王賢達 林雄杰 胡菡青等

摘 要 建立柑橘黃龍?。℉LB）可視化環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）檢測方法，為HLB的快速檢測提供有力的技術(shù)支持。根據(jù)LAMP技術(shù)原理，針對柑橘黃龍病菌16S rDNA靶序列的6個位點設(shè)計4條特異性引物，通過對反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，并在反應(yīng)前的體系中加入1 ∶ 10的鈣黃綠素（calcein）和氯化錳（MnCl2）混合液作為熒光顯色劑，建立可視化LAMP檢測技術(shù)，同時對該技術(shù)的特異性、靈敏度和樣品檢測進行了測試。該檢測方法具有很高的特異性，反應(yīng)體系中除了HLB具有特異性的擴增，產(chǎn)生黃綠色熒光擴增產(chǎn)物，其他供試菌株均無特異擴增。對柑橘黃龍病菌總DNA的檢測限為1.51×10-3 ng/μL，而對含有目的基因的CG-pMD18-T質(zhì)粒DNA的檢測限為2.12×10-6 ng/μL，與定量PCR靈敏度相當，而比常規(guī)PCR靈敏度高1 000倍。利用可視化LAMP技術(shù)和定量PCR對來自漳州、南平、福州等地的樣品進行檢測，結(jié)果2種技術(shù)的檢出率均為76.7%，符合率達到100%。

關(guān)鍵詞 柑橘黃龍病菌；鈣黃綠素；環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）；可視化

中圖分類號 S436.66 文獻標識碼 A

柑橘黃龍?。–itrus Huanglongbing，HLB）是世界柑橘生產(chǎn)上的毀滅性病害，該病害是由一種限于韌皮部內(nèi)寄生的革蘭氏陰性細菌引起，能夠侵染包括柑橘屬（Citrus spp.）、枳屬（Poncirus trifoliata）、金柑屬（Fortunella spp.）和九里香（Murraya paniculata）等多種蕓香科植物[1]。柑橘感染黃龍病菌后，病害迅速蔓延，3～13年果園內(nèi)95%的植株將被感染而發(fā)病[2]；發(fā)病植株葉片大量脫落，樹勢減弱、產(chǎn)量降低、果質(zhì)變差[3]；一般，柑橘樹的經(jīng)濟壽命可達幾十年，甚至上百年，但是感染黃龍病后，柑橘樹勢衰退，經(jīng)濟壽命大大縮減，大約僅有十年左右[4]。中國有柑橘栽培的19個省、區(qū)已有11個受到嚴重的黃龍病害威脅[5]。對于黃龍病菌的培養(yǎng)，最早于20個世紀80年代就有報道[6-7]，但并未得到認可；Davis等[8]和Sechler等[9]分別通過共培養(yǎng)和純培養(yǎng)獲得病原菌，但是獲得的病原菌均無法完成繼代培養(yǎng)。對于柑橘黃龍病的防治主要采用抗生素，如四環(huán)素等，但經(jīng)過3～4年后，黃龍病癥狀出現(xiàn)反復(fù)[1]。Zhang等[10-11]報道1.0 g/L盤尼西林和100 mg/L鏈霉素混合液對黃龍病菌有很好的抑制作用，但作用效果持續(xù)時間并未得到驗證。黃龍病在防治上主要采用防治傳播媒介、砍除病樹、使用無病苗等方法實現(xiàn)對病害的控制。

柑橘黃龍病的檢測主要包括傳統(tǒng)檢測和分子生物學(xué)檢測。傳統(tǒng)檢測方法不僅耗時、耗力，且檢測結(jié)果可靠性低；分子生物學(xué)方法主要包括常規(guī)PCR、巢式PCR（nest-PCR）和定量PCR（real-time PCR）等，雖然能夠較快速、準確地檢測出病原，但需要特定的試驗儀器設(shè)備且檢測成本較高，不適宜基層檢驗檢疫部門田間大規(guī)模應(yīng)用，使田間病情無法得到及時、準確的檢測和有效的控制，嚴重阻礙了國內(nèi)柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。為加強柑橘無病苗木檢測及田間黃龍病發(fā)生動態(tài)監(jiān)測，確保福建省柑橘產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，需建立一種經(jīng)濟、簡便、快速、準確、有效的柑橘黃龍病菌檢測方法。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)是由Notomi等[12]于2000年開發(fā)的一種高效的核酸恒溫擴增方法。LAMP反應(yīng)在等溫條件下，短時間內(nèi)實現(xiàn)產(chǎn)物的大量擴增，具有很高的特異性和靈敏度，且操作步驟簡便，檢測結(jié)果可由肉眼判斷，因此更適合于基層檢驗檢疫部門開展工作。LAMP技術(shù)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用在細菌、真菌、病毒、寄生蟲檢測中，已成功建立沙門氏菌[13-14]、金黃色葡萄球菌[15-17]、鴨瘟病毒[18]、口蹄疫病毒[19-20]、惡性瘧原蟲[21-22]等LAMP檢測體系。目前，對LAMP檢測結(jié)果的分析方法主要包括肉眼觀察反應(yīng)液是否產(chǎn)生焦磷酸鎂鹽沉淀[23]、瓊脂糖凝膠電泳[24-25]及加入SYBR Green I是否發(fā)熒光來判斷[26-27]。LAMP反應(yīng)因其靈敏度高、產(chǎn)物量大的特點，使反應(yīng)過程極易受到產(chǎn)物污染而出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。采用肉眼觀察焦磷酸鎂鹽沉淀方法在焦磷酸鎂鹽沉淀濃度較低時容易誤判，而其余2種分析方法雖然結(jié)果準確、方便，但是都需要進行開蓋操作，這無疑會增加假陽性的概率。因此，筆者通過反應(yīng)前在體系中加入適量的鈣黃綠素和氯化錳，利用1 ∶ 10的鈣黃綠素和氯化錳混合液能很好的發(fā)揮熒光顯色指示作用[28-29]，從而實現(xiàn)檢測結(jié)果的可視化，同時還可有效避免反應(yīng)后由于開蓋操作而產(chǎn)生的假陽性，建立了一種柑橘黃龍病菌的可視化快速恒溫擴增檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗時間、地點 本研究田間試驗于2012年在福州新店埔黨福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所試驗基地進行，室內(nèi)試驗于2013年在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑橘黃龍病研究中心實驗室進行。

1.1.2 試驗材料 柑橘潰瘍病菌、大腸桿菌、根癌農(nóng)桿菌、亞洲梨火疫病菌、葡萄炭疽病菌等DNA樣品由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所提供；馬鈴薯晚疫病菌、大豆疫霉菌、辣椒疫霉菌、放線菌等DNA樣品由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所提供。Bst DNA Polymerase Large Fragment、10×Thermopol緩沖液購自NEB公司；鈣黃綠素、MgSO4、MnCl2、Betaine購自O(shè)mega公司；TWeen-20購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；2×SYBR Premix Ex TaqTM、rTaq DNA聚合酶、dNTPs、100 bp DNA Ladder Marker均購自TaKaRa公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GeneBank中登錄的“Ca. L. asiaticus”基因組的16s r-DNA基因序列（GeneBank： KF510119.1），利用PrimerExplorer V4在線軟件（http：//primerexplorer.jp/e/）設(shè)計外引物（F3和B3）和內(nèi)引物（FIP和BIP）；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列信息詳見表1。

1.2.2 LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件優(yōu)化 參考Xu等[30]和Bobby等[31]及LAMP反應(yīng)試劑盒推薦的體系，對反應(yīng)體系（CG-FIP/BIP、CG-F3/B3、Mg2+、dNTPs、Betaine的終濃度等）和反應(yīng)條件（反應(yīng)溫度和時間）進行優(yōu)化。CG-FIP/BIP終濃度分別為0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 μmol/L；CG-F3/B3終濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L；Mg2+終濃度分別為2、4、6、8、10 mmol/L；dNTPs終濃度分別為0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mmol/L；Betaine終濃度分別為0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mol/L；反應(yīng)溫度分別為57、59、61、63、65 ℃；反應(yīng)時間分別為10、20、30、40、50、60、70、80、90 min。每個因子設(shè)置3個重復(fù)，以確定最佳反應(yīng)體系及反應(yīng)條件。

1.2.3 LAMP特異性檢測 以柑橘黃龍病菌總DNA及柑橘潰瘍病菌、大腸桿菌、根癌農(nóng)桿菌、亞洲梨火疫病菌、葡萄炭疽病菌、馬鈴薯晚疫病菌、大豆疫霉菌、辣椒疫霉菌、放線菌等參試菌株的DNA為模板，以健康葉片總DNA為陰性對照、ddH2O為空白對照，采用優(yōu)化后的反應(yīng)體系及條件進行LAMP反應(yīng)，檢測可視化LAMP方法的特異性。反應(yīng)結(jié)果分別通過肉眼觀察和1%瓊脂凝膠電泳進行分析。

1.2.4 LAMP靈敏度檢測

（1）基因組DNA檢測靈敏度。參照試劑盒的方法，提取染病柑橘中脈總DNA，用超微量分光光度計（NanoDrop）測定總DNA濃度，取1 μL DNA按照10倍進行梯度稀釋（100～10-9），為了避免稀釋過程中出現(xiàn)誤差，每個梯度分別重復(fù)3次，再將每個梯度的3個重復(fù)混合，取1 μL作為模板，進行LAMP靈敏度檢測。

（2）LAMP與普通PCR、定量PCR靈敏度比較。利用CG03F/CG05R引物擴增含有目的基因的DNA片段[32]，回收純化PCR產(chǎn)物，并連接到pMDTM18-T載體上，構(gòu)建CG-pMD18-T重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆子進行擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，用超微量分光光度計（NanoDrop）測定質(zhì)粒DNA濃度，并進行10倍梯度稀釋（100～10-9），方法同上。定量PCR和普通PCR的引物均為LAMP的外引物（F3/B3）。常規(guī)PCR反應(yīng)體系：2×Mix 12.5 μL、CG-F3/B3 1 μL、模板1 μL，加ddH2O補足至25 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃ 3 min，95 ℃ 35 s，58 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，擴增32個循環(huán)，72 ℃ 7 min。反應(yīng)產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳分析。定量PCR反應(yīng)體系：2×SYBR Premix ExTMⅡ 12.5 μL、5 μmol/L CG-F3/B3引物各 1 μL、模板DNA 1 μL，加ddH2O補足到25 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃ 35 s，95 ℃ 5 s，58 ℃ 35 s，擴增42個循環(huán)，58 ℃同步采集熒光；溶解曲線為65 ℃開始，每隔5 s升高0.5 ℃，連續(xù)升高60次至95 ℃結(jié)束。以上試驗均設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.5 樣品檢測 從福建漳州、南平、福州等地采集柑橘黃龍病疑似病例的蘆柑葉片30份，洗凈后置于4 ℃冰箱短期保存；剪取蘆柑葉片中脈0.5 g，剪碎后用液氮磨成粉末，用CTAB法提取蘆柑葉中脈總DNA：細粉加入CTAB提取液，混勻后65 ℃水浴1 h，12 000 r/min離心10 min，取上清，加入等體積氛 ∶ 氯仿 ∶ 異戊醇（25 ∶ 24 ∶ 1）提純，無水乙醇沉淀，將沉淀風(fēng)干后溶于30 μL TE（含RnaseA 50 μg/mL）中，沉淀溶解后置于-20 ℃保存、備用。

分別采用可視化LAMP和定量PCR檢測，比較2種檢測結(jié)果的檢出率和2個檢測結(jié)果間的符合率，以驗證LAMP技術(shù)的實際應(yīng)用效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件優(yōu)化

2.1.2 反應(yīng)條件優(yōu)化

（2）反應(yīng)時間。如圖2-c、d所示，當反應(yīng)時間為30 min時，可以觀察到反應(yīng)液顏色由橙色變?yōu)榫G色，且瓊脂糖凝膠電泳檢測可見明顯的梯度條帶；當反應(yīng)時間為70 min時，反應(yīng)液顏色變化非常明顯，且電泳條帶也非常的清晰，為了提高試驗效率，故確定反應(yīng)時間為70 min。

2.2 LAMP特異性檢測

2.3 LAMP靈敏度檢測

3 討論與結(jié)論

LAMP是一種在恒溫條件下，高效、特異、快速的擴增靶標序列的核酸擴增技術(shù)。本研究在柑橘黃龍病菌16S r-DNA基因序列的6個位點設(shè)計4條引物。通過對反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行優(yōu)化，建立了可視化LAMP檢測方法。該方法對柑橘黃龍病菌總DNA及其他參試菌株DNA進行特異性檢測，結(jié)果表明該可視化LAMP具有良好的特異性。對柑橘黃龍病總DNA和質(zhì)粒DNA的最低檢測限分別為1.51×10-3 ng/μL和2.12×10-6 ng/μL，與定量PCR靈敏度相當，而比常規(guī)PCR靈敏度高1 000倍。采用該方法對田間樣品進行實測，檢測結(jié)果和real-time PCR檢測結(jié)果完全一致。

熒光顯色劑的應(yīng)用使LAMP檢測結(jié)果可視化得以實現(xiàn)。目前，在熒光顯色劑應(yīng)用的研究中多數(shù)采用SYBR Green I[33-34]，該方法需在反應(yīng)結(jié)束后打開蓋子，加入SYBR Green I才能發(fā)揮顯色指示作用，從而判定檢測結(jié)果。黃麗等[34]在柑橘黃龍病LAMP檢測中，利用SYBR Green I指示作用實現(xiàn)了LAMP檢測結(jié)果的可視化。但是，開蓋添加SYBR Green I時容易產(chǎn)生氣溶膠，而引起擴增產(chǎn)物污染實驗室，導(dǎo)致假陽性出現(xiàn)?？椎掠⒌萚35]在柑橘黃龍病LAMP檢測中使用濁度儀實時監(jiān)測LAMP反應(yīng)結(jié)果，但該方法在實際操作中要使用價格昂貴的濁度儀，不利于實驗設(shè)備較落后的實驗室的科研人員開展工作。筆者利用calcein與Mn2+結(jié)合而不發(fā)熒光，隨著反應(yīng)的進行，產(chǎn)生了大量更易與Mn2+結(jié)合的焦磷酸根離子，從而釋放calcein，游離的calcein可自發(fā)熒光，且Mg2+存在的環(huán)境中熒光效果得到加強[28，36]的原理，使用calcein+MnCl2混合液替代SYBR Green I進行結(jié)果顯色指示，無需開蓋，直接通過肉眼觀察顏色變化即可判定檢測陰（橙色）陽（綠色）性結(jié)果，實現(xiàn)了檢測結(jié)果的可視化，同時有效地避免了因開蓋引起反應(yīng)產(chǎn)物污染而出現(xiàn)的假陽性現(xiàn)象。該方法在柑橘黃龍病可視化LAMP檢測中的應(yīng)用尚屬首次，為柑橘黃龍病的檢測工作提供了有力的技術(shù)支持。

雖然本研究在柑橘黃龍病可視化LAMP檢測中獲得了比較的好結(jié)果，但是在反應(yīng)體系和反應(yīng)條件優(yōu)化等方面還存在一些不足。應(yīng)采用更加科學(xué)合理的方法（正交試驗）等進行進一步優(yōu)化。由于在對可視化LAMP結(jié)果的評價中無法對其反應(yīng)結(jié)果進行量化，因此要采用正交試驗設(shè)計比較困難。在今后的研究中重點要解決如何將可視化LAMP的結(jié)果進行量化，從而更加明確反應(yīng)體系中各組分對反應(yīng)結(jié)果的影響。

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