朱紅菊 路緒強(qiáng) 劉文革 趙勝杰 閻志紅 何楠 豆峻嶺 高磊

摘 要： 為研究西瓜花葉病毒（WMV）對四倍體西瓜功能葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，用透射電鏡觀察四倍體西瓜受WMV侵染后功能葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明，WMV侵染四倍體西瓜后，四倍體西瓜葉片細(xì)胞葉綠體腫脹、片層模糊不清、葉綠體外膜產(chǎn)生異形增生物等；細(xì)胞內(nèi)嗜鋨顆粒增加，有大量的風(fēng)輪狀內(nèi)含體出現(xiàn)，產(chǎn)生大量的束絲包裹病毒粒子；有高爾基體出現(xiàn)，線粒體數(shù)目增加，細(xì)胞核核膜部分邊緣被破壞，核仁融解等。與正常四倍體西瓜葉片細(xì)胞相比，WMV對四倍體西瓜葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，影響四倍體西瓜正常生長。

關(guān)鍵詞： 西瓜花葉病毒； 葉片細(xì)胞； 超微結(jié)構(gòu)

Effect of WMV on the Ultrastructure of Tetraploid Watermelon Leaves

ZHU Hong-ju， LU Xu-qiang， LIU Wen-ge， ZHAO Sheng-jie， YAN Zhi-hong， HE Nan， DOU Jun-ling， GAO Lei

（Zhengzhou Fruit Research Institute， CAAS， Zhengzhou， Henan 450009， China）

Abstract： Effect of WMV infection on leaf cell ultrastructure of tetraploid watermelon was examined by transmission election microscopy. When plant of watermelon were infected by WMV，the altrastructure alteration of leaf cell was obvious，chloroplast showed severe swellness，looseness of grana，heterogeneous puffiness on the chloroplast membrane，more osmiophilic globules，more pinwheel inclusion，more cytoplasmic strand，Golgi apparatus appeared，more mitochondria，disintegration of nucleous membrane and disintegration of nucleus. The growth of tetraploid watermelon was also affected by WMV compared with control.

Key words： WMV； Leaf cell； Ultrastructure

四倍體西瓜具有種子少、果肉含糖量高、風(fēng)味好、植株分枝力弱、抗性強(qiáng)、管理方便等特點(diǎn)，生產(chǎn)上常用其做母本與二倍體西瓜雜交產(chǎn)生無籽果實[1-3]。在實際生產(chǎn)中無籽西瓜和四倍體西瓜容易感染病毒病，給育種和生產(chǎn)帶了很大的障礙。病毒病是西瓜主要病害之一，西瓜花葉病毒（watermelon mosaic virus，WMV）是馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）成員，1954年Anderson等人[4]首次在西瓜上發(fā)現(xiàn)該病毒，WMV是造成西瓜病毒病的一個主要毒源。在田間，WMV主要由蚜蟲傳播，在夏季，高溫、干旱、光照充足，造成蚜蟲繁殖快，數(shù)量多。當(dāng)蚜蟲成群的聚集在瓜葉上吸取汁液，當(dāng)它吸食感病植株病汁液，再遷飛到無病植株上，就可以在短時間內(nèi)迅速完成病毒傳播，導(dǎo)致植株營養(yǎng)不良。近年來，隨著夏季干旱的加劇，西瓜花葉病毒病在西瓜主產(chǎn)區(qū)內(nèi)均有發(fā)生，并且呈上升趨勢，WMV侵染西瓜，早期感病會造成不結(jié)瓜或畸形瓜，對產(chǎn)量影響很大；坐瓜期感病，則降低瓜的品質(zhì)[5]，因此是制約西瓜穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的重要因素之一。WMV粒子主要存在于表皮和葉肉細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，受侵染的植株細(xì)胞膜受到嚴(yán)重的破壞，并且葉綠體、線粒體結(jié)構(gòu)受損，尤其是葉綠體，由于基粒片層的崩解，葉綠素大量解體，使得寄主組織出現(xiàn)褪綠的現(xiàn)象[6]。國內(nèi)外研究者對西瓜花葉病毒的生物學(xué)特性、抗病資源、抗病毒基因工程策略等方面進(jìn)行了較多的研究[7-11]，劉文革等[12]和朱紅菊等[13]對西瓜葉片的表皮形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察，但是對西瓜花葉病毒侵染西瓜葉片后的超微結(jié)構(gòu)尚未見報道。本研究通過觀察四倍體西瓜葉片細(xì)胞感染W(wǎng)MV之后的超微結(jié)構(gòu)，為無籽西瓜育種和生產(chǎn)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試四倍體西瓜材料為秋水仙素誘導(dǎo)加倍后的西瓜四倍體（4B32），于2010 年在中牟實驗基地種植。待西瓜植株盛花期時，選擇感染W(wǎng)MV發(fā)病較重的四倍體西瓜作為切片的試驗材料，對照材料選擇相同位置正常生長四倍體西瓜的功能葉片切片。

1.2 試驗方法

沿葉片主葉脈在兩份材料相同部位剪取2 mm×2 mm的葉樣，將剪下的材料立即放入盛有預(yù)冷的4%戊二醛固定液中，抽真空，在0~4 ℃下固定24 h；取出固定好的材料，用0.1 mol·L-1PBS（pH7.2）清洗3次，每次20 min；用1% 鋨酸固定3 h，用0.1 mol·L-1PBS清洗3次，每次20 min；不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇逐級脫水：30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇→90%乙醇（每級15 min）→100%乙醇→100%乙醇（無水乙醇每級30 min）；用無水丙酮置換3次，每次15 min；丙酮以2∶1比例配制的混合浸透液，35 ℃溫箱，浸透2 h；Epon812環(huán)氧樹脂包埋；LKB5型切片機(jī)切片，經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色；于HITACHI-H7500型透射電鏡下對葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察并拍照（透射電鏡的試驗是在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所完成的）。觀察正常生長的四倍體西瓜葉片及受WMV感染的四倍體西瓜葉片細(xì)胞中葉綠體、葉綠體基粒片層、線粒體、細(xì)胞核、高爾基體等細(xì)胞結(jié)構(gòu)，每個樣品觀察10個以上視野。

2 結(jié)果與分析

2.1 正常四倍體西瓜葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)形態(tài)特征

從圖1中可以看出正常生長的四倍體西瓜葉片細(xì)胞形態(tài)特征為：線粒體、葉綠體形態(tài)清晰，結(jié)構(gòu)規(guī)整，葉綠體呈現(xiàn)梭形，整齊地排列在細(xì)胞膜邊緣（圖1-a），其上基質(zhì)類囊體、基粒類囊體排列規(guī)則（圖1-b、c），結(jié)構(gòu)清晰，液泡顯著，核染色質(zhì)致密、均勻，核膜平滑、清晰，核仁濃黑（圖1-d），顯示葉片光合作用旺盛、各類代謝通暢。

2.2 感染W(wǎng)MV之后的四倍體西瓜葉片細(xì)胞形態(tài)特征

從圖1中可以看出，四倍體西瓜葉片感染W(wǎng)MV之后，葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化有：葉綠體腫脹變圓，片層模糊不清，葉綠體脫離細(xì)胞膜周邊，游離到細(xì)胞質(zhì)中（圖1-e），部分葉綠體邊緣出現(xiàn)異性增生物（圖1-f）；線粒體和嗜鋨顆粒數(shù)目增加（圖1-g）；在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上有大量的風(fēng)輪狀內(nèi)含體出現(xiàn)（圖1-h）；細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)高爾基體（圖1-i）；產(chǎn)生大量的束絲包裹病毒粒子（圖1-j）；細(xì)胞核核膜部分邊緣被破壞，核仁融解（圖1-k）。

圖1 正常四倍體西瓜和WMV侵染后四倍體西瓜葉片超微結(jié)構(gòu)

a. 正常四倍體西瓜葉肉細(xì)胞（×4 000）； b. 正常四倍體西瓜葉肉細(xì)胞葉綠體（×30 000）； c. 正常四倍體西瓜葉肉細(xì)胞葉綠體上的片層（×60 000）； d. 正常四倍體西瓜葉肉細(xì)胞細(xì)胞核（×15 000）； e. WMV侵染的四倍體西瓜葉肉細(xì)胞葉綠體游離到細(xì)胞中（×6 000）； f. WMV侵染的四倍體西瓜葉肉細(xì)胞葉綠體外膜增生（×30 000）； g. WMV侵染的四倍體西瓜葉肉細(xì)胞增多的線粒體（×60 000）； h. WMV侵染的四倍體西瓜葉肉細(xì)胞風(fēng)輪狀內(nèi)含體（×50 000）； i. WMV侵染的四倍體西瓜葉肉細(xì)胞內(nèi)的高爾基體（×80 000）； j. WMV侵染的四倍體西瓜葉肉細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)束絲（×30 000）； k. WMV侵染的四倍體西瓜葉肉細(xì)胞部分核膜降解， 核仁消失（×30 000）。CW 細(xì)胞壁； CH 葉綠體； N 細(xì)胞核； NL 核仁； M 線粒體； PW 風(fēng)輪狀內(nèi)含體； CS 細(xì)胞質(zhì)束絲； G高爾基體。

3 討論與結(jié)論

朱紅菊等[11]研究發(fā)現(xiàn)，正常生長的四倍體西瓜葉片細(xì)胞線粒體、葉綠體形態(tài)清晰，結(jié)構(gòu)規(guī)整。葉綠體呈現(xiàn)梭形，整齊地排列在細(xì)胞膜邊緣，其上基質(zhì)類囊體、基粒類囊體排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)清晰，液泡顯著。核染色質(zhì)致密、均勻，核膜平滑、清晰，核仁濃黑。植物在遇到病毒侵染時，葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)會受到損傷，其中對病毒侵染最敏感的細(xì)胞器是葉綠體，病毒侵染后葉綠體會由正常的梭形膨脹變圓、基粒片層松散、模糊不清、葉綠體膜降解、脫離細(xì)胞膜周邊甚至游離到細(xì)胞質(zhì)中等現(xiàn)象[14]，這些現(xiàn)象在本研究中也都有發(fā)現(xiàn)。

智海劍等[14]和李赤等[15]都認(rèn)為結(jié)構(gòu)遭到破壞、處于解體狀態(tài)下的葉綠體會出現(xiàn)嗜鋨顆粒數(shù)量增加的現(xiàn)象，這種情況經(jīng)常發(fā)生在衰老和生病的葉細(xì)胞中，嗜鋨顆粒是葉綠體膜結(jié)構(gòu)的降解產(chǎn)物—脂類發(fā)生集結(jié)的結(jié)果。正常生長發(fā)育的葉綠體內(nèi)，就很少存在嗜鋨顆粒。在本研究中，四倍體西瓜葉片經(jīng)WMV感染之后，葉綠體內(nèi)出現(xiàn)了大量嗜鋨顆粒，正常的光合作用無法進(jìn)行，影響植物的生長，使植物呈現(xiàn)病態(tài)。

李學(xué)湛[16]研究病毒感染對大豆葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響發(fā)現(xiàn)，病毒侵染宿主之后，在寄主葉片細(xì)胞中首先出現(xiàn)風(fēng)輪狀內(nèi)含體，之后出現(xiàn)病毒粒體，這些粒體逐漸被液泡膜形成的束絲包裹起來，附著在葉綠體上。這些風(fēng)輪狀內(nèi)含體可能是SMV 粒體的RNA作用轉(zhuǎn)譯RNA多聚酶所合成的細(xì)胞代謝抑制物，不但抑制了細(xì)胞的代謝，又旋轉(zhuǎn)破壞了細(xì)胞內(nèi)的正常結(jié)構(gòu)。因此本研究發(fā)現(xiàn)的風(fēng)輪狀的內(nèi)含體應(yīng)該是病毒剛開始入侵的時期，而液泡膜形成的束絲狀體則是侵染后期包裹病毒的內(nèi)含體。Tresnaputra U S和Ehara Y[17]研究發(fā)現(xiàn)大豆感染SMV后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)風(fēng)輪狀內(nèi)含體及無定形體，并且這些內(nèi)含體的數(shù)量與植株的抗病能力密切相關(guān)。滕衛(wèi)麗等[18]研究大豆感染SMV之后感病品種細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了風(fēng)輪狀內(nèi)含體，而抗病品種細(xì)胞內(nèi)則沒有出現(xiàn)這種內(nèi)含體。由此可見風(fēng)輪狀內(nèi)含體是四倍體西瓜感染了WMV之后出現(xiàn)的破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。

正常生長的四倍體西瓜葉片細(xì)胞中是觀察不到高爾基體的，但是當(dāng)四倍體西瓜感染W(wǎng)MV之后細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)了高爾基體。生物細(xì)胞中的高爾基體有其獨(dú)特的作用，它有轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞內(nèi)糖、類脂化合物的作用，并且參與合成溶酶體[17]，因此，本研究中高爾基體的出現(xiàn)是寄主細(xì)胞抵抗病原體侵入的一種抗性反應(yīng)。

李文龍等[19]發(fā)現(xiàn)大豆受SMV侵染后細(xì)胞核核膜降解，景炳年等[20]發(fā)現(xiàn)煙草受VFB侵染后出現(xiàn)了細(xì)胞核核膜的破裂，認(rèn)為這是細(xì)胞核膜為了加強(qiáng)抗病機(jī)制、處于應(yīng)激代償或失代償狀態(tài)所致。本研究也發(fā)現(xiàn)正常生長的葉片細(xì)胞膜核膜清晰完整，而被WMV侵染后細(xì)胞膜核膜發(fā)生破裂，這可能與四倍體西瓜細(xì)胞的抗病響應(yīng)機(jī)制相關(guān)。本文只對四倍體西瓜葉被WMV侵染后的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，具體與二倍體西瓜相比較，其抗病毒的機(jī)制如何，還需要進(jìn)一步研究。

本文通過比較正常生長的四倍體西瓜葉片細(xì)胞和受到WMV侵染的四倍體西瓜葉片細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，受到WMV侵染后，細(xì)胞膜、葉綠體、線粒體、高爾基體、細(xì)胞核等細(xì)胞結(jié)構(gòu)均受到了影響，細(xì)胞功能受到損傷，影響西瓜植株的正常生長。

參考文獻(xiàn)

[1]劉文革，王 鳴，閻志紅. 蔬菜作物多倍體育種研究進(jìn)展[J]. 長江蔬菜，2003（1）： 29-33.

[2]劉文革，閻志紅. 植物離體組織染色體加倍誘導(dǎo)同源四倍體[J]. 植物學(xué)通報，2005（22）： 29-36.

[3]劉文革. 我國無籽西瓜科研和生產(chǎn)的現(xiàn)狀與展望[J]. 中國瓜菜，2007（6）： 57-59.

[4] Anderson C W. Two watermelon mosaic virus strains from central Florida[J]. Phytopathology，1954（22）： 198-202.

[5]蔡曉雨. 西瓜抗病毒病材料的抗性鑒定和篩選研究[J]. 種子科技， 2013（06）： 56-57.

[6]姜 華，房德純，韋石泉，等. 西瓜花葉病毒（WMV-2）兩株系寄主的病生理研究[J]. 植物病理學(xué)報， 1995，35（1）： 73-76.

[7]張建新，劉起麗，吳云鋒. 西瓜花葉病毒HC-Pro 基因的克隆與原核表達(dá)[J]. 河南師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2009（4）：101-104.

[8]王威麟，張 昊，于祥泉，等. 侵染西瓜的5種病毒ZYMV、WMV、TMV、SqMV和CMV的多重RT-PCR檢測體系的建立與檢測應(yīng)用[J]. 植物病理學(xué)報，2010，40（1）： 27-32.

[9]黃素芳，向本春，李虎得，等. 新疆西瓜花葉病毒2號遺傳變異的PCR-SSCP分析[J]. 植物病理學(xué)報，2011，41（3）： 310-313.

[10]周 健，顧興芳，張圣平，等. 黃瓜對西瓜花葉病毒病抗性的研究進(jìn)展[J]. 中國蔬菜，2012（10）： 7-13.

[11]張建新，吳云鋒，王 睿，等. 西瓜花葉病毒中國分離株全基因組核苷酸序列測定[J]. 病毒學(xué)報，2007，23（2）： 153-156.

[12]劉文革，閻志紅，饒小莉. 不同倍性西瓜的葉表皮微形態(tài)特征比較[J]. 果樹學(xué)報，2005，22（1）： 31-34.

[13] 朱紅菊，劉文革，趙勝杰，等. 不同倍性西瓜幼苗葉片超微結(jié)構(gòu)的比較[J]. 中國瓜菜，2012，25（3）： 5-7.

[14]智海劍，蓋鈞鎰，郭東全. 對大豆花葉病毒不同抗性類型品種的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)特征[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，28（1）： 6-10.

[15]李 赤，黎永堅，于 莉，等. 香蕉枯萎病菌毒素對香蕉葉片超微結(jié)構(gòu)的影響[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，33（2）： 158-164.

[16]李學(xué)湛. 復(fù)合病毒感染對大豆葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響[J]. 電子顯微學(xué)報，1991，10（1）： 12-16.

[17]Tresnaputra U S，Ehara Y. Electron microscopy of soybean leaf cells infected with five strains of soybean mosaic virus[J]. Tohoku Joural of Agricultural Research，1989，39（24）： 61-71.

[18]滕衛(wèi)麗，李文濱，韓英鵬，等. SMV3對抗感大豆品種葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響[J]. 作物雜志，2009（3）： 21-23.

[19]李文龍，王月明，侯春燕，等. 兩個不同株系大豆花葉病毒侵染大豆細(xì)胞的超微病變比較研究[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，31（4）： 1-6.

[20]景炳年，李林茹，何 軍，等. VFB抗煙草花葉病毒活性及對煙草葉片超微結(jié)構(gòu)的影響[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2011，39（6）： 159-164.

收稿日期： 2013-11-05； 修回日期： 2014-03-25

基金項目： 國家自然科學(xué)基金（31171979）； 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-26-03）； “十二五”國家科技支撐項目（2012BAD02B00）

作者簡介： 朱紅菊，女，碩士。電話： 15903610524； 電子信箱： huanpei633@163.com

通信作者： 劉文革，男，博士，研究員，博士研究生導(dǎo)師，全國無籽西瓜科研與生產(chǎn)協(xié)作組組長，國家西甜瓜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系無籽西瓜育種崗位科學(xué)家，主要從事西瓜多倍體育種與生物技術(shù)研究。電話： 0371-65330936； 電子信箱： lwgwm@163.com