葉內(nèi)均含有大量的內(nèi)生細菌，其中根部內(nèi)生細菌總量為0.88×107～49.67×107 ind./g FW，7月份最大，葉部細菌總量為1.07×107～65.07×107 ind./g FW，也以7月份最大，莖部細菌總量為1.1×107～19.73×107 ind./g FW，以5月份最大；而根莖葉可培養(yǎng)細菌含量分別為1.02×103～13.18×103、0.13×103～11.24×103、0.31×103～10.36×103 CFU/g FW，均以3月份數(shù)量最大，周年不同月份之間細菌總量和可培養(yǎng)細菌數(shù)量均差異顯著。用平板對峙生長法，從86株可培養(yǎng)內(nèi)生細菌中篩選獲得1株對香蕉葉鞘腐敗病菌、香蕉枯萎病菌、馬拉巴栗莖腐病等植物病原菌均有較強拮抗作用的Aec23菌株，經(jīng)形態(tài)、生理生化測試及16S rDNA序列比較分析，Aec23菌株初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

關(guān)鍵詞 桐花樹；內(nèi)生細菌；時空動態(tài)；植物病原菌；拮抗細菌

中圖分類號 S476 文獻標(biāo)識碼 A

紅樹林由于生長于海岸潮間帶的特殊生境，導(dǎo)致其共附（內(nèi)）生微生物類群的復(fù)雜性和獨特性[1-3]，因此有關(guān)紅樹林微生物的研究近年來已越來越多，成為研究的熱點之一。國內(nèi)外學(xué)者Ravikumar[4]、Hong[5]等分別對紅樹林放線菌種群多樣性和相關(guān)活性物質(zhì)進行了研究報道，鄧祖軍[6]、Peng[7]等對紅樹內(nèi)生真菌種群多樣性及其活性物質(zhì)進行了研究，并從中獲得功能特殊、結(jié)構(gòu)新穎的抗菌活性物質(zhì)。但有關(guān)紅樹內(nèi)生細菌周年數(shù)量時空動態(tài)變化，目前尚未見報道。本實驗室近年來對紅樹內(nèi)生細菌及其在生防植物病害中的作用開展了一系列研究，不僅獲得了多株對不同植物病原具有良好防病效果的內(nèi)生細菌菌株及其抗菌活性物質(zhì)，同時也證明了紅樹內(nèi)生細菌是植物病害生物防治不可多得的資源菌來源。為此，筆者以廣東湛江灣分布廣、面積大的桐花樹為研究對象，在調(diào)查其內(nèi)生細菌周年時空變化動態(tài)的同時，以香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp. cubense）、香蕉葉鞘腐敗病菌（Pantoea agglomerans）、馬拉巴栗莖腐病菌（Phytophthora palmivora）和芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）等為供試病原菌，從桐花樹可培養(yǎng)內(nèi)生細菌中篩選對植物病原真菌、細菌和卵菌均有拮抗作用的菌株，并對其進行了鑒定。為紅樹內(nèi)生細菌資源調(diào)查研究以及廣譜型植物病害生防菌株的篩選利用等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物 紅樹植物桐花樹（Aegiceras corniculatum），于2010年1～11月（奇數(shù)月份）采自廣東湛江紅樹林自然保護區(qū)（21°20′N～21°25′N，109°50′E～109°53′E），編號封存帶回實驗室進行內(nèi)生細菌分離。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 海水NA培養(yǎng)基用于內(nèi)生細菌平板計數(shù)測定（蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏5.0 g，瓊脂20.0 g，過濾海水1 000 mL，pH7.2～7.4）；LB培養(yǎng)基用于拮抗菌株基因組DNA的提?。ㄒ鹊鞍纂?0.0 g，酵母浸出粉5.0 g，氯化鈉10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.2～7.4）；PDA培養(yǎng)基用于菌株拮抗效果測定（馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂20.0 g）；NB培養(yǎng)基用于菌株發(fā)酵（蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.2～7.4）。

1.1.3 供試病原菌菌株 香蕉葉鞘腐敗病原菌（Pantoea agglomerans）[8]；芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）；香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp. cubense）；馬拉巴栗疫霉病菌（Phytophthora palmivora）[9]，均為本實驗室分離鑒定和保存。

1.2 方法

1.2.1 桐花樹可培養(yǎng)內(nèi)生細菌數(shù)量測定 樣品用自來水沖洗干凈，晾干后分別稱取根、莖、成熟葉片各5.0 g，75%酒精表面消毒30 s后，再用0.1%升汞表面消毒（對應(yīng)40 s、1 min、2 min），用無菌海水沖洗3次，陰干后加20 mL無菌海水于滅菌研缽中剪碎研磨，浸泡15 min后，吸取樣品浸泡液100 μL涂布于海水NA培養(yǎng)基平板上，25 ℃黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4～7 d后觀察計數(shù)，每樣品3次重復(fù)。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等挑取單菌落，純化保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 桐花樹內(nèi)生細菌總數(shù)測定 參考趙海萍[10]等海洋細菌熒光顯微計數(shù)法（略有改進）：取1.2.1中浸泡液，加入40%甲醛溶液（終濃度1%）固定，吸取100 μL固定液至帶有黑色微孔濾膜的抽濾裝置管中，并滴加1～2滴吖啶橙（終濃度為0.1%）染色3 min，真空抽濾。將濾膜置于載玻片上，Olympus BH22熒光顯微鏡下100倍觀察，計算樣品內(nèi)生細菌總數(shù)。計算公式為：E=（×S1×V0）/（m×S2×V1）。其中：E：樣品中的細菌含量（個/g）；：計數(shù)視野細菌數(shù)量的平均值（個）；S1：濾膜面積（mm2）；S2：顯微鏡的視野面積（mm2）；V0：浸泡樣液體積，即20 mL；V1：過濾樣液體積，即0.1 mL；m：植物樣品質(zhì)量g。

1.2.3 拮抗菌株的篩選 病原細菌拮抗菌株篩選參照陳振明[11]等的方法稍加改進：取NB、37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h的香蕉葉鞘腐敗病菌于NA培養(yǎng)基上制成含菌平板，然后接種1.2.1中活化的細菌菌株，于28 ℃下黑暗培養(yǎng)24～48 h，觀測其抑菌圈大小，每處理重復(fù)3次。

病原真菌拮抗菌株篩選采用對峙生長法，在PDA平板中央接種供試病原菌菌塊，離平板邊緣1.5 cm處對角線接種1.2.1中活化的細菌菌株，28 ℃下黑暗培養(yǎng)72～96 h，觀測其抑菌圈大小，每處理重復(fù)3次。

1.2.4 拮抗菌株形態(tài)學(xué)觀察和生理生化試驗 參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[12]和《植病研究方法》[13]進行。

1.2.5 菌株16S rDNA序列分析 取LB培養(yǎng)基，37 ℃、120 r/min恒溫振蕩箱中黑暗培養(yǎng)24 h的Aec23菌株，以CTAB法[14]提取細菌基因組DNA為模板，以27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1504R（5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）為上、下游引物擴增其16S rDNA序列。PCR體系為25 μL：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L） 2.0 μL，引物27F/1504R（10 μmol/L）2.0 μL，模板DNA（約50.0 mg/mL）1.0 μL，Taq酶0.2 μL，ddH2O補充至25 μL。PCR擴增條件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min、53 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min 40 s，30循環(huán)，72 ℃ 10 min。瓊脂糖凝膠電泳并回收目標(biāo)片段，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，測序結(jié)果用BLAST軟件在GenBank進行同源性比較，以Clustal X[15]進行多序列比對后，用MEGA 5.0的Neighbor-Joining法[16]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行1 000次Bootstraps檢驗。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析與處理方法 所測數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桐花樹內(nèi)生細菌總量及動態(tài)變化

用吖啶橙染色熒光顯微計數(shù)法測定桐花樹內(nèi)生細菌總量結(jié)果表明（表1），桐花樹根莖葉內(nèi)含有大量的內(nèi)生細菌，不同時間、不同部位其內(nèi)生細菌的數(shù)量有所不同。根部和葉部不同月份數(shù)量變化趨勢基本相同，內(nèi)生細菌總量分別為0.88×107～49.67×107、1.07×107～65.07×107 ind./g FW，均在7月份數(shù)量最大，其不同時間數(shù)量變化趨勢為7月>3月>5月>9月>11月>1月；莖部內(nèi)生細菌總量為1.1×107～19.73×107 ind./g FW，5月份達到最大值，各時期數(shù)量變化趨勢為5月>7月>11月>9月>3月>1月。葉部內(nèi)生細菌的數(shù)量顯著高于莖部和根部。

2.2 桐花樹可培養(yǎng)內(nèi)生細菌數(shù)量及動態(tài)變化

可培養(yǎng)內(nèi)生細菌測定結(jié)果表明（表2），桐花樹根莖葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細菌數(shù)量隨部位和時間變化不同。各部位可培養(yǎng)內(nèi)生細菌數(shù)量均在3月份數(shù)量達到最大值，根部和莖部可培養(yǎng)內(nèi)生細菌含量周年變化趨勢相似，分別為1.02×103～13.18×103、0.13×103～11.24×103 CFU/g FW，各時期變化動態(tài)為3月>11月>7月>5月>1月>9月；葉部可培養(yǎng)內(nèi)生細菌含量為0.31×103～10.36×103 CFU/g FW，其不同時間數(shù)量變化趨勢為3月>7月>9月>5月>11月>1月。通過比較發(fā)現(xiàn)，根部的可培養(yǎng)細菌含量較之莖部和葉部含量豐富。

2.3 植物病原拮抗菌株的篩選

本研究從桐花樹體內(nèi)共分離獲得86株可培養(yǎng)內(nèi)生細菌，以香蕉葉鞘腐敗病菌、芒果炭疽病菌、香蕉枯萎病菌及馬拉巴栗疫霉病菌等植物病原細菌、真菌和卵菌等為供試菌，平板對峙測定發(fā)現(xiàn)，以來自桐花樹根部Aec23菌株對上述供試病原菌的抑菌效果最強且穩(wěn)定（圖1），其抑菌圈直徑分別達（10.0±0.03）、（14.0±0.05）、（12.8±0.02）、（11.5±0.05）mm；進一步提取該菌株發(fā)酵上清液測定其抑菌圈直徑分別達（12.7±0.05）、（17.2±0.07）、（15.9±0.02）、（16.8±0.03）mm（圖2）。說明Aec23菌株對植物病原真菌、細菌和卵菌均有較強的拮抗作用。

2.4 拮抗菌株Aec23的鑒定

2.4.1 菌落形態(tài)特征觀察及生理生化測試結(jié)果 Aec23菌株在NA平板上菌落規(guī)則，圓形，邊緣加厚，乳白色，蠟質(zhì)。生物顯微鏡下觀察菌體呈桿狀，革蘭氏染色陽性。生理生化測定（表3）：該菌株為好氧菌，厭氧條件不生長；可以使明膠液化，能水解淀粉和還原硝酸鹽，不能分解纖維素，不產(chǎn)生H2S；在pH5.7的培養(yǎng)基中可以生長，具有耐鹽性，可以在7%的NaCl培養(yǎng)基中生長；生長溫度為15～40 ℃，最適生長溫度為25～30 ℃；接觸酶試驗呈陽性，氧化酶、色氨酸脫氨酶及苯丙氨酸脫氨酶試驗均呈陰性；不產(chǎn)生吲哚；葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；甲基紅試驗呈陰性，乙酰甲基甲醇試驗呈陽性；不利用丙二酸，檸檬酸鹽生長試驗為陽性（指示劑藍色）。

2.4.2 菌株分子生物學(xué)鑒定 生防菌株Aec23的16S rDNA測序片段大小為1 515 bp（GenBank登錄號為KF181458），用BLAST軟件進行同源性比較，通過與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)進行對比分析，菌株Aec23與解淀粉芽孢桿菌（登錄號：AY651023）同源性高達99.8%。以16S rDNA為基礎(chǔ)，利用MEGA 5.0軟件按Neighbor-Joining法構(gòu)建了包括解淀粉芽孢桿菌及同屬的臨近種細菌在內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。生防芽孢桿菌Aec23與解淀粉芽孢桿菌同處一支，遺傳進化距離最近。結(jié)合菌株的生化試驗及16S rDNA序列分析，生防芽孢桿菌Aec23初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

3 討論

目前，細菌計數(shù)方法主要有平板直接計數(shù)法、熒光顯微計數(shù)法和流式細胞儀計數(shù)法等。較只分離可培養(yǎng)細菌的平板直接計數(shù)法[17]和前處理較復(fù)雜的流式細胞儀計數(shù)法[18]，熒光顯微計數(shù)法由于簡捷、快速、方便、可靠，且樣品易于保存，能較好反映樣品中細菌的實際數(shù)量，現(xiàn)已在多個領(lǐng)域應(yīng)用[10]，但用于內(nèi)生細菌含量測定卻鮮見報道。本研究采用吖啶橙熒光染色計數(shù)法對桐花樹內(nèi)生細菌進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在顯微鏡下可觀察到大小、顏色和形狀各異的內(nèi)生細菌，說明該法用于植物內(nèi)生細菌含量測定是可行的，結(jié)果對植物內(nèi)生細菌的相關(guān)研究具有一定的參考價值。

關(guān)于紅樹林內(nèi)生菌的研究，目前以內(nèi)生真菌和放線菌報道較多，鄧祖軍等[19]對桐花樹內(nèi)生真菌類群進行了研究，發(fā)現(xiàn)不同部位、不同季節(jié)環(huán)境因素可直接影響內(nèi)生真菌的定居和分布；唐依莉[20]等的研究結(jié)果表明，紅樹內(nèi)生放線菌的定殖因宿主植物部位、年齡及季節(jié)和環(huán)境的變化明顯不同；相關(guān)性研究說明紅樹微生物數(shù)量動態(tài)變化受季節(jié)和分離部位的影響。本研究對桐花樹總內(nèi)生細菌和可培養(yǎng)內(nèi)生細菌數(shù)量測定結(jié)果表明，其細菌總量以5～7月份較高，而可培養(yǎng)細菌數(shù)最大值出現(xiàn)在3月份，說明桐花樹內(nèi)生細菌總量及可培養(yǎng)細菌數(shù)量均隨采樣時期不同而顯示出明顯的波動。本研究結(jié)果還表明，桐花樹內(nèi)生細菌總量與可培養(yǎng)細菌總量之間存在明顯差異，可培養(yǎng)細菌量僅占其總量的0.126‰ （0.005‰～0.768‰），說明桐花樹體內(nèi)存在有大量的不能培養(yǎng)或難培養(yǎng)的細菌類群，這與相關(guān)研究報道結(jié)果相似。關(guān)于桐花樹內(nèi)生細菌種群多樣性尚有待進一步研究。

近年來本實驗室利用紅樹內(nèi)生細菌生防植物病害進行了較為系統(tǒng)的研究，已從紅樹植物老鼠簕、木欖和紅海欖體內(nèi)分離獲得多株對香蕉枯萎病、芒果炭疽病、辣椒青枯病、辣椒疫病等植物病害具有較好防病作用的內(nèi)生細菌菌株[21-24]。本研究又從桐花樹中篩選獲得1株對香蕉葉鞘腐敗病菌等植物病原細菌和真菌均有明顯抑制效果的Aec23菌株，進一步說明紅樹植物內(nèi)生細菌是植物病害生物防治不可多得的資源[23]。有關(guān)Aec23菌株防病效果及防病機理等尚有待進一步研究。

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