楊冬平 高兆銀 李敏等

摘 要 探討水楊酸結(jié)合超聲波處理對芒果采后炭疽病的抗病性及其相關(guān)防御酶活性的影響。以綠熟‘貴妃芒為試驗材料，用水楊酸（2 mmol/L）、超聲波（40 kHz，500 W）單獨處理及兩者結(jié)合處理，貯藏24 h后進行損傷接種芒果炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），并在接種后第6天測定病原菌的致病性；同時，對處理后未接種果實，每2 d取樣一次，測定果肉組織中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）、幾丁質(zhì)酶（CHT）和β-1，3葡聚糖酶（GLU）等相關(guān)防御酶的活性和果皮中總酚含量的變化。結(jié)果表明：水楊酸能有效抑制芒果采后炭疽病病斑的擴展，能夠提高相關(guān)防御酶的活性和果皮中總酚的積累；水楊酸結(jié)合超聲波處理顯著提高水楊酸單獨處理的作用效果，顯著增強了果實抗病性，是芒果采后炭疽病防控的新技術(shù)。

關(guān)鍵詞 芒果；水楊酸；超聲波；抗病性

中圖分類號 Q945.8 文獻標識碼 A

芒果（Mangifera indica L.）屬漆樹科芒果屬果樹，是中國南方地區(qū)的一種重要經(jīng)濟作物，因其風味獨特，肉質(zhì)嫩滑且富含有機酸、維生素、抗氧化物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分而深受大眾喜愛[1]。然而，芒果易受病原微生物侵染，從而引起果實貯運期間嚴重腐爛，造成極大的經(jīng)濟損失。炭疽病是導致芒果采后腐爛和品質(zhì)劣變的主要病害之一，引起該病的主要病原菌為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）[2]。該菌具有潛伏侵染的特性，在田間較少引起果實發(fā)病，但在采后貯藏過程中逐漸出現(xiàn)癥狀[3]。采用噻菌靈、咪鮮胺等化學殺菌劑處理是控制芒果采后炭疽病的有效手段[4-5]。然而，使用殺菌劑所引起的藥物殘留、環(huán)境污染、病原菌產(chǎn)生抗藥性及危害人體健康等問題日益凸現(xiàn)[6]。因而尋求安全高效的采后處理技術(shù)是芒果保鮮中需要亟待解決的問題。

水楊酸（Salicylic acid，SA），即鄰羥基苯甲酸，是植物體內(nèi)自身合成的一種簡單酚類物質(zhì)，也是植物組織中的一種天然活性物質(zhì)，被認為是一種新型的植物內(nèi)源激素和信號分子，參與調(diào)節(jié)生物及非生物逆境響應(yīng)等諸多生理生化過程[7]。大量研究表明，在采前或采后使用適當濃度水楊酸處理能夠誘導果實產(chǎn)生抗病性，可有效降低果實腐爛率和改善果實品質(zhì)[7-8]。

超聲波（Ultrasound，US），是由機械振動在媒質(zhì)中的傳播而產(chǎn)生的，頻率一般在20 kHz以上，在液體介質(zhì)中傳播時的顯著特點是會產(chǎn)生空化現(xiàn)象[9]，US的空化作用能在細胞壁與細胞液等非均相間產(chǎn)生微射流和局部高熱、高壓，使物體表面產(chǎn)生沖擊和腐蝕，這對細菌、真菌等微生物有強烈的殺滅作用[10]。Cao等[11]研究發(fā)現(xiàn)，40 kHz US處理可有效抑制草莓果實采后病害的發(fā)生，并改善了果實的品質(zhì)。然而，US單獨處理香梨[12]、鴨梨[13]、桃[14]等果實的保鮮效果并不理想，這可能與病原菌在這些果實中的潛伏侵染位置較深有關(guān)。近年研究結(jié)果表明，US結(jié)合誘抗劑處理可顯著改善保鮮效果。由于這些復(fù)合處理技術(shù)操作簡便，成本低廉，在果蔬采后保鮮中具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，US處理及SA結(jié)合US處理對芒果采后病害的控制作用目前尚未見報道。本研究以“貴妃”芒果果實為試驗材料，探討SA結(jié)合US處理對損傷接種C. gloeosporioides后病斑擴展的影響，以及SA結(jié)合US處理后果實體內(nèi)的防御相關(guān)酶及總酚積累的變化規(guī)律，以期為芒果采后炭疽病綜合防控提供理論依據(jù)和應(yīng)用參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試芒果果實（M. indica cv. Guifei）購自三亞市崖城鎮(zhèn)芒果園，芒果采摘后用塑料框裝好，4 h內(nèi)運回實驗室。挑選大小一致、無機械損傷、無病蟲害、成熟度一致的果實，用0.1 g/L次氯酸鈉溶液浸泡2 min，以清水沖洗后在（25±1）°C相對濕度（RH）85%～95%條件下自然晾干，備用。

炭疽菌（C. gloeosporioides）分離自發(fā)病果實，于28 ℃培養(yǎng)純化，4 ℃儲藏備用。

1.2 方法

1.2.1 果實處理方法 將芒果果實隨機分成4 組，每組40個，重復(fù)3次，按下述方法分別處理。（1）對照： 用清水浸泡10 min； （2）US處理： 將果實置于盛有8 L清水的超聲波清洗儀中， 在40 kHz、 500 W條件下處理10 min； （3）SA處理： 將果實在2 mmol/L的SA溶液[含0.05% Tween 80（V/V）]中浸泡10 min； （4）SA+US處理： 將果實置于盛有8 L 2 mmol/L SA溶液的超聲波清洗儀中，在40 kHz、500 W條件下處理10 min。將不同處理的果實各分為2組，一組用于刺傷接種，測定病斑大??；另一組用于測定相關(guān)防御酶活性及總酚含量。待果實自然晾干后，置于（25±1）°C、RH 85%～95%條件下貯藏。

1.2.2 損傷接種 各處理芒果果實在室溫下放置24 h后，進行刺傷接種。（1）挑取在PDA中培養(yǎng)7 d的炭疽菌（C. gloeosporioides），用無菌水配成1.0×106 CFU/mL的孢子懸浮液；（2）用滅菌打孔器在果實赤道線刺孔1個（深3 mm，直徑6 mm），將白色乳汁從孔中吸出后，注入20 μL孢子懸浮液；（3）將接種后的果實置于塑料保鮮盒中，并貯藏于（25±1）℃、RH 85%～95%條件中，6 d后對果實病斑擴展情況進行觀察。每處理20個果實，重復(fù)3次。

1.2.3 取樣方法 每2 d對未接種果實取樣1次，果皮和果肉組織分別用液氮速凍，于-80 ℃中保存?zhèn)溆?。每處?個果實，重復(fù)3次。

1.2.4 果肉組織相關(guān)防御酶活性及果皮總酚含量的測定 （1）苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的測定：PAL活性的測定參照Assis等[15]的方法并作部分修改。取5 g冷凍果肉組織，放入研缽中，加入5 mL 100 mmol/L硼酸緩沖液（pH8.8）[含5 mmol/L β-巰基乙醇、2 mmol/L EDTA以及4%的PVP]，在冰浴條件下研磨成勻漿，于4 ℃，12 000×g條件下離心30 min，上清液即為粗酶液。反應(yīng)液為：0.3 mL粗酶液、2.7 mL硼酸緩沖液和0.5 mL 20 mmol/L L-苯丙氨酸，以提取液為空白對照。反應(yīng)液混勻后以40 ℃水浴60 min，立即加入0.2 mL 6 mol/L HCl終止反應(yīng)，隨后測定OD290值。以每分鐘OD值變化0.001為一個酶活性單位（U），用U/（min·g FW）表示酶活性。

（2）過氧化物酶（POD）的測定：POD活性測定參考吳樣孫等[16]的方法。取5 g冷凍果肉組織，放入研缽中，加入5 mL 100 mmol/L磷酸緩沖液（pH 6.0），在冰浴條件下研磨成勻漿；于4 ℃，12 000 ×g條件下離心30 min，取上清液作為粗酶液。反應(yīng)液為：1 mL粗酶液、2 mL 50 mmol/L愈創(chuàng)木酚及0.2 mL 2% H2O2，提取液為空白對照，隨后在28 ℃的條件下測定OD470值。以每分鐘OD470值增加1表示一個酶活力單位（U），用U/（min·gFW）表示酶活性。

（3）幾丁質(zhì)酶（CHT）活性測定：CHT活性的測定參照曹建康等[17]的方法。取5 g冷凍果肉組織，放入研缽中，加入5 mL 100 mmol/L的醋酸緩沖液（pH5.2）[含1 mmol/L EDAT和5 mmol/L β-巰基乙醇]，在冰浴條件下研磨成勻漿；于4 ℃，12 000 ×g條件下離心30 min，取上清液于4 ℃透析過夜用作酶液。反應(yīng)液為：1 mL酶液和0.5 mL 10 g/L膠狀幾丁質(zhì)懸浮液，混勻后以37 ℃保溫培養(yǎng)l h，加入0.1 mL 30 g/L的脫鹽蝸牛酶，繼續(xù)在37 ℃中保溫培養(yǎng)1 h；取出后，立即加入0.2 mL 0.6 mol/L的四硼酸鉀溶液后，在沸水浴中煮3 min，然后迅速冷卻，加入2 mL用冰醋酸稀釋5倍的對二甲氨基苯甲酸（DMAB）儲備液，再次以37 ℃保溫培養(yǎng)20 min后進行顯色反應(yīng)，以蒸餾水為空白對照，測定反應(yīng)液OD585值。根據(jù)標準曲線求出樣品液中的N-乙酰葡萄糖胺的量，以每秒鐘每克芒果果實鮮重中酶分解膠狀幾丁質(zhì)產(chǎn)生的1×10-9 mol N-乙酰葡萄糖胺作為一個CHT活性單位（U），用U/（s·g FW）表示酶活性。

（4）β-1，3葡聚糖酶（GLU）活性測定：GLU 活性的測定參照 Mauch 等[18]的方法。取5 g冷凍果肉組織，放入研缽中，加入5 mL 50 mmol/L醋酸緩沖液（pH 5.2）[含1 mmol/L EDTA、5 mmol/L β-巰基乙醇和5 mmol/L抗壞血酸]，在冰浴條件下研磨成勻漿；于4 ℃，12 000×g條件下離心30 min，將上清液于4 ℃透析過夜用作酶液。反應(yīng)液為：0.2 mL酶液和0.1 mL昆布多糖（0.5%，W/V），以37 ℃保溫40 min；加入1.7 mL無菌水稀釋，再加1.5 mL 3，5-二硝基水楊酸煮沸5 min進行顯色反應(yīng)，用去離子水將溶液稀釋至25 mL，以蒸餾水為空白對照，測定反應(yīng)液OD540值，根據(jù)標準曲線求出樣品液中的還原糖量。以每秒鐘每克芒果果實鮮重中酶分解的昆布多糖產(chǎn)生的1×10-9 mol葡萄糖作為一個GLU活性單位（U），用U/（s·gFW）表示酶活性。

（5）總酚含量的測定：參照Pirie等[19]的方法。稱0.5 g果皮組織，將其與預(yù)冷的5 mL 1% HCl-CH3OH溶液充分研磨進行提取，然后于4 ℃，12 000 ×g條件下離心20 min，測定上清液OD280值。總酚含量以O(shè)D280/mg FW表示。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SAS 8.1軟件進行分析和檢驗，采用Duncan多重比較法進行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對果實炭疽病抗病性的影響

結(jié)果表明，各處理均不同程度地抑制了芒果果實損傷接種炭疽病后的病斑直徑的擴展。其中，SA+US處理的病斑直徑擴展最小，接種后第6天的病斑擴展直徑為8.64 mm，為對照的77.8%，顯著低于對照和其它處理；SA處理效果次之，其處理果實的病斑直徑顯著低于US處理和對照；US處理效果較差，與對照無顯著差異。

2.2 不同處理對果肉組織中相關(guān)防御酶活性的影響

在整個貯藏期，各處理果肉組織中的PAL活性呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，且均在第6 天時達到最大值。與對照相比，各處理明顯提高了果肉的PAL活性。其中SA+US處理的PAL活性最高，SA處理的活性次之，US處理的活性略高于對照。貯藏第6 天時，SA+US處理的果肉PAL活性高于對照35.5%，比SA、US單獨處理分別高7.7%和12.0%。

果肉組織中的POD活性均呈現(xiàn)上升的變化趨勢。其中，SA+US處理的POD活性始終高于對照及其它處理。例如，SA+US處理的果實在貯藏2～8 d的過程中，其平均POD活性較對照高46.2%，較SA、US單獨處理分別高12.4%和33.1%。

2.3 不同處理對果皮中總酚含量的影響

3 討論與結(jié)論

本試驗研究表明，芒果果實經(jīng)SA和US單獨或結(jié)合處理后，均不同程度地控制了損傷接種炭疽病后病斑的擴展，但US處理與對照相比未能達顯著性差異，而SA結(jié)合US處理明顯增強了SA或US單獨處理的效果，提高了果實的抗病性。這與SA結(jié)合US處理在其它果實上的研究結(jié)果類似[14]。

植物次生代謝在植物抗病反應(yīng)中具有非常重要的作用，其中苯丙烷類代謝途徑是一條重要的產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的途徑。PAL是苯丙烷代謝途徑的第一關(guān)鍵酶，參與植物的抗逆脅迫反應(yīng)，在植物抵御病原菌侵入的過程中起著重要作用[20]。POD是該代謝途徑末端相關(guān)的酶，其活性的升高不僅能有效地清除內(nèi)源活性氧自由基， 而且有利于植物木質(zhì)素和植保素的合成，通過使細胞壁增厚來抵御病菌的侵入和擴展從而抑制發(fā)病[21]。CHT 和GLU是2類重要的病程相關(guān)蛋白，能直接水解絕大多數(shù)真菌細胞壁的主要成分，在寄主抵御病原菌侵染過程中起著重要作用[22-23]。酚類物質(zhì)作為苯丙烷途徑的代謝產(chǎn)物，可被氧化成能對病原菌產(chǎn)生直接毒性的醌類物質(zhì)，也可以參與被侵染部位木質(zhì)素的形成，能有效抑制病原菌的擴展[24]。水楊酸作為苯丙烷代謝的中間產(chǎn)物之一，是植物防御反應(yīng)相關(guān)酶激活鏈式反應(yīng)中最重要的信號物質(zhì)。有研究表明，水楊酸能夠誘導植物產(chǎn)生抗病性，能間接增強寄主細胞壁對病原菌的抵抗能力或直接產(chǎn)生降解病原菌的酶，亦或是啟動植物的次生代謝反應(yīng)[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，SA處理可提高果實PAL、POD、CHT和GLU的活性，促進果實總酚的積累，增強芒果的抗病性。有報道表明水楊酸可誘導芒果苯丙烷代謝途徑。據(jù)報道，在枇杷[26]、甜櫻桃[27]和番茄[28]等果實上也曾有過相似的研究結(jié)果，表明SA能誘導多種水果產(chǎn)生抗病性。超聲波作為一種輔助方式，其單獨處理作用效果并不明顯，但與SA結(jié)合能顯著提高SA單獨處理的效果，這可能是超聲波的空化效應(yīng)，促使更多的水楊酸進入果實內(nèi)部，或者更有效地加強了水楊酸和果肉組織的接觸，從而增強SA的誘導抗病能力。SA結(jié)合US處理從而增強芒果果實的抗病性可能還涉及其他方面的作用機理，尚有待進一步研究。

2 mmol/L SA、US（40 kHz，500 W）單獨處理和2者結(jié)合處理均能提高芒果果實對炭疽病的抗病性，其中SA結(jié)合US處理效果最好。SA結(jié)合US處理增強了單獨SA或US處理的作用效果，提高了果肉組織中PAL、POD、CHT和GLU等防御相關(guān)酶的活性，并促進了果皮中總酚的積累，從而增強芒果果實的抗病性。以上結(jié)果表明，芒果果實抗病能力的提高與防御相關(guān)酶及總酚的積累存在明顯的相關(guān)性。水楊酸結(jié)合超聲波處理是芒果采后炭疽病防控的有效措施。

參考文獻

[1] 李 敏， 胡美姣， 高兆銀， 等. 芒果采后及貯藏生理研究進展[J]. 中國農(nóng)學通報， 2005， 21（8）： 400-403.

[2] Zhang Z K， Yang D P， Yang B， et al. β-Aminobutyric acid induces resistance of mango fruit to postharvest anthracnose caused by Colletotrichum gloeosporioides and enhances activity of fruit defense mechanisms[J]. Scientia Horticulturae， 2013 160： 78-84.

[3] 胡美姣， 李 敏， 楊鳳珍， 等. 兩種杧果炭疽病菌生物學特性的比較[J]. 西南農(nóng)業(yè)學報， 2005， 18（3）： 306-310.

[4] 胡美姣， 楊鳳珍， 張令宏， 等. 阿米西達控制杧果果實采后病害的技術(shù)[J]. 熱帶作物學報， 2004， 25（3）： 37-41.

[5] 胡美姣， 郭立佳， 劉燕霞， 等. 4種殺菌劑對杧果采后病害的控制效果[J]. 植物保護， 2005， 31（6）： 77-80.

[6] 周文澤. 化學農(nóng)藥的“過”與“功”[J]. 北京農(nóng)業(yè)， 2009（21）： 79-81.

[7] 原永兵， 曹宗巽. 水楊酸在植物體內(nèi)的作用[J]. 植物學通報， 1994， 11（3）： 1-9.

[8] 曾凱芳， 姜微波. 水楊酸處理對采后綠熟芒果炭疽病抗病性的誘導[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學學報， 2005， 10（2）： 36-40.

[9] 張永林， 杜先鋒. 超聲波及其在糧食食品工業(yè)中的應(yīng)用[J]. 西部糧油科技， 1999， 24（2）： 14-16.

[10] Piyasena P， Mohareb E， Mckellar R C. Inactivation of microbes using ultrasound： a review[J]. International Journal of Food Microbiology， 2003， 87（3）： 207-216.

[11] Cao S F， Hu Z C， Pang B， et al. Effect of ultrasound treatment on fruit decay and quality maintenance in strawberry after harvest [J]. Food Control， 2010， 21（4）： 529-532.

[12] 趙亞霞， 馮作山， 李學文. 超聲波結(jié)合MA包裝對香梨品質(zhì)和生理變化的影響[J]. 新疆農(nóng)業(yè)大學學報， 2007， 30（1）：61-63.

[13] 姚 松， 姜微波. 超聲波結(jié)合水楊酸處理對采后鴨梨抗病性影響的研究[J]. 食品科學， 2004， 25： 172-175.

[14] Yang Z F， Cao S F， Cai Y T， et al. Combination of salicylic acid and ultrasound to control postharvest blue mold caused by Penicillium expansum in peach fruit[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies， 2011， 12（3）： 310-314

[15] Assis J S， Maldonado R， Munoz T， et al. Effect of high carbon dioxide concentration on PAL activity and phenolic contents in ripening cherimoya fruit[J]. Postharvest Biology and Technology， 2001， 23（1）： 33-39.

[16] 吳樣孫， 陳一壯， 蒙信滿， 等. 水稻紋枯病抗性反應(yīng)中主要防御酶的活性變化[J]. 中國農(nóng)學通報， 2008， 24（5）： 327-330.

[17] 曹建康， 姜微波， 趙玉梅. 果蔬釆后生理生化實驗指導[M]. 北京： 中國輕工業(yè)出版社， 2007.

[18] Mauch F， Hadwiger L A， Boiler T. Ethylene： symptom， not signal for the induction of chitinase and β-1， 3- glucanase in pea pods by pathogens and elicitors[J]. Plant Physiology， 1984， 76（3）： 607-611.

[19] Pirie A， Mullins M G. Changes in anthocyanin and phenolics content of grapevine leaf and fruit tissues treated with sucrose， nitrate， and abscisic acid[J]. Plant Physiology， 1976， 58（4）： 468-472.

[20] Nicholson R L， Hammersehmidt R. Phenolic compounds and their role in disease resistance[J]. Annal Review Phytopathology， 1992， 30： 369-389.

[21] Hammersehmidt R， Nuckles E M， Kuc J. Association of enhanced peroxidase activity with induced systemic resistance of cucumber to Colletotrichun lagenarium[J]. Physiological Plant Pathology， 1982， 20（1）： 73-82.

[22] Kim Y J， Hwang B K. Isolation of a basic 34 kiloDalton β-1，3-glucanase with inhibitory activity against Phytophthora capsici from pepper stems[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology， 1997， 50（2）： 103-115.

[23] Graham L S， Sticklen M B. Plant chitinases[J]. Canadian Journal of Botany， 1994， 72（8）： 1 057-1 083.

[24] Zhang Z Z， Bi Y， Ge Y H， et al. Multiple pre-harvest treatments with acibenzolar-S-methyl reduce latent infection and induce resistance in muskmelon fruit[J]. Scientia Horticulturae， 2011， 130（1）： 126-132.

[25] Dong J， Wan G W， Liang Z S. Accumulation of salicylic acid-induced phenolic compounds and raised activities of secondary metabolic and antioxidative enzymes in Salvia miltiorrhiza cell culture[J]. Journal of Biotechnology， 2010， 148（2-3）： 99-104.

[26] 陳德碧. 水楊酸對枇杷采后品質(zhì)和衰老的影響[D]. 重慶： 西南大學， 2008.

[27] Xu X B， Tian S P. Salicylic acid alleviated pathogen-induced oxidative stress in harvested sweet cherry fruit[J]. Postharvest Biology and Technology， 2008， 49（3）， 379-385.

[28] 姜愛麗， 胡文忠， 田密霞， 等. 水楊酸處理對采后番茄果實后熟衰老的影響[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2009， 35（5）： 205-209.

責任編輯：林海妹