薛瑩瑩 孫守如 孫德璽 鄧云 朱迎春 劉君璞

摘 要： RGA克隆法是利用抗病基因產(chǎn)物的保守結(jié)構(gòu)域人工設(shè)計(jì)簡并引物，以植物gDNA或cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增而克隆植物抗病基因同源序列的方法。隨著各種植物基因組測序計(jì)劃的完成及計(jì)算機(jī)和生物信息學(xué)的發(fā)展，植物抗病基因的克隆取得了很大進(jìn)展，目前人們已經(jīng)從植物中克隆得到100多個(gè)抗病基因。研究表明，大多數(shù)抗病基因都存在NBS-LRR、STK、LZ、TIR等功能保守的結(jié)構(gòu)域，其中大部分都為NBS-LRR類型，利用NBS-LRR保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)PCR引物已經(jīng)從植物中擴(kuò)增出大量的RGA。簡要綜述了已克隆NBS-LRR類抗病基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和功能、RGA法克隆NBS-LRR類抗病基因同源序列及其在葫蘆科作物上應(yīng)用的研究進(jìn)展，并探討其未來的發(fā)展與應(yīng)用。

關(guān)鍵詞： RGA； NBS-LRR； 抗病基因； 西瓜； 甜瓜； 黃瓜

Cloning of NBS-LRR-encoding Resistance Gene Analogues Using RGA Approach and the Advance in Cucurbit Crops

XUE Ying-ying1，2， SUN Shou-ru1， SUN De-xi2， DENG Yun2， ZHU Ying-chun2， LIU Jun-pu2

（1. College of Horticulture， Henan Agricultural University， Zhengzhou， Henan 450002， China; 2. Zhengzhou Fruit Research Institute， CAAS， Zhengzhou， Henan 450009， China）

Abstracts： As majority resistance genes encode a highly conserved protein domain，RGA approach is a method of using the conserved protein domain design degenerate primers to clone resistance gene analogs from plant gDNA or cDNA. With the assembling of genome sequence in various plant species and the development of bioinformatics，the cloning of plant disease resistance genes have made great progress，more than 100 resistance genes have been cloned. Related studies showed that majority of plant disease resistance genes encode a conserved NBS-LRR，STK，LZ，TIR functional structure and majority of them belonging to NBS-LRR class. Using conserved NBS-LRR-encoding domain to design degenerate primer has amplified a number of RGA. In this article，the structure characteristics and function of NBS-LRR-encoding resistance genes and the advance in cloning NBS-LRR-encoding resistance genes using RGA approach and application in cucurbit crops has been reviewed and its future development and application has also been discussed.

Key words： RGA； NBS-LRR； Resistance gene； Watermelon； Melon； Cucumber

植物在生長發(fā)育過程中均會(huì)受到病蟲不同程度的侵害，其中包括細(xì)菌、真菌、病毒、線蟲、螨蟲和昆蟲。在與有害生物的長期抗?fàn)幹?，植物逐漸進(jìn)化出了一系列復(fù)雜的防御機(jī)制來保護(hù)自己，一類是依靠簡單的物理屏障和化學(xué)反應(yīng)，另一類則是基于1971年Flor提出的“基因?qū)蚣僬f”，在植物和侵染病原物之間產(chǎn)生復(fù)雜的生化反應(yīng)，其中植物抗病基因（R基因）在識(shí)別病原物無毒基因Avr產(chǎn)生的蛋白效應(yīng)子中起重要作用[1]。自從1992年Johal等[2]克隆得到第一個(gè)抗病基因——玉米抗圓斑病基因Hm1后，目前人們已經(jīng)從植物中克隆得到100多個(gè)抗病基因[3]。基于抗病基因中功能保守結(jié)構(gòu)域，可從廣義上將植物抗病基因至少分為5類：第1類以玉米HM1基因?yàn)榇恚幋aHC-毒素還原酶，目前只有HM1基因1個(gè)；第2類為NBS-LRR類，占R基因總數(shù)的72%；第3類以番茄Pto基因?yàn)榇?，編碼STK蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，占R基因總數(shù)的3%；第4類以Xa21為代表，編碼胞外LRR和一個(gè)胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域，占R基因總數(shù)的3%；第5類以番茄Cf基因?yàn)榇?，編碼一個(gè)胞外的TM-LRR和一個(gè)胞內(nèi)的STK 激酶，占R基因總數(shù)的11%。除第1類外的R基因編碼均可識(shí)別病原物Avr基因產(chǎn)生的蛋白受體，符合“基因?qū)蚣僬f”，還有一些其他類抗病基因占R基因總數(shù)的11%[4]?？梢奛BS-LRR類抗病基因在植物R基因中占有重要地位，因此，植物NBS-LRR類抗病基因的克隆對(duì)植物抗病機(jī)制的研究、植物基因工程改良及抗病品種的選育等方面具有重要意義。

1 NBS-LRR類植物抗病基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和功能

R基因產(chǎn)物是植物抵抗病原物侵害的重要組成部分，在目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的植物抗病基因中，NBS-LRR類占了絕大多數(shù)，且進(jìn)化程度很高，被推測存在于細(xì)胞質(zhì)中。該類抗病基因所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是具有核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（NBS）、富亮氨酸重復(fù)（LRR）和N端的一些結(jié)構(gòu)域，根據(jù)N端結(jié)構(gòu)的不同，又可以將NBS-LRR基因分為TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR兩大類，簡稱TNL和non-TNL，其中TIR為果蠅Toll蛋白及哺乳動(dòng)物白細(xì)胞介素-1受體的胞外相似區(qū)域，non-TNL主要是在N端含有一個(gè)CC卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。Van der Biezen等[5]在1998年提出NB-ARC結(jié)構(gòu)域是一種植物抗病基因產(chǎn)物和動(dòng)物細(xì)胞死亡調(diào)控子所共有的新的信號(hào)基序，并且可能揭示了在植物、線蟲和哺乳動(dòng)物中細(xì)胞程序性死亡調(diào)控核心的某些保守性。

NBS結(jié)構(gòu)域是NBS-LRR基因編碼蛋白中最保守的部分，含有8個(gè)保守基序，包括P-loop（又稱Kinase-1a）、Kinase-2a、Kinase-3a和GLPL疏水結(jié)構(gòu)域等。其中P-loop用于結(jié)合ATP或GTP的磷酸，其共有序列為GM（G/P）G（I/L/V）GKTTLA（Q/R）；Kinase-2a的特點(diǎn)是4個(gè)疏水氨基酸殘基后緊跟1個(gè)不變的帶負(fù)電荷的天冬氨酸，但在植物中，這一區(qū)域的兩端還具有高度保守的氨基酸，共有序列為K（R/K）x LLVLDDV（W/D），參與磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)；Kinase-3a保守區(qū)含有一個(gè)酪氨酸（Y）或精氨酸（R）殘基，參與結(jié)合嘌呤或核糖；GLPL疏水結(jié)構(gòu)域的共有序列為GGLPL（A/G）LK[6]。NBS結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合ATP或GTP，在植物抗病的過敏性反應(yīng)生理過程中，可能參與抗病信號(hào)的傳導(dǎo)。NBS 存在于真核生物的許多蛋白中，如ATPase、延伸因子異質(zhì)三聚體、GTP結(jié)合蛋白、R基因編碼蛋白等，這些蛋白對(duì)于細(xì)胞的生長、分化、細(xì)胞骨架的形成、小泡運(yùn)輸和防御反應(yīng)都起關(guān)鍵性的作用[7]。

LRR是一段連續(xù)且重復(fù)的富含亮氨酸的氨基酸序列，胞內(nèi)的LRR結(jié)構(gòu)模式不很規(guī)則，多樣性較高，基本骨架模型為LxxLxxLxxLxLxxxx（x為不確定的氨基酸），空間結(jié)構(gòu)由α螺旋和β折疊構(gòu)成，有利于和其他分子緊密結(jié)合，被認(rèn)為在病原體識(shí)別上起作用。Hwang 等[8]對(duì)番茄抗線蟲基因Mi-1.2和其橫向同源基因Mi-1.1的研究表明，LRR不僅在病原體識(shí)別上起作用，在下游信號(hào)傳導(dǎo)中也起作用。

2 RGA法克隆NBS-LRR類抗病基因的研究進(jìn)展

RGA法又稱為同源序列克隆法，其原理是利用抗病基因蛋白產(chǎn)物的保守結(jié)構(gòu)域，人工設(shè)計(jì)簡并引物，以植物gDNA或cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到植物的抗病基因同源序列（resistance gene analogs， RGA）。自1996年在PNAS上連續(xù)兩篇關(guān)于用抗病基因產(chǎn)物的保守序列為引物來擴(kuò)增RGA的文章發(fā)表以來，人們已經(jīng)從多種植物中擴(kuò)增到抗病基因同源序列[9]。RGA既可以是一種DNA分子標(biāo)記，也可以是植物本身所攜帶的抗病基因，在植物中普遍存在，多以成簇的方式隨機(jī)分布于植物基因組中。它與R基因之間存在3種關(guān)系：第一，與已知抗病基因具有很高的相似性或?yàn)榭共』虻囊徊糠?；第二，與已知抗病基因連鎖或?yàn)榭剐曰蚣易宄蓡T；第三，與抗病基因無關(guān)，只是序列上存在相似性。所以RGA 與植物抗病基因仍然有較大區(qū)別，但它們均含有抗病基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，最有可能參與植物抗病反應(yīng)過程，可作為候補(bǔ)抗性基因，再通過與已知的遺傳圖譜進(jìn)行分析比較，就可以確定它們與已知抗病基因的關(guān)系或克隆出新的抗病基因。這一方法已經(jīng)成為分離克隆和尋找新的抗病基因的最簡捷、最經(jīng)濟(jì)和最有效的途徑[9-10]。

自從1996年Kanazin等[11]和Yu等[12] 分別利用NBS-TM和NBS保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)引物從大豆基因組中獲得RGA 以來，抗病基因同源序列克隆法已得到廣泛應(yīng)用，現(xiàn)已從水稻[13]、玉米[14]、大麥[15]、小麥[16]、擬南芥[17]、番石榴[18]、菜豆[19]、絲瓜[20]、花生[21]、芒果[22]等多種植物中擴(kuò)增出抗病基因同源序列。Okuyama等[23]從水稻的12條NBS-LRR類RGA中篩選得到抗稻瘟病基因Pia，且稻瘟病菌中含有AVR-Pia無毒基因，符合“基因?qū)颉奔僬f。 Calenge等[24]利用蘋果中高度保守的NBS結(jié)構(gòu)域內(nèi)的P-loop基序設(shè)計(jì)簡并引物，最終得到43條分子標(biāo)記，其中23條為RGA分子標(biāo)記，25條分子標(biāo)記與抗病基因主效基因或者QTL緊密連鎖。Perazzolli 等[25]在2014年從蘋果中分離得到868條RGA并研究了它們在薔薇科中的進(jìn)化史。Hunger等[26]利用抗病基因保守序列設(shè)計(jì)簡并引物從甜菜中擴(kuò)增得到47條RGA并對(duì)其進(jìn)行了連鎖性分析，其中21條為NBS-LRR類抗病基因同源序列。Tian等[27]也根據(jù)NBS-LRR保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)簡并引物擴(kuò)增甜菜RGA，結(jié)果表明甜菜基因組中可能缺失TIR類型的RGA。安然等[28]以柑橘的gDNA為模板，根據(jù)NBS-LRR保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)簡并引物，從對(duì)柑橘潰瘍病菌表現(xiàn)不同抗性的6個(gè)柑橘品種中擴(kuò)增得到9條RGA，并對(duì)其進(jìn)行了分析和Sourthern鑒定，為定位、克隆柑橘抗病基因及利用分子標(biāo)記輔助選擇育種提供了研究基礎(chǔ)。Rout等[29]利用NBS-LRR抗性基因編碼蛋白中的NBS保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)簡并引物，從抗FBR（洋蔥干腐?。┑拇笏獠牧现蟹蛛x到28條RGA，qRT-PCR分析它們在根、莖、葉中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示其中一條命名為AsRGA29的RGA受FOC侵染后表達(dá)量顯著上調(diào)，進(jìn)一步研究表明，在SA、MeJa、H2O2和ABA四種防御信號(hào)分子處理下也得到相同結(jié)果。該研究雖然沒有得到FBR抗病基因，但是為今后研究與FBR抗病基因連鎖的RGA分子標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)。目前成功的案例有Paal等[30]以馬鈴薯NBS同源序列St332為探針最終克隆得到抗馬鈴薯金線蟲Gro1-4基因，Chen等[31]以茄科植物抗病基因保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)簡并引物并結(jié)合RACE技術(shù)從辣椒中克隆得到根結(jié)線蟲抗病基因CaMi。

3 NBS-LRR類RGA在葫蘆科作物中的研究進(jìn)展

葫蘆科作物中的西瓜、甜瓜和黃瓜是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物。丁國華等[32]利用簡并引物從黃瓜基因組DNA中分離得到15條NBS類RGA，其中10條為可通讀序列，且與已報(bào)道的甜瓜RGA有較高同源性。Huang 等[33] 2009年公布了黃瓜基因組序列，分析發(fā)現(xiàn)黃瓜中僅有61條NBS類抗病基因，在數(shù)量上和番木瓜中55條NBS類抗病基因相近，但是遠(yuǎn)低于擬南芥（200條）、白楊（398條）和水稻（600條）中NBS類抗病基因的數(shù)量。Harris等[34]根據(jù)NBS-LRR抗病基因家族中的NBS保守結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)簡并引物，從西瓜材料‘Calhoun Gray、‘PI296341和‘PI595203中克隆得到66條RGA片段，測序結(jié)果顯示這些WRGA含有NBS-LRR抗病基因保守結(jié)構(gòu)基序，聚類分析將WRGA分為8組分別包含TNL和non-TNL類型，其中WRGA1、WRGA7和WRGA147被定位于第13連鎖群8 cM的區(qū)域內(nèi)，因?yàn)樗鼈兎謱儆诓煌腡NL類抗病基因同源序列，卻被定位在同一連鎖群上，表明該區(qū)域上很可能存在抗病基因，有待于進(jìn)一步研究。Guo等[35]以西瓜材料‘PI97103構(gòu)建西瓜基因組圖譜，在西瓜基因組中僅發(fā)現(xiàn)44條NBS-LRR基因，遠(yuǎn)低于水稻、蘋果和玉米中NBS-LRR基因的數(shù)量。Brotman等[36]根據(jù)已知抗病基因設(shè)計(jì)簡并引物從甜瓜中分離得到15條NBS-LRR基因家族的同源序列，其中幾條NBS-LRR相關(guān)序列定位于抗番木瓜環(huán)斑病毒病、抗枯萎病Fom-1和Fom-2、抗蚜蟲基因位點(diǎn)附近，為甜瓜抗病育種分子標(biāo)記的應(yīng)用和R基因的克隆奠定了基礎(chǔ)。Garcia-Mas等[37] 2012年公布了甜瓜雙單倍體DHL92的基因組序列，其中細(xì)胞質(zhì)NBS類抗病基因總數(shù)量為 81個(gè)，而同類別的抗病基因在擬南芥、葡萄和水稻中的總數(shù)量分別是212、302和548個(gè)，這些數(shù)據(jù)顯示NBS-LRR類基因數(shù)目在植物中并不保守，而且在甜瓜屬中的數(shù)值更低，可能該類物種中NBS-LRR類基因發(fā)生了相似的進(jìn)化。Wan等[38]比較了葫蘆科作物NBS類抗病基因同源序列的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，系統(tǒng)發(fā)生分析顯示，基因復(fù)制、序列差異和基因缺失是葫蘆科植物NBS類基因進(jìn)化的三大主要模式。

4 存在問題及展望

自從1996年RGA法出現(xiàn)以來，人們已經(jīng)從多種植物中克隆得到抗病基因同源序列，但是成功得到植物抗病基因的例子卻不多，因?yàn)镽GA并不等同于抗病基因，可能是R基因的一部分或者與之連鎖，也可能與R基因沒有關(guān)系。其中，Paal等[30]和Chen等[31]分別成功克隆得到了馬鈴薯Gro1-4和辣椒CaMi抗病基因，這2個(gè)基因均存在于茄科植物，且簡并引物的設(shè)計(jì)模板也是源自茄科植物。這可能說明2個(gè)問題：第一，茄科植物內(nèi)NBS類抗病基因保守性較高；第二，同一科屬內(nèi)植物間的NBS類抗病基因保守性較高。雖然NBS-LRR類抗病基因存在保守結(jié)構(gòu)域，但是不同種屬之間仍然有較大的序列差異，在利用RGA法克隆抗病基因時(shí)應(yīng)當(dāng)引起注意。

葫蘆科作物黃瓜、西瓜和甜瓜基因組測序已經(jīng)完成，這3種植物內(nèi)的NBS-LRR類抗病基因也逐漸呈現(xiàn)在人們面前。研究表明，黃瓜、西瓜和甜瓜基因組中NBS-LRR類抗病基因數(shù)量相對(duì)比擬南芥、水稻等植物都顯示較低水平，可能是植物本身NBS-LRR類抗病基因在進(jìn)化過程中缺失，也可能是還有部分NBS-LRR類抗病基因人們尚未發(fā)現(xiàn)。Jupe[39]在2013年應(yīng)用RenSeq方法（RenSeq： Resistance gene enrichment and sequencing method，抗性基因富集測序法）成功在已經(jīng)完成了基因組測序和分析的馬鈴薯中將NBS-LRR數(shù)量從438條增加到755條，可能將來也會(huì)應(yīng)用到葫蘆科植物抗病基因的克隆中，為發(fā)現(xiàn)新的葫蘆科植物抗病基因提供技術(shù)支持。

隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，越來越多的植物基因組序列將會(huì)呈現(xiàn)在人們面前，在今后的研究中勢必要求我們開發(fā)更高效的技術(shù)手段發(fā)現(xiàn)新的抗病基因，同時(shí)，結(jié)合先進(jìn)的基因芯片、RenSeq等技術(shù)，優(yōu)化RGA的分離方法，并運(yùn)用生物信息學(xué)快速識(shí)別、比較更多的RGA，預(yù)測其中的基因結(jié)構(gòu)及功能，從而為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

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收稿日期： 2014-03-28； 修回日期： 2014-04-10

基金項(xiàng)目： 國家西甜瓜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-26-14）； 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（0032012024）

作者簡介： 薛瑩瑩，女，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)槭卟诉z傳育種與分子生物學(xué)。電話： 15824893361； 電子信箱： henauxyy@126.com

通信作者： 劉君璞，男，研究員，主要從事西瓜遺傳育種及栽培技術(shù)研究。電子信箱：liujunpu@caas.cn