魏愛(ài)民 杜勝利 韓毅科 劉楠

摘 要： 為了建立一種直接獲得轉(zhuǎn)基因純系的轉(zhuǎn)化方法，首次開(kāi)展了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黃瓜未受精子房培養(yǎng)遺傳轉(zhuǎn)化體系研究。試驗(yàn)以除草劑草胺膦為選擇標(biāo)記，胚胎發(fā)生階段，最適除草劑質(zhì)量濃度為0.5～1.0 mg·L-1，幼苗生根階段除草劑質(zhì)量濃度為2.0 mg·L-1；以羧芐青霉素為抑菌劑，最適抑菌質(zhì)量為450 mg·L-1；最佳浸染方法為OD600=0.3農(nóng)桿菌工程菌，浸染10 min；共培養(yǎng)時(shí)間為3 d；在浸染菌液和共培養(yǎng)基中加入0.01% 的silwet-77，有利于獲得較多抗性胚胎及抗性植株。該遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，為黃瓜轉(zhuǎn)基因方法研究開(kāi)辟了新途徑。

關(guān)鍵詞： 黃瓜； 未受精子房； 農(nóng)桿菌； 轉(zhuǎn)化體系

黃瓜是我國(guó)人民喜食的蔬菜之一，消費(fèi)量大，種植面積廣。近年，隨著人民生活水平的提高，對(duì)黃瓜新品種提出了更高要求。由于黃瓜遺傳基礎(chǔ)狹窄，依靠現(xiàn)有材料很難選育出商品性、抗病性、品質(zhì)性狀等方面均具有突破性的新品種?；蚬こ谭椒梢詣?chuàng)造性地獲得新材料，特別是通過(guò)常規(guī)育種方法不能獲得的育種新材料?；蚬こ碳夹g(shù)在水稻品種改良上得到了廣泛的應(yīng)用，我國(guó)已成功選育了抗蟲(chóng)、抗除草劑、抗病、養(yǎng)分高效、耐鹽和高產(chǎn)等一系列轉(zhuǎn)基因水稻品系/組合[1]。

黃瓜轉(zhuǎn)基因研究開(kāi)始于上世紀(jì)90年代，研究者對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了大量研究，應(yīng)用較多的轉(zhuǎn)化方法主要為：以體細(xì)胞再生體系為基礎(chǔ)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法[2-4]、花粉管通道法[5-6]，研究者已對(duì)黃瓜抗病[7]、抗蟲(chóng)[8]、抗逆[9]、品質(zhì)[10]、產(chǎn)量[4]等相關(guān)性狀基因進(jìn)行目的基因轉(zhuǎn)化研究。但上述轉(zhuǎn)基因研究中存在轉(zhuǎn)化率低、基因型差異明顯、轉(zhuǎn)化體多為嵌合體、多代篩選才能獲得抗性純合株系、重復(fù)性差等問(wèn)題。目前，黃瓜的轉(zhuǎn)基因研究尚未應(yīng)用于育種實(shí)踐。

黃瓜未受精子房培養(yǎng)技術(shù)已獲得成功，并進(jìn)行育種應(yīng)用[11]。該方法通過(guò)離體培養(yǎng)未受精子房，誘導(dǎo)離體雌核發(fā)育，并自然加倍形成雙單倍體植株，直接獲得性狀純合的育種材料，育種效率大幅提高，最高離體雌核胚胎發(fā)生頻率為85%，植株再生頻率為25%。本研究擬應(yīng)用黃瓜未受精子房培養(yǎng)技術(shù)體系，進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法研究，旨在建立一種直接獲得轉(zhuǎn)基因純系的轉(zhuǎn)化方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 黃瓜未受精子房培養(yǎng)高再生頻率基因型材料W6。

1.1.2 載體及菌株 質(zhì)粒載體：pCAMBIA3301，含有抗除草劑Bar基因。農(nóng)桿菌工程菌株：含質(zhì)粒載體的EHA105農(nóng)桿菌工程菌。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)化方法 采集開(kāi)花前2～3 d的黃瓜未受精子房，用70%酒精表面滅菌后，再用10%次氯酸鈉滅菌15～20 min，無(wú)菌水沖洗4次，無(wú)菌條件下，將幼嫩子房自頂部中心部位縱切或橫切若干小塊，備用。向OD值為0.2～0.5的稀釋農(nóng)桿菌工程菌液（經(jīng)過(guò)2次搖菌后收集離心沉淀物重懸）中加入AS 50～100 [μ]mol·L-1、silwet-77等，浸染未受精子房5～20 min，期間不停搖動(dòng)，使菌液與外植體充分接觸。以無(wú)菌濾紙充分吸干外植體表面殘存菌液，平放入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，黑暗中共培養(yǎng)1～4 d，之后轉(zhuǎn)接至含除草劑的選擇培養(yǎng)基中，抗性芽高于1.5 cm時(shí)，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基使其長(zhǎng)成完整植株。

采用MS基本培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g·L-1，瓊脂6 g·L-1，pH 5.8；外植體置于組培室內(nèi)培養(yǎng)，溫度25～27 ℃，光/暗為16 h/8 h。外植體不同培養(yǎng)階段使用的培養(yǎng)基為：（1）誘導(dǎo)培養(yǎng)基（共培養(yǎng)培養(yǎng)基）：MS+BA 0.5～1.0 mg·L-1；（2）抗性胚胎選擇培養(yǎng)基：MS+ BA 0.5～2.0 mg·L-1+除草劑 0.5～1.0 mg·L-1+羧芐青霉素 450 mg·L-1；（3）生根培養(yǎng)基：1/2MS+除草劑 2.0 mg·L-1+羧芐青霉素 450 mg·L-1。

1.2.2 除草劑質(zhì)量濃度的確定 胚胎誘導(dǎo)階段除草劑篩選質(zhì)量濃度的確定：在黃瓜未受精子房培養(yǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0 mg·L-1的除草劑，比較其對(duì)未受精子房培養(yǎng)胚胎發(fā)生的影響，確定以除草劑進(jìn)行轉(zhuǎn)化體篩選的臨界濃度。再生植株生根階段除草劑篩選質(zhì)量濃度的確定：將11 d苗齡的無(wú)菌苗，剪掉根系扦插于含有不同濃度除草劑的生根培養(yǎng)基中，研究除草劑濃度對(duì)幼苗生根的影響，確定以除草劑進(jìn)行轉(zhuǎn)基因再生小植株篩選的臨界濃度。

1.2.3 不同質(zhì)量濃度抗生素對(duì)黃瓜未受精子房胚胎發(fā)生的影響 在黃瓜未受精子房培養(yǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0、150、300、450、600 mg·L-1的羧芐青霉素，比較其對(duì)未受精子房培養(yǎng)胚胎發(fā)生的影響，確定農(nóng)桿菌浸染后適宜的抑菌濃度。

1.2.4 影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的未受精子房遺傳轉(zhuǎn)化體系的因素研究 （1）農(nóng)桿菌浸染方法研究：比較不同菌液濃度、浸泡時(shí)間等因素對(duì)未受精子房浸染后農(nóng)桿菌抑菌效果的影響。（2）浸染菌液中添加不同濃度的silwet-77對(duì)轉(zhuǎn)化體系胚胎及植株再生的影響：浸染菌液中添加濃度為0、0.01%、0.05% 的silwet-77，比較其對(duì)黃瓜未受精子房培養(yǎng)遺傳轉(zhuǎn)化體系胚胎及植株再生的影響。（3）共培養(yǎng)不同時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化體系胚胎及植株再生的影響：分別比較共培養(yǎng)2、3、4 d 對(duì)黃瓜未受精子房培養(yǎng)遺傳轉(zhuǎn)化體系胚胎及植株再生的影響。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 除草劑質(zhì)量濃度、抗生素抑菌質(zhì)量濃度的確定試驗(yàn)，每個(gè)處理浸染30個(gè)子房，3次重復(fù)；幼苗生根階段除草劑質(zhì)量濃度試驗(yàn)，每處理4株幼苗，3次重復(fù)；農(nóng)桿菌浸染方法研究每處理3次重復(fù)，每處理共100個(gè)子房；共培養(yǎng)時(shí)間、silwet-77對(duì)轉(zhuǎn)化體系的影響比較試驗(yàn)，每處理100個(gè)子房，未做重復(fù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。數(shù)據(jù)計(jì)算公式：

胚胎發(fā)生率/%= 發(fā)生胚胎（抗性胚胎）數(shù)/接種子房數(shù)×100

植株再生率/%= 再生抗性植株數(shù)/接種子房數(shù)×100

生根率/%=生根植株數(shù)/幼苗數(shù)×100

萎蔫率/%=萎蔫株數(shù)/幼苗數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 未受精子房培養(yǎng)遺傳轉(zhuǎn)化體系除草劑質(zhì)量濃度的確定

2.1.1 胚胎誘導(dǎo)階段除草劑質(zhì)量濃度的確定 由表1可見(jiàn)：黃瓜未受精子房對(duì)除草劑比較敏感，較低濃度即可明顯抑制未受精子房胚胎發(fā)生，隨著除草劑質(zhì)量濃度升高，胚胎發(fā)生頻率呈明顯下降趨

勢(shì)。當(dāng)除草劑質(zhì)量濃度為0.50 mg·L-1時(shí)，胚胎發(fā)生率為18.9%，顯著低于對(duì)照；當(dāng)除草劑質(zhì)量濃度高于1.00 mg·L-1即不能誘導(dǎo)胚胎發(fā)生。因此確定除草劑質(zhì)量濃度0.50～1.00 mg·L-1之間，作為篩選除草劑抗性胚胎的臨界濃度。

2.1.2 再生植株生根過(guò)程除草劑篩選質(zhì)量濃度的確定 從表2可見(jiàn)：隨著除草劑質(zhì)量濃度的加大，植株生根及根生長(zhǎng)受到明顯抑制。當(dāng)除草劑質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，生根率較高，沒(méi)有萎蔫植株；當(dāng)除草劑質(zhì)量濃度為2.0 mg·L-1時(shí)，生根率僅為33.3%，根長(zhǎng)為0.3～1.0 cm，萎蔫死亡植株率為75.0%，此時(shí)，生根率低，萎蔫率高，明顯低于或高于50%的臨界標(biāo)準(zhǔn)。高于2.5 mg·L-1時(shí)，生根率下降明顯，萎蔫率保持高值。因此確定幼苗期除草劑抗性植株篩選質(zhì)量濃度為2.0 mg·L-1。

2.2 不同質(zhì)量濃度抗生素對(duì)黃瓜未受精子房胚胎發(fā)生的影響

羧芐青霉素是黃瓜轉(zhuǎn)基因研究中常用的脫菌劑，初期抑菌質(zhì)量濃度常為200～300 mg·L-1。誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入羧芐青霉素，會(huì)對(duì)黃瓜未受精子房培養(yǎng)胚胎發(fā)生產(chǎn)生影響。當(dāng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入抗生素質(zhì)量濃度低于450 mg·L-1時(shí)，未受精子房胚胎發(fā)生率略低于對(duì)照，當(dāng)高于600 mg·L-1時(shí)，胚胎發(fā)生率顯著下降，與其他組分處理差異顯著（表3）。為了能有效抑菌而又不影響胚胎發(fā)生，因此在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黃瓜未受精子房培養(yǎng)遺傳轉(zhuǎn)化研究中適宜的抑菌質(zhì)量濃度為450 mg·L-1。

2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黃瓜未受精子房培養(yǎng)遺傳轉(zhuǎn)化體系的初步建立

2.3.1 農(nóng)桿菌浸染方法研究 以未受精子房為外植體進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化研究時(shí)，由于未受精子房壁體細(xì)胞組織在培養(yǎng)初期即發(fā)生體細(xì)胞凋亡，生命力衰退，易被農(nóng)桿菌感染，導(dǎo)致抑菌困難。針對(duì)該技術(shù)難題，本實(shí)驗(yàn)比較了菌液濃度、浸染時(shí)間的不同組合對(duì)未受精子房浸染后，抑菌效果及胚胎發(fā)生的影響（表4）。

從表4可見(jiàn)，當(dāng)浸染菌液濃度較低時(shí)（OD600=0.3），浸染的未受精子房接種后污染率明顯低于高濃度浸染菌液（OD600=0.6）；其中，浸染液濃度為OD600=0.3，浸染10 min時(shí)，污染率明顯低于同濃度菌液浸染外植體20 min，為22%。當(dāng)浸染菌液濃度較低時(shí)（OD600=0.3），胚胎發(fā)生率高于高濃度浸染菌液（OD600=0.6）；其中，浸染液濃度為OD600=0.3，浸染10 min時(shí)，胚胎再生率明顯高于高濃度浸染菌液（OD600=0.6），為39.7%。因此，確定以農(nóng)桿菌工程菌OD600=0.3，浸染10 min作為轉(zhuǎn)化的基本方法。

2.3.2 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響 農(nóng)桿菌菌液浸染未受精子房后，共培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短，直接影響獲得轉(zhuǎn)化體數(shù)量的多少，以及抗生素抑菌效果。試驗(yàn)分別比較了共培養(yǎng)2、3、4 d對(duì)黃瓜未受精子房培養(yǎng)胚胎及植株再生的影響。

結(jié)果表明（表5）：隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，除草劑抗性篩選過(guò)程抑菌難度逐漸加大。共培養(yǎng)4 d時(shí)，外植體污染率為80%，明顯高于共培養(yǎng)2、3 d時(shí)，且未獲得再生胚胎。共培養(yǎng)2、3 d時(shí)，外植體污染率、胚胎發(fā)生率、植株再生率均無(wú)較大差異；其中，共培養(yǎng)3 d時(shí)，胚胎、植株再生率略高于共培養(yǎng)2 d時(shí)的結(jié)果?？紤]到較長(zhǎng)的共培養(yǎng)時(shí)間可能有利于外源基因轉(zhuǎn)化，因此以共培養(yǎng)3 d為好。

2.3.3 菌液中加入表面活性劑silwet-77對(duì)黃瓜未受精子房培養(yǎng)遺傳轉(zhuǎn)化的影響 Silwet-77作為一種表面活性劑，常用于Floral dip 遺傳轉(zhuǎn)化中，以增強(qiáng)浸染菌液的滲透能力。黃瓜離體雌核發(fā)育為未受精子房胚囊內(nèi)細(xì)胞發(fā)生分裂、形成胚胎。胚囊組織被多層子房壁、珠被等體細(xì)胞包裹，不利于農(nóng)桿菌滲透入胚囊細(xì)胞，完成轉(zhuǎn)化。因此，本研究比較了浸染菌液及共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入不同濃度的silwet-77對(duì)未受精子房培養(yǎng)遺傳轉(zhuǎn)化的影響。

由表6可見(jiàn)，菌液及共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入不同濃度的silwet-77后，隨著silwet-77濃度的增加，除草劑抗性篩選過(guò)程，外植體污染率呈明顯上升趨勢(shì)。當(dāng)silwet-77濃度為0.01%時(shí)，抗性胚胎發(fā)生率及植株再生率高于對(duì)照；當(dāng)silwet-77濃度為0.05%時(shí)，胚胎發(fā)生率及植株再生率明顯低于對(duì)照?？梢?jiàn)，菌液及共培養(yǎng)基中加入低濃度silwet-77，抗性篩選時(shí)農(nóng)桿菌較易被控制；適當(dāng)濃度的silwet-77對(duì)胚胎發(fā)生及轉(zhuǎn)化率的影響有待進(jìn)一步研究。

3 討 論

胚囊被認(rèn)為是遺傳工程的理想受體[12]，其原因主要為：胚囊內(nèi)細(xì)胞具有天然原生質(zhì)體的結(jié)構(gòu)，有利于外源基因的引入；胚囊內(nèi)的卵細(xì)胞正處于一個(gè)世代交替的轉(zhuǎn)折階段，是易受外來(lái)物質(zhì)影響的敏感時(shí)期；卵器細(xì)胞再生力強(qiáng)，有利于轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生成植株；胚囊體積大、結(jié)構(gòu)特殊，有利于進(jìn)行微量注射引入外源DNA。因此，研究者以子房為轉(zhuǎn)化受體，通過(guò)子房注射法、Floral dip等方法，已在棉花[13]、玉米[14]、擬南芥[15]、油菜[16]等作物獲得轉(zhuǎn)基因植株。黃瓜未受精子房培養(yǎng)技術(shù)，可直接獲得育種應(yīng)用的純系，從而大幅提高育種效率，目前，國(guó)內(nèi)外僅少數(shù)單位擁有該項(xiàng)技術(shù)并實(shí)現(xiàn)規(guī)?；瘧?yīng)用。本研究應(yīng)用已建立的高效黃瓜未受精子房培養(yǎng)技術(shù)，探索以胚囊內(nèi)細(xì)胞為轉(zhuǎn)化受體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究，尚未見(jiàn)報(bào)道。

試驗(yàn)分別研究了黃瓜未受精子房胚胎發(fā)生及幼苗階段除草劑質(zhì)量濃度，發(fā)現(xiàn)黃瓜植株對(duì)除草劑表現(xiàn)敏感，極低濃度可產(chǎn)生藥害。黃瓜未受精子房培養(yǎng)不同發(fā)育階段，對(duì)除草劑質(zhì)量濃度的耐受性不同，胚胎誘導(dǎo)階段除草劑質(zhì)量濃度為0.5～1.0 mg·L-1，幼苗生根階段為2.0 mg·L-1。賴來(lái)等[17]以黃瓜子葉為外植體進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化研究，在抗性芽誘導(dǎo)階段與幼苗生根階段，分別采用不同質(zhì)量濃度的除草劑進(jìn)行篩選，其中幼苗生根階段除草劑質(zhì)量濃度為2.0 mg·L-1，與本研究結(jié)果一致。

抑菌困難，是研究建立黃瓜未受精子房遺傳轉(zhuǎn)化體系必須解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一，其污染原因主要為農(nóng)桿菌不能有效抑制以及接種材料滅菌不徹底。本研究初步比較了不同菌液濃度、處理時(shí)間對(duì)選擇培養(yǎng)抑菌程度的影響。確定OD600=0.3時(shí)，浸染10 min，作為農(nóng)桿菌浸染未受精子房的最佳方法，該方法依然存在轉(zhuǎn)化處理后胚胎再生率較低，存在一定污染等問(wèn)題。針對(duì)該問(wèn)題，可進(jìn)一步開(kāi)展菌液濃度、處理時(shí)間等轉(zhuǎn)化方法對(duì)抑菌效果影響的比較試驗(yàn)；探索頭孢霉素等其他抗生素對(duì)未受精子房培養(yǎng)胚胎發(fā)生及抑菌效果的影響。對(duì)于來(lái)源于材料本身的雜菌污染，后續(xù)試驗(yàn)可在材料盛花早期集中進(jìn)行，此時(shí)材料新鮮，易于滅菌；也可適當(dāng)延長(zhǎng)材料滅菌時(shí)間，確保材料沒(méi)有雜菌污染；或先采用短期預(yù)培養(yǎng)，再進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理，對(duì)選擇培養(yǎng)時(shí)農(nóng)桿菌抑菌，可能會(huì)有好的作用。

Floral dip轉(zhuǎn)化方法是一種以活體植株生殖細(xì)胞為轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)化方法，Silwet-77是Floral dip 遺傳轉(zhuǎn)化中有效的表面活性劑[18]。有試驗(yàn)表明將Silwet-77添加入農(nóng)桿菌菌液，采用涂抹或浸泡黃瓜幼嫩子房進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理，有利于提高轉(zhuǎn)化效率[19]。本研究方法在離體條件下以未受精子房為轉(zhuǎn)化體，與上述方法有相似之處。本研究中加入Silwet-77后，隨Silwet-77濃度的增加，外植體污染率上升，說(shuō)明浸染菌液對(duì)外植體內(nèi)部組織的浸染能力增強(qiáng)。另外，當(dāng)silwet-77 濃度較高時(shí)（0.05%），胚胎發(fā)生率及植株再生率降低，且明顯低于對(duì)照；當(dāng)silwet-77 濃度較低時(shí)（0.01%），胚胎發(fā)生率及植株再生率略高于對(duì)照。Silwet-77對(duì)胚囊內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的影響，有待通過(guò)細(xì)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)一步研究。找到適當(dāng)濃度的Silwet-77，有可能提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)的未受精子房轉(zhuǎn)化方法的轉(zhuǎn)化率。

本研究初步建立了黃瓜未受精子房遺傳轉(zhuǎn)化體系，但該體系存在轉(zhuǎn)化處理后胚胎再生率、植株再生率低等問(wèn)題，直接影響轉(zhuǎn)基因植株的獲得。后續(xù)完善試驗(yàn)在轉(zhuǎn)化體篩選過(guò)程中可進(jìn)行延遲篩選，或采用初期低質(zhì)量濃度、后期高質(zhì)量濃度的方法，以獲得更多轉(zhuǎn)化植株。

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