張義　陽(yáng)江華　梁?jiǎn)⒏！√瞥瘶s

摘 要 利用DSN（duplex-specific nuclease）技術(shù)構(gòu)建膠乳均一化cDNA酵母表達(dá)文庫(kù)，為大規(guī)模文庫(kù)篩選實(shí)驗(yàn)和發(fā)掘重要的低豐度表達(dá)基因，以及研究橡膠樹(shù)膠乳中蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹(shù)；膠乳；均一化cDNA；酵母表達(dá)文庫(kù)

中圖分類號(hào) S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

橡膠樹(shù)的產(chǎn)量形成涉及到各種復(fù)雜的生理生化及分子調(diào)控機(jī)理，其中包括了大量與產(chǎn)膠排膠相關(guān)的蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系。研究這些相互作用關(guān)系將有助于揭示橡膠樹(shù)產(chǎn)量形成的分子調(diào)控機(jī)理。酵母雙雜交技術(shù)是研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用關(guān)系的有效工具[2]，構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA酵母表達(dá)文庫(kù)是該技術(shù)成功應(yīng)用的關(guān)鍵[3]。前期研究構(gòu)建了酵母單雜交文庫(kù)（未發(fā)表），篩庫(kù)后得到了大量的假陽(yáng)性克隆，其中高達(dá)50%的假陽(yáng)性克隆是Hevein、Rubber abundant protein、Rubber elongation factor（REF）、Small rubber particle protein（SRPP）、Ribosomal protein等膠乳中高豐度表達(dá)的基因[4]。大量假陽(yáng)性克隆增加了后續(xù)鑒定工作的難度，甚至導(dǎo)致整個(gè)實(shí)驗(yàn)失敗。為解決這一問(wèn)題，采取降低文庫(kù)中高豐度表達(dá)基因的相對(duì)比例，即構(gòu)建膠乳均一化cDNA酵母表達(dá)文庫(kù)。

已知的均一化cDNA文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)可分為3種策略。其一是利用基因組DNA上功能基因拷貝數(shù)的相對(duì)均一化性質(zhì)，通過(guò)cDNA與基因組DNA飽和雜交降低高豐度基因在文庫(kù)中的比例。曾日中等[5]利用此策略構(gòu)建了膠乳均一化全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，均一化處理后，占膠乳轉(zhuǎn)錄本30%的REF和SRPP基因豐度降低了約1 000倍。其二是基于寡核苷酸指紋圖譜法的均一化技術(shù)[6-7]，使用上百種標(biāo)記的寡核苷酸探針與來(lái)自原始cDNA文庫(kù)中上萬(wàn)個(gè)克隆的DNA分別進(jìn)行芯片雜交，然后對(duì)所有克隆的雜交結(jié)果進(jìn)行聚類分析，從而剔除相同克隆實(shí)現(xiàn)均一化。其三是復(fù)性式均一化技術(shù)[8-9]，該技術(shù)基于復(fù)性動(dòng)力學(xué)理論，變性的單鏈DNA或mRNA分子，其濃度越大，復(fù)性時(shí)消失速度也越快。通過(guò)變性及復(fù)性操作，隨著復(fù)性時(shí)間的延長(zhǎng)，體系內(nèi)各種單鏈cDNA或mRNA的濃度將趨于一致，再把均一化的單鏈cDNA或mRNA分離出來(lái)，從而構(gòu)建均一化的cDNA文庫(kù)。比較而言，第一種策略通常需要構(gòu)建DNA 固定化親和體系，對(duì)cDNA進(jìn)行親和雜交，實(shí)驗(yàn)成本較高，步驟多，對(duì)技術(shù)掌握要求較高。同時(shí)，低豐度表達(dá)基因可能會(huì)因cDNA豐度太低而未被雜交。第二種策略工作量大，設(shè)備試劑要求高，自動(dòng)化程度要求高，比較昂貴。而第三種策略可以利用雙鏈特異性核酸酶（DSN）來(lái)降解復(fù)性后體系中的雙鏈cDNA，留下豐度較為一致的各種單鏈cDNA分子[10]。再以此為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，得到大量豐度比較一致的雙鏈cDNA分子。由此可知，DSN技術(shù)簡(jiǎn)單快速，成本低，處理步驟少，容易掌握，文庫(kù)質(zhì)量也更為可靠。因此，DSN 技術(shù)已廣泛應(yīng)用在擬南芥、大麥、棉花、水稻、木薯、大豆和香蕉等植物的均一化cDNA文庫(kù)構(gòu)建中[11]。本研究利用DSN技術(shù)構(gòu)建膠乳均一化cDNA酵母表達(dá)文庫(kù)，從而有利于進(jìn)行大規(guī)模文庫(kù)篩選實(shí)驗(yàn)和發(fā)掘重要的低豐度表達(dá)基因，為研究橡膠樹(shù)膠乳中蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

巴西橡膠樹(shù)無(wú)性系熱研7-33-97，定植于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場(chǎng)二隊(duì)，采用S/2 d3不刺激割制。GenEluteTM mRNA Miniprep Kit購(gòu)自Sigma aldrich公司；Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System購(gòu)自Clontech公司；DSN購(gòu)自Evrogen JSC 公司。

1.2 方法

1.2.1 橡膠樹(shù)膠乳總RNA提取 膠乳中總RNA提取采用本實(shí)驗(yàn)室的改良方法[12]，利用GenEluteTM mRNA Miniprep Kit試劑盒純化mRNA。

1.2.2 SMART cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 利用Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System試劑盒構(gòu)建cDNA文庫(kù)。首先取0.1 μg膠乳mRNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到兩端分別帶有接頭的第一鏈cDNA，然后取1 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用試劑盒內(nèi)的引物5′ PCR Primer和3′ PCR Primer對(duì)其進(jìn)行LD-PCR（Long Distance PCR），總體系50 μL。反應(yīng)程序：98 ℃變性10 s，68 ℃退火及延伸6 min，18個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后取7 μL的PCR產(chǎn)物，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 cDNA文庫(kù)均一化處理 采用Clontech公司的CHROMA SPIN+TE-400 columns純化上述PCR產(chǎn)物。乙醇和醋酸鈉沉淀后，用滅過(guò)菌的Mini-Q水溶解，調(diào)整其濃度為100 ng/μL。參考Trimmer-Director Kit（Evrogen，Cat.No.NK002）的操作說(shuō)明書(shū)及張石柱等[13]的方法，取1 μL cDNA，加入1 μL雜交緩沖液[200 mmol/L HEPES（pH為7.5），2 mol/L NaCl，0.8 mmol/L EDTA]、2 μL Mini-Q水，1滴礦物油。98 ℃變性3 min，68 ℃復(fù)性5 h后，加入5 μL 68 ℃預(yù)熱的2×DSN buffer[100 mmol/L TrisHCl（pH8.0），10 mmol/L MgCl2，2 mmol/L dithio-threitol]，最后加入0.5 U DSN，用酶溶劑補(bǔ)足至10 μL。68 ℃處理20 min，加入10 μL 5 mmol/L EDTA終止反應(yīng)。

取1 μL上述反應(yīng)的混合物作為模板，用5′ PCR Primer和3′ PCR Primer重新對(duì)其進(jìn)行LD-PCR，50 μL體系。同上反應(yīng)條件，但15個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后取7 μL PCR產(chǎn)物，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 cDNA文庫(kù)質(zhì)量鑒定 半定量PCR檢測(cè)均一化效果。橡膠延伸因子（REF）[14]為膠乳中高豐度表達(dá)基因，理論上均一化后其豐度應(yīng)該降低；而HbSUT3[15]為膠乳低豐度或中等豐度表達(dá)基因，均一化后豐度升高或不變。取等量（約10 ng）均一化前后cDNA作為模板，分別擴(kuò)增REF基因和HbSUT3來(lái)檢測(cè)均一化效果。REF基因上游引物為P3：5′-CGATTATGGCTGAAGACGAA-3′，下游引物為P4：5′-CAAACGAAAACATAGTCTCAACAC-3′，退火溫度為58 ℃，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為500 bp，12個(gè)循環(huán)。HbSUT3上游引物為P5：5′-CAAATCCGACCC

AACTATGTAC-3′，下游引物為P6：5′-GCAGCAT

AACCGATAAGG-3′，退火溫度58 ℃，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為500 bp，22個(gè)循環(huán)。

1.2.5 cDNA酵母表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建 參照Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System說(shuō)明書(shū)，制作Y187感受態(tài)細(xì)胞。取4 μg均一化cDNA和3 μg線性化酵母表達(dá)質(zhì)粒pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)化Y187菌株，涂布190個(gè)直徑12 cm的SD/-Leu固體培養(yǎng)基平板。同時(shí)分別取稀釋了10、100、1 000倍的轉(zhuǎn)化液100 μL涂布SD/-Leu固體培養(yǎng)基平板，用于計(jì)算文庫(kù)總?cè)萘亢徒湍皋D(zhuǎn)化效率。

文庫(kù)總?cè)萘?平板上的菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×轉(zhuǎn)化液總體積/（100 μL）；酵母轉(zhuǎn)化效率=文庫(kù)總?cè)萘?（3 μg）。 平板于30 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d后，用YPDA液體培養(yǎng)基收集平板上所有的菌體，調(diào)整好菌濃度至107 cfu/mL以上（可用分光光度計(jì)估測(cè)菌濃度，OD600=1時(shí)，菌濃度約為1×107 cfu/mL），然后分裝在終濃度為25%的甘油中-80 ℃保存。

1.2.6 cDNA酵母表達(dá)文庫(kù)滴度檢測(cè) 各取稀釋了1 000、10 000、100 000倍的文庫(kù)樣品100 μL，分別涂布于SD/-Leu固體培養(yǎng)基平板上。30 ℃培養(yǎng)3 d后計(jì)數(shù)白色菌落數(shù)，并計(jì)算文庫(kù)滴度。

文庫(kù)滴度=平板上菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)/菌液體積。

1.2.7 酵母表達(dá)文庫(kù)重組率的鑒定 隨機(jī)挑取48個(gè)克隆進(jìn)行菌落平均插入片段及重組率的鑒定。PCR反應(yīng)條件為：98 ℃變性10 s，68 ℃退火及延伸6 min，共30個(gè)循環(huán)。菌落PCR上游引物為P7：5′-ATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAA-3′，下游引物為P8：5′-ACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCT

ACGA-3′。

重組率=插入片段大于400 bp的反應(yīng)個(gè)數(shù)/反應(yīng)總數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 均一化cDNA文庫(kù)的構(gòu)建

均一化前后的cDNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示（圖1），cDNA大小主要集中在0.5 kb到3 kb之間。均一化處理前cDNA泳道中有一些高亮度的特異性條帶（箭頭所示），均一化后的cDNA呈現(xiàn)為均勻的彌散條帶（圖1）。利用RT-PCR進(jìn)一步分析均一化處理的效果，結(jié)果顯示（圖2）：均一化前后22個(gè)PCR循環(huán)均能擴(kuò)增出明顯的HbSUT3條帶，且亮度相近，表明均一化對(duì)低豐度表達(dá)基因無(wú)明顯影響；但對(duì)高豐度表達(dá)REF的基因而言，均一化處理后的效果很明顯，處理前12個(gè)循環(huán)能擴(kuò)增出明顯的條帶，但處理后12個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增檢測(cè)不到產(chǎn)物，表明均一化處理后REF基因的豐度大大降低。

2.2 cDNA酵母表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建

用于統(tǒng)計(jì)文庫(kù)容量及酵母轉(zhuǎn)化效率所涂的3個(gè)梯度稀釋培養(yǎng)皿中，稀釋100倍的培養(yǎng)皿上長(zhǎng)了270個(gè)菌落。稀釋10倍所涂的培養(yǎng)皿上菌落過(guò)于密集不便計(jì)數(shù)，而稀釋1 000倍所涂的培養(yǎng)皿上菌落數(shù)較少，統(tǒng)計(jì)結(jié)果可能誤差較大。所以筆者以稀釋100倍所涂培養(yǎng)皿上生長(zhǎng)的菌斑數(shù)量來(lái)計(jì)算庫(kù)容量及轉(zhuǎn)化效率。庫(kù)容量為270×100×（15 mL/100 μL）≈4×106 cfu，酵母的轉(zhuǎn)化效率為4×106 cfu/3μg≈1.3×106 cfu/μg。用于檢測(cè)cDNA與酵母表達(dá)質(zhì)粒的重組效率而隨機(jī)挑選的48個(gè)菌落中，只有2個(gè)克隆為空載。所以重組率為46/48×100%≈96%，插入片段平均大小在1 kb以上（圖3）。用于統(tǒng)計(jì)文庫(kù)滴度所涂的3個(gè)梯度稀釋培養(yǎng)皿中，只有稀釋100 000倍后所涂平板上的菌落數(shù)便于統(tǒng)計(jì)，菌落數(shù)量為350個(gè)，所以文庫(kù)滴度為350×100 000/100 μL=3.5×108 cfu/mL。

3 討論與結(jié)論

筆者用DSN技術(shù)處理cDNA后，REF基因的豐度大幅下降。以均一化前的cDNA為模板擴(kuò)增REF基因，經(jīng)12個(gè)循環(huán)擴(kuò)增后就可以得到較亮的條帶，而以等量的均一化后的cDNA為模板擴(kuò)增REF基因，經(jīng)12個(gè)循環(huán)擴(kuò)增后電泳無(wú)法檢測(cè)到目的條帶（圖2），23個(gè)擴(kuò)增循環(huán)后才可見(jiàn)比較亮的條帶（亮度仍然沒(méi)有以均一化前12個(gè)循環(huán)擴(kuò)增所得到的條帶亮）。根據(jù)不同擴(kuò)增循環(huán)數(shù)電泳條帶亮度變化，將REF基因的半定量擴(kuò)增引物效率估算為1.9，則均一化處理后，REF基因的豐度下降了1.911以上，即均一化處理后膠乳cDNA中的高豐度表達(dá)基因的豐度下降了1 000倍以上，這與曾日中[5]的cDNA文庫(kù)均一化效果相近，說(shuō)明均一化效果很好。

目前市場(chǎng)上還沒(méi)有商品化的橡膠樹(shù)cDNA酵母表達(dá)文庫(kù)出售。鄧治等[16]用SMART方法構(gòu)建了橡膠樹(shù)膠乳cDNA酵母表達(dá)文庫(kù)，并以HbMybl為誘餌，從膠乳cDNA文庫(kù)中篩選到10個(gè)與HbMyb1可能有相互作用的克隆，其中包括REF和SRPP?？紤]到REF基因和SRPP基因占膠乳總mRNA的30%左右[5]，筆者推測(cè)這2個(gè)基因可能是假陽(yáng)性克隆，與本實(shí)驗(yàn)室的酵母單雜交實(shí)驗(yàn)中大量假陽(yáng)性克隆結(jié)果一致。若利用本研究所構(gòu)建的均一化cDNA酵母表達(dá)文庫(kù)，可能避免出現(xiàn)過(guò)多的假陽(yáng)性結(jié)果。

本研究結(jié)合了SMART和DSN技術(shù)，構(gòu)建了高質(zhì)量的橡膠樹(shù)膠乳均一化cDNA酵母表達(dá)文庫(kù)。文庫(kù)中有cDNA插入片段的重組克隆比例高，插入片段較長(zhǎng)，同時(shí)高豐度表達(dá)基因在文庫(kù)中的比例被降低了約1 000倍。該文庫(kù)用于酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)將大大提高酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)的成功率，為研究橡膠樹(shù)乳管細(xì)胞中蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用關(guān)系、篩選重要蛋白的互作調(diào)控蛋白奠定基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯：趙軍明