孫策 趙龍 魏云林 林連兵 張琦 季秀玲

摘要：從明永冰川低溫土壤中分離、純化獲得一株低溫假單胞茵噬菌體PFV1，并對(duì)其生物學(xué)特性（噬菌體基因組限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性、衣殼蛋白組分分析及生理特征）進(jìn)行了初步研究?；?6S rRNA基因測(cè)序分析結(jié)果，將宿主菌初步鑒定為熒光假單胞菌菌株。噬菌體PFV1為球形，直徑約50nm。PFV1在4℃時(shí)具有侵染活性，4～25℃范圍內(nèi)均可形成噬菌。對(duì)氯仿具有一定的敏感性，具有熱不穩(wěn)定性，基因組為雙鏈DNA，大小約38kb。

關(guān)鍵詞：熒光假單胞菌；低溫噬茵體；分離；特性

中圖分類號(hào)：093

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-7847（2014）03-0222-05

低溫噬菌體通常是指可以在小于或等于4℃的溫度下能夠感染并進(jìn)行增殖的噬菌體[1]。盡管約80%地球表面積處于≤4℃的環(huán)境，而且這些環(huán)境中存在著大量的噬菌體，但對(duì)冰雪、永久冰凍地帶和冰川地區(qū)的噬菌體系統(tǒng)的調(diào)查研究才剛剛開始[2]。目前對(duì)于低溫噬菌體的研究還停留在環(huán)境調(diào)查階段，主要是通過一些非培養(yǎng)的方法研究環(huán)境中噬菌體的種類和數(shù)量。此外對(duì)于低溫噬菌體來說，上述方法也不能證明哪些噬菌體屬于低溫噬菌體，而對(duì)于噬菌體的開發(fā)利用也要求分離得到噬菌體資源。

目前分離到的低溫噬菌體主要是從污水、冰箱、表層海水與海底沉積物、海冰等環(huán)境中分離出來的[3，5]。明永冰川位于我國生物多樣性豐富的三江并流地區(qū)，屬于梅里雪山山系，是全球罕見的低緯度、低海拔、季風(fēng)海洋性冰川[6]。本文從明永冰川土壤樣品中分離、純化獲得一株低溫假單胞菌的噬菌體，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了初步研究。

1材料與方法

1.1 樣品采集

采樣地點(diǎn)位于云南省明永冰川冰舌地區(qū)（N28°27′，E98°48'）。取冰舌地區(qū)不同地點(diǎn)冰泥樣品3份，用密封袋密封好，樣品在被運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后置于4～8℃保存。

1.2培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基，pH7.0。固體培養(yǎng)基的瓊脂濃度為2%，半固體培養(yǎng)基的瓊脂濃度為0.6%。

1.3低溫宿主茵及其噬菌體的分離

低溫宿主菌的分離采用稀釋涂布平板法，取不同采樣點(diǎn)土壤樣品2g于100mL無菌水中震蕩，土壤懸浮液梯度稀釋涂布LB固體平板，置于15℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～4d，劃線純化獲得純菌株作為噬菌體分離的宿主菌。

低溫噬菌體采用雙層平板法分離[7]，將大約1Og土壤樣品加入100mL液體LB培養(yǎng)基中，4～8℃靜止放置2周富集噬菌體。富集液于6000r/min離心10min，經(jīng)0.45μm濾膜過濾。將200μL噬菌體濾液與300μL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的宿主菌混合，15℃靜置10min，然后加入3mL加熱融化并冷卻至約35℃的半固體培養(yǎng)基，混勻，傾倒在LB同體平板上，形成雙層平板。15℃培養(yǎng)2～3d，觀察噬菌斑產(chǎn)生情況。用牙簽挑取單個(gè)噬菌斑于液體LB培養(yǎng)基中，經(jīng)適當(dāng)稀釋重復(fù)噬菌斑實(shí)驗(yàn)，直至噬菌斑的大小和形態(tài)特征保持均勻一致，即認(rèn)為噬菌斑已分純。

1.4宿主菌的16S rRNA基因擴(kuò)增及測(cè)序

采用細(xì)菌通用引物f1：5'-AGAGTTTGATC-CTGGCTCAG-3'和r2：5'-ACGGCTACCTTGTTAC-GACTT_3'擴(kuò)增宿主16S rRNA基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，與pMD18-T載體連接，連接產(chǎn)物經(jīng)化學(xué)法轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞；以M13（RV/M4）作為引物利用PCR檢測(cè)重組子，挑取陽性克隆，由上海生物工程技術(shù)有限公司完成測(cè)序。

1.5噬菌體的形態(tài)觀察

取效價(jià)達(dá)到1010pfu/mL的噬菌體液20μL，用2%磷鎢酸（PTA）染色后用日立H-7500型電子顯微鏡觀察噬菌體形態(tài)。

1.6宿主菌生長(zhǎng)溫度范圍及一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將15℃生長(zhǎng)的宿主菌PF1用接種環(huán)在LB培養(yǎng)基中劃線接種，分別放置于4、15、28、37℃培養(yǎng)2～3d，觀察宿主菌的生長(zhǎng)狀況。

宿主菌于LB培養(yǎng)液15℃培養(yǎng)12h左右，以1/100比例接人新鮮LB培養(yǎng)基中。測(cè)定OD600值即為生長(zhǎng)曲線中的零時(shí)讀數(shù)值，每隔2h取樣并測(cè)定OD600吸光度值。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制宿主菌PF1的生長(zhǎng)曲線。

1.7低溫噬菌體特性研究

1.7.1噬菌斑形成溫度范圍實(shí)驗(yàn)

把適量噬菌體與宿主菌混合，于15℃吸附10min，倒雙層平板，分別放置在4、15、25 .28 .37℃培養(yǎng)，3d后觀察噬菌斑形成情況。

1.7.2噬菌體一步生長(zhǎng)曲線

噬菌體一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定采用Lu[8]的方法.

1.7.3最佳感染復(fù)數(shù)的測(cè)定

最佳感染復(fù)數(shù)的測(cè)定參照Lu[8]等的方法。按照感染復(fù)數(shù)分別為0.001、0.01、0.1、1和10的比例分別將噬菌體純培養(yǎng)液加入到含對(duì)數(shù)期宿主菌的試管中，15℃，170r/min培養(yǎng)3.5h，10000g離心10min，收集上清作連續(xù)梯度稀釋，測(cè)定噬菌體滴度，作雙份取平均值；同時(shí)以不加噬菌體的宿主菌和不加宿主菌的噬菌體作為對(duì)照。

1.7.4熱穩(wěn)定性測(cè)定

將滴度稀釋至為lxl07pfu/mL的噬菌體懸液1mL置于40、50、60、70℃水浴鍋中，每隔5min取樣，測(cè)定噬菌體滴度變化。

1.7.5有機(jī)溶劑耐受性

分別將10、20、40、80μL氯仿加入到lxl07pfu/mL噬菌體原液中（1mL），同時(shí)以不加氯仿為對(duì)照，15℃放置1h，6000r/min離心5min，測(cè)定噬菌體滴度變化。

1.8噬菌體DNA的提取及限制性酶切片段分析[9]

將100mL噬菌體富集液培養(yǎng)至效價(jià)為1010pfu/mL，利用Beckman離心機(jī)固定角轉(zhuǎn)頭JA-10于6000g離心15min，去除培養(yǎng)液中的菌體及細(xì)胞碎片，收集上清并加入DNase I和RNase A（終濃度為1 μg/mL），室溫消化30min，利用Beckman離心機(jī)固定角轉(zhuǎn)頭JA-10于6000g離心1h，沉淀用無菌水重懸，離心后的上清液即為含噬菌體顆粒的噬菌體懸液。

在lmL制備好的噬菌體懸液中加入EDTA（pH8.0）至終濃度20mmol/L，加入蛋白酶K至終濃度50μg/mL，加SDS為終濃度至0.5%，56℃溫浴1h，利用酚/氯仿法抽提噬菌體DNA，利用乙醇沉淀法獲得DNA，所得樣品分別用HindⅢ、EcoR I、BamH I和Pst I進(jìn)行酶切分析。

1.9噬菌體蛋白組成分析[9]

將1L效價(jià)達(dá)到1010pfu/mL噬菌體富集液于4℃，11000g離心15min，收集上清并加入DNase I和RNase A（終濃度為1μg/mL），室溫消化30min，加入NaCl至終濃度為1mol/L，冰浴1h。4℃，11000g離心10min，以去除細(xì)菌碎片，收集上清并加入PEG 8000至終濃度為10%，冰浴1h。4℃，11000g離心10min，收集噬菌體沉淀，用13mL SM緩沖液溶解，等體積的氯仿抽提，11000g離心10min收集水相。水相中加入05g/mLCsCl，溶解后利用Beckman離心機(jī)SW41于100000g離心24h，收集噬菌體，在SM緩沖液中透析，樣品用于SDS-PAGE分析以確定噬菌體蛋門組分。

2結(jié)果

2.1低溫茵及其裂解性噬菌體的分離

從低溫的冰川樣品中分離到約100株細(xì)菌，且大部分為假單胞菌，這與以前在同一取樣點(diǎn)分離的結(jié)果相似[l0]，分離、純化獲得一株低溫噬菌體。噬菌斑透明、邊緣清晰、圓形，直徑約5mm，出斑時(shí)間約10h，表現(xiàn)為明顯的裂解性噬菌體噬斑特征。

宿主菌16S rRNA基因序列同源檢索分析表明其與熒光假單胞菌同源性最高，達(dá)到99%，因此將其初步鑒定為熒光假單胞菌菌株。

2.2低溫噬菌體形態(tài)觀察

噬菌體為球形，直徑約50nm，外殼的中間比較亮，說明內(nèi)部是空的，根據(jù)形態(tài)初步判斷為覆層噬菌體科噬菌體。

2.3宿主菌生長(zhǎng)溫度范圍及一步生長(zhǎng)曲線

宿主菌可在4～28℃生長(zhǎng)，屬于耐冷菌，與典型的熒光假單胞菌性質(zhì)相似。

從圖2可以看出宿主菌在第9h開始進(jìn)入對(duì)數(shù)期，對(duì)數(shù)期一直持續(xù)到第22h，菌體濃度到達(dá)高峰值，以后進(jìn)入穩(wěn)定期。

2.4低溫噬菌體特性研究

2.4.1噬菌體生長(zhǎng)范圍實(shí)驗(yàn)

噬菌體可在4、15、25℃形成噬菌斑，在28℃以上不能形成噬菌斑。在4℃能夠侵染宿主并增殖，形成清晰的噬菌斑，因此屬于典型的低溫噬菌體。

2.4.2噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線

噬菌體吸附宿主菌后進(jìn)行培養(yǎng)的不同時(shí)間取樣，測(cè)定上清液中噬菌體滴度（圖3）。

從圖3可以看出噬菌體的潛伏期約為60min，裂解期大約為20min，噬菌體的潛伏期與噬菌體、宿主菌及環(huán)境條件都有關(guān)，不同噬菌體于同一菌株生長(zhǎng)，或相同噬菌體于不同宿主菌生長(zhǎng)，潛伏期都不同。

根據(jù)公式：爆發(fā)量=爆發(fā)末期噬茵體滴度/初期被感染宿主菌濃度，計(jì)算得出PFV1的爆發(fā)量為10。

2.4.3噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)

對(duì)數(shù)期宿主菌濃度為9xl09/mL，噬菌體原液中噬菌體滴度為lxl010pfu/mL。噬菌體和宿主菌混合培養(yǎng)3.5h后，宿主菌被充分裂解，培養(yǎng)液變得澄清，計(jì)數(shù)各測(cè)定管中噬菌體滴度（表1）。

根據(jù)表1，當(dāng)MOI=1時(shí)噬菌體感染其宿主產(chǎn)生的子代噬菌體數(shù)量最多，可以達(dá)到9.8xl010pfu/mL，因此確定噬菌體在以假單胞菌為宿主時(shí)的最佳感染復(fù)數(shù)為1。

2.4.4噬菌體熱穩(wěn)定性測(cè)定

分別在40、50、60、70℃條件下處理噬菌體PFV1。70℃處理5min和60℃處理15min后全部失活。即使40℃處理15min，存活率也只有原來的42%（表2）。因此，該噬菌體對(duì)溫度比較敏感。這與已經(jīng)分離到的其他低溫噬菌體噬菌體性質(zhì)十分相似[11，13]，而一般高溫噬菌體可以耐受到80～90℃。

2.4.5有機(jī)溶劑耐受性

熒光假單胞菌噬菌體對(duì)氯仿具有一定的敏感性，氯仿處理后只保留65%的滴度，推斷噬菌體病毒?？赡芎愇镔|(zhì)，因此，造成了其對(duì)氯仿具有一定敏感性。

2.5限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析

分離到的低溫噬菌體的基因組為雙鏈DNA，可以被HindⅢ、EcoR I、BamH I和Pst I切成多條大小不等的片段，進(jìn)一步分析表明其基因組DNA大小約38kb（圖4）。

2.6噬菌體衣殼蛋白組成分析

噬菌體PFV1蛋白組成的SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖5所示，根據(jù)圖譜分析，噬菌體衣殼蛋白組成有5條主要條帶，初步估計(jì)其大小（由上至下）分別約為65、62、47、44、15kD，其中47kD和44kD這兩條主條帶的含量較高，推測(cè)可能為其重要的結(jié)構(gòu)蛋白。

3討論

低溫微生物特別是兩極地區(qū)、深海以及冰川中的微生物由于長(zhǎng)期生活在低溫、寡營養(yǎng)的極端環(huán)境中，形成了極為獨(dú)特的基因、遺傳背景和代謝機(jī)制。20世紀(jì)90年代后，低溫微生物及其相關(guān)產(chǎn)物（如低溫酶類、抗凍蛋白、多聚不飽和脂肪酸以及抗腫瘤藥物等）在現(xiàn)代生物工程中的潛在應(yīng)用價(jià)值逐漸得到廣泛認(rèn)同并引起關(guān)注，成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)領(lǐng)域。然而低溫環(huán)境中病毒的分布和含量是非常豐富的，平均可達(dá)到106～108/mL，其中絕大部分為噬菌體[2，14.16]，但對(duì)低溫噬菌體的研究則相對(duì)滯后。

假單胞菌是微生物的重要類群，廣泛分布于土壤、淡水、海水以及生物體中，是自然界分布最廣的微生物之一。噬菌體分布極廣，凡是有細(xì)菌的場(chǎng)所，就可能有相應(yīng)噬菌體的存在。國外對(duì)低溫噬菌體的研究可追溯到20世紀(jì)20年代，1927年Elder和Tanner從污水中一株未鑒定的細(xì)菌中分離到低溫“裂解性噬菌體”，但關(guān)于噬菌體一宿主系統(tǒng)未作深入研究[17]。而Olsen是首次對(duì)分離自污水并侵染假單胞菌的低溫噬菌體進(jìn)行了系統(tǒng)研究的微生物學(xué)家，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與25℃相比，5種噬菌體在3.5℃時(shí)均具有較長(zhǎng)的潛伏周期（6～12hVS0.5～1h）和較少的裂解量（6～25 VS 23～l20）[18]。

一般低溫噬菌體增殖的溫度范圍為0～20℃，少數(shù)在低至-6℃溫度下仍可以增殖。因此噬菌體的富集、分離都要在低溫下進(jìn)行。本研究中宿主菌在15℃時(shí)生長(zhǎng)較快，而且不影響大多數(shù)低溫噬菌體的分離，因此選用15℃分離低溫噬菌體。由于在較高溫度時(shí)，噬菌體會(huì)發(fā)生失活，宿主在較高溫度刺激下表型可能發(fā)生變化從而影響噬菌體吸附，進(jìn)而影響到低溫噬菌體的分離，因此在選擇半固體培養(yǎng)基時(shí)要考慮到培養(yǎng)基的凝固溫度，凝固溫度過高不利于噬菌體分離。0.4%的瓊脂糖的凝固溫度約為35℃，對(duì)于低溫噬菌體和宿主來說條件比較溫和，有利于低溫噬菌體的分離。

熱不穩(wěn)定性是低溫噬菌體最顯著的特點(diǎn)之一。常溫噬菌體通?？梢栽?0℃耐受60min，活性損失很少；而低溫噬菌體在60℃或60℃以下的溫度耐受10min就有99%以上失活[11]。低溫噬菌體的熱穩(wěn)定性比常溫及高溫噬菌體差的原因目前尚未確定。但從DNA的溶解溫度和G+C含量來判斷，低溫噬菌體與常溫及高溫噬菌體的核酸組成是相似的，熱不穩(wěn)定性可能反映了噬菌體蛋白質(zhì)盼陛質(zhì)。低溫酶通過特殊的組成和構(gòu)象變化使得它有更好的柔性和更高的催化效率，但也造成了它的熱不穩(wěn)定性。噬菌體是包裹著DNA的蛋白質(zhì)顆粒，在一定程度上，可以說噬菌體顆粒就是細(xì)胞外的酶分子，因此關(guān)于低溫酶的結(jié)論對(duì)低溫噬菌體依舊成立。確實(shí)，很多噬菌體顆粒含有水解肽聚糖的酶以使噬菌體DNA進(jìn)入細(xì)胞[19]。與細(xì)胞受體正確的結(jié)合、改變頭尾連接體的定位或與宿主識(shí)別和DNA注入相關(guān)的其他特性都可以增加蛋白質(zhì)的柔性進(jìn)而導(dǎo)致噬菌體的熱不穩(wěn)定性[20]。

低溫嗜菌體的研究不僅可以豐富和發(fā)展對(duì)生命形式的認(rèn)識(shí)，而且在構(gòu)建低溫菌表達(dá)系統(tǒng)的人工載體和開發(fā)低溫下高活性的工業(yè)用酶以及分子生物學(xué)工具酶等方面，都有著廣泛的應(yīng)用前景。

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