梁秀怡 梁志成 朱 筱 劉詩雨 張 智 田生禮

摘 要：構(gòu)建一種能對PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接克隆并展示于酵母表面的新型T載體。根據(jù)酵母表面展示載體pYD1多克隆位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)出利用兩端帶有Xcm I內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的含有黃色熒光蛋白基因的Xcm I酶切盒，通過Nhe I和Xho I酶切位點(diǎn)插入到pYDl裁體上形成質(zhì)粒pYD-YFP，并對其進(jìn)行酶切鑒定和DNA測序分析，再經(jīng)Xcm l酶切后形成兩端帶有dT的表面展示T載體。利用PCR擴(kuò)增兩個含有熒光蛋白的融合蛋白PCAD-CFP和PSR-DsRed的基因并直接克隆到所構(gòu)建的T載體中，檢測其表達(dá)功能。 酶切鑒定和DNA測序結(jié)果顯示PCAD-CFP和PSR-DsRed正確插入載體上，分別轉(zhuǎn)化至釀酒酵母EBY100中，激光共聚焦顯微鏡下觀察到相應(yīng)的熒光的酵母，表明克隆有融合蛋白基因片段的載體成功在酵母細(xì)胞中進(jìn)行表面展示，證明了所構(gòu)建的酵母表面展示T載體具有直接克隆和表面展示目的蛋白的功能。

關(guān)鍵詞：T栽體：酵母表面展示；真核表達(dá)：Xcm I酶切盒

中圖分類號：Q782

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）（）6-（）477-06

酵母表達(dá)系統(tǒng)具有培養(yǎng)成本低廉、便于大規(guī)模培養(yǎng)和培養(yǎng)周期短等特性，同時又具有真核生物的蛋白翻譯后修飾功能，近年來逐漸用于藥用和食用蛋白的生產(chǎn)。酵母表面展示技術(shù)（yeastsurface display system）在20世紀(jì)90年代初開始興起，是-種將外源蛋白質(zhì)進(jìn)行固定化表達(dá)的真核展示系統(tǒng).廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的相互作用、抗體研制、蛋白分子定向等領(lǐng)域，特別在生物乙醇生產(chǎn)過程中起到關(guān)鍵作用，包括淀粉酶、纖維素酶等酶蛋白均已進(jìn)行表面展示。 a凝集素和α凝集素是錨定在細(xì)胞壁上的甘露糖蛋白，介導(dǎo)單倍體交配型（MATa）和（M ATα）的識別和粘附。最常見酵母表達(dá)系統(tǒng)為a凝集素展示系統(tǒng)和α凝集素展示系統(tǒng)，a凝集素由兩個亞單位Agalp和Aga2p組成，由于Agalp亞基通過與細(xì)胞壁上的β葡聚糖的共價連接而錨定在細(xì)胞壁，Aga2p和Agalp兩個亞基通過兩對二硫鍵相連，因此a展示系統(tǒng)是將a凝集素的Aga2p亞基與目的蛋白進(jìn)行融合，在信號肽的引導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)酵母的表面展示。α凝集素展示系統(tǒng)則將目的蛋白與α凝集素融合，從而將其展示于酵母細(xì)胞表而。其中酵母表而展示主要采用的宿主菌是釀酒酵母（Sacclzaromyces cerevisiae），已被FDA列為CRAS （Generally regarded as safe）原材料.釀酒酵母表面展示能夠把日的蛋白與凝集素功能結(jié)構(gòu)域融合，將目的蛋白表達(dá)并定位于酵母細(xì)胞膜的表面，不但易于純化鑒定，并且酵母具有真核生物的翻譯后修飾體系，能表達(dá)具有一定活性的真核生物的蛋白。相比細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的酶.酵母表面展示可多次生產(chǎn)展示于細(xì)胞表面的蛋白，并且在廉價的培養(yǎng)基中培養(yǎng)可達(dá)到很高的細(xì)胞密度，適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)需求，省去酶的純化和固定化等繁瑣步驟。

構(gòu)建酵母表而展示載體是蛋白質(zhì)進(jìn)行酵母表面展示的基礎(chǔ)，PCR產(chǎn)物克隆需耗費(fèi)大量的時間與精力在表達(dá)載體的構(gòu)建、質(zhì)粒的提取和重組子的鑒定上，而利用T載體可對PCR產(chǎn)物進(jìn)行快速有效的克隆，因此有必要構(gòu)建一個可直接對PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆和表達(dá)的酵母表面展示T載體，特別是進(jìn)行大量的PCR產(chǎn)物克隆時，可以極大減少實(shí)驗(yàn)操作的步驟。

本文克服了常規(guī)構(gòu)建表達(dá)載體操作繁瑣的缺點(diǎn)，以酵母表面展示載體pYDl為基礎(chǔ)，通過向載體pYDl插入含有黃色熒光蛋白基因的Xcm I酶切盒，再切除黃色熒光蛋白基因來構(gòu)建酵母表面展示T載體，并利用熒光蛋白基因檢測該表面展示載體的克隆和表達(dá)功能。

1 材料與方法

1.1材料

1.l.l 菌株和載體

克隆載體pMD-18T購自日本Takara公司；pDsRedl-Nl、pEYFP-Cl、pECFP-Cl、pYD-l載體購自美國Invitrogen公司，大腸桿菌JM107和釀酒酵母EBY100由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑

Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶購于日本rllakara公司；限制性核酸內(nèi)切酶Nhe I、Nde I、Xho I、BamH I、Xcm I為美國NEB（北京）公司產(chǎn)品；所有PCR反應(yīng)的引物（表1）及測序均在北京華大基因公司合成。

1.2方法

1.2.1 Xcm I酶切盒的合成

以含有黃色熒光蛋白基因的質(zhì)粒pEYFP-Cl為模板，使用的引物pYDTl和pYDT2（表1），進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增含有黃色熒光蛋白基因位點(diǎn)的Xcm I酶切盒，長度約760 bp，擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性94℃ 5 min； 94℃ 30 s，55℃ 50 s，72℃ 10 min，進(jìn)行30個循環(huán)，72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行l(wèi)%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收后，通過T4 DNA連接酶連接至pMD-18T裁體，重組載體命名為pMD-YFP，并送往華大基因公司進(jìn)行序列測定，分析克隆基因序列組成及其閱讀框架的正確性。

1.2.2 酵母表面展示T載體pYD-T的構(gòu)建及鑒定

用限制性內(nèi)切酶Xho 1和Nhe l酶切pMD-YFP后進(jìn)行電泳，切膠回收切出的小片段，連接到經(jīng)由同樣的限制性內(nèi)切酶酶切pYDl質(zhì)粒上，獲得的重組質(zhì)粒命名為pYD-YFP，質(zhì)粒及多克降位點(diǎn)序列圖譜見圖l。將pYD_YFP轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM107感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含50 μg/mL氨芐青霉素抗性的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜后挑取單菌落提取質(zhì)粒.對酶切鑒定正確的質(zhì)粒再進(jìn)行DNA測序分析將DNA測序正確的pYD-YFP轉(zhuǎn)化至酵母EBY100感受態(tài)細(xì)胞，鋪于SD/Trp-平板上培養(yǎng)，挑取直徑為2～3 mm的酵母EBYIOO單菌落于于10 mL，酵母SD/Trp'液體培養(yǎng)基（含2%乳糖）中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá).30℃，200 r/min條件下培養(yǎng)48～72 h。取誘導(dǎo)后的酵母菌液300μL，1 000 r/min離心5 min，去上清液，用lmL無菌水洗滌并重懸菌體，由于原載體pYD-PYDl是釀酒酵母表而展示載體、改造后的載體上插入帶有YFP基因的酶切盒片段，YFP蛋門通過錨定蛋白展示到酵母細(xì)胞壁上，因此在505 nm激發(fā)光下通過激光共聚焦顯微鏡可直接觀察到相應(yīng)的熒光，證明了載體pYD-YFP的正確性。質(zhì)粒pYD-YFP經(jīng)Xcm I酶切后，回收載體部獲得酵母表而展示T載體。

1.2.3 酵母表面展示T載體pYD-T克隆目的基因

本文利用多頭絨泡菌（Physarum， poly-cephalun）的兩個蛋白肉桂醇脫氫酶PCAD （Gen-Bank登陸號：KF861979.1）和PSR蛋白（GenBank登陸號：FJ917746）對pYD-T的功能進(jìn)行驗(yàn)證。使用引物TCADP1、CAD-CFPP2和CFPP3通過重疊PCR將PCAD與青色熒光蛋白eCFP的兩個基因連接構(gòu)成融合基岡PCAD- CFP。另外使用引物pSR -TPl .pSR -DsRedP2和DsRedP3通過重疊PCR將PSR和紅色熒光蛋門DsRed兩個基因連接構(gòu)成融合基因PSR-DsRed，以上兩個融合基因基因片段3端均引入一個BamH I酶切位點(diǎn)。

將pYD-T載體用限制性內(nèi)切酶Xcm l酶切處理，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收載體部分，得到兩端帶有突同T的線性化T載體，分別連接PCAD-CFP和P.SR-D.s Red，獲得的重紺載體分別命名為pYD-PSR-DsRed和pY D—PCAD一CFP，融合蛋白表面展示示意圖見圖2。將連接好的重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM107感受態(tài)細(xì)胞中，涂板37℃培養(yǎng)過夜。挑取長勢良好的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶節(jié)鑒定。

1.2.4 酵母表面展示T載體pYD-T表達(dá)功能驗(yàn)證

將pYD -PSR-DsRed和pYD - PCAD一CFP重組載體分別轉(zhuǎn)化至釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞中，操作過程參見文獻(xiàn)，將菌液鋪于SD/Trp-培養(yǎng)板，30℃培養(yǎng)3 d，通過菌液PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子。將陽性轉(zhuǎn)化子接種于酵母SD/Trp-液體培養(yǎng)基（含2%乳糖）中，30 ℃， 200 r/min培養(yǎng)48—72 h取適量的菌液在激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母表面展示T載體pYD-T載體的構(gòu)建

將Xcm I酶切盒片段克隆到pMD-18T載體中形成重組載體pMD-YFP.用限制性內(nèi)切酶Nhe I和Xho I酶切鑒定，結(jié)果見圖3泳道1、2、3，酶切出的片段與Xcrn I酶切盒長度相近，約為760 bp。Xcm I酶切盒片段通過Nhe I和Xha I 位點(diǎn)插入酵母表而展示表達(dá)載體pYD-l中，得到載體pYD-YFP重組，酶切鑒定結(jié)果見圖3泳道4 ，5；圖3泳道6為重組載體pMD-YFP經(jīng)過Xcm I酶切出YFP皋因后，回收載體部分獲得酵母表面展示T載體pYD-T。DNA測序結(jié)果表明所構(gòu)建的真核表達(dá)載體含有完整的黃色熒光蛋白位點(diǎn)及酶切盒，證明pYD-YFP載體構(gòu)建成功。pYD-YFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至釀酒酵母EBY 100后經(jīng)SD誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)72 h后.在激光共聚焦顯微鏡下拍攝到的細(xì)胞表面展示的YFP蛋白，圖4中均能清晰看到酵母表面展示呈現(xiàn)為綠光，這是因?yàn)閹в悬S色熒光蛋白基因的酵母在青光的激發(fā)下呈現(xiàn)兩種光的合成光.即為綠色，部分酵母表面的綠色呈光圈狀，這說明Xcm I酶切盒中黃色熒光蛋白YFP已經(jīng)在酵母細(xì)胞膜上展示。

2.2 酵母表面展示T載體pYD-T克隆功能的鑒定

目標(biāo)基因片段用PCR擴(kuò)增方法在5或3端引入一個與T載體的3或5端所對應(yīng)相同的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)（該限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)務(wù)必確保在PCR片段中或者在T載體有且僅有一個），本文在PCAD-CFP和PSR-DsRed基因片段3端引入一個BamH I酶切位點(diǎn)，與載體5端的BamH I酶切位點(diǎn)相對應(yīng).連接目的基因的PCR產(chǎn)物與T載體構(gòu)成重組載體，利用所設(shè)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行單酶切鑒定。本研究使用BamH I進(jìn)行單酶切，如果能切出與目標(biāo)基因長度大小相近的片段，即可鑒定為正向連接，若沒有切出相應(yīng)大小的DNA片段，則是反向連接，因?yàn)閷?shí)際上反向連接時應(yīng)該切出約為20 bp左右的片段，由于片段太小電泳后兀法直接觀察到，圖5、6顯示BamH I酶切后得到與重疊PCR產(chǎn)物大小相近的條帶，表明CAD-CFP和PSR-DsRed均載體pYD-T正向連接，DNA測序結(jié)果同樣證明了重組載體pYD-CAD-CFP和pYD-PSR-DsRed構(gòu)建正確。

2.3 酵母表面展示T載體pYD-T的展示功能驗(yàn)證

將重組載體pYD-CAD-CFP和pYD- PSR -DsRed轉(zhuǎn)化至釀酒酵母BY100感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落后接種至在SD/Trp-液體培養(yǎng)基（含20乳糖）中，30 ℃中震蕩培養(yǎng)3d后在激光共聚焦顯微鏡下的觀察展示結(jié)果，分別用558nm和405nm激發(fā)光檢測，可以看到酵母的表面發(fā)出明亮的紅光、青光，見圖7、8結(jié)果顯示目標(biāo)蛋白主要分布在酵母細(xì)胞的表面，形成明顯的青色或紅色光圈，證明CAD-CFP、PSR-DsRed融合蛋白已經(jīng)成功在酵母表而展示。

3 討論

近10年來，酵母表面工程技術(shù)在生物技術(shù)領(lǐng)域得到迅速發(fā)展，酵母表面展示系統(tǒng)不僅能展示單個亞單位蛋白，而且能展示異源寡聚體多亞單位蛋白，在展示高等哺乳動物蛋白天然構(gòu)象方而具有其獨(dú)特的優(yōu)越性。 T載體廣泛應(yīng)用于PCR產(chǎn)物克隆，目前商品化的T載體主要是克降型T載體，只能用于基因的克隆與保存，不能用于基因的表達(dá)。若要進(jìn)行目的基因的表達(dá)，需另外將目的基因克隆至表達(dá)載體，過程中涉及轉(zhuǎn)化子的大量測序和鑒定操作。本研究利用可變內(nèi)切酶Xcm I，識別的序列為CCA （N5/N4） TGG，將識別序列第8位沒為T，酶切盒上包含兩個反向的Xcm l酶切位點(diǎn)，經(jīng)Xcm I酶切后可產(chǎn)生3'帶有一個突出dT的T載體。兩個Xcm I位點(diǎn)之問包含黃色熒光蛋白基因，目的在于通過轉(zhuǎn)化測定菌體的熒光來檢測Xcm I的酶切效率，從而提高所制備T載體的質(zhì)量。PCR產(chǎn)物可以無需酶切、純化，減少篩選有效重組子的過程，通過TA克隆，直接連接到pYD-T載體構(gòu)成重組載體，無需另外將目的基因重組至表達(dá)載體，直接進(jìn)行蛋白在釀酒酵母表面展示（圖7、8），節(jié)省寶貴的研究時間和經(jīng)費(fèi)，通過克降和表達(dá)功能的鑒定后證明此方法新穎可行：

目的基因在構(gòu)建表達(dá)載體時，一般通過雙酶切法將目的基因克隆到表達(dá)載體，因此需要考慮目的基因上是否含有載體多克隆位點(diǎn)的酶切識別位點(diǎn)。通過酶切位點(diǎn)插入到載體上的過程中應(yīng)避免使用目的基因上已有的酶切識別位點(diǎn)。本文在研究融合蛋白PCAD-CFP和PSR-DsRed在酵母表面的展示過程中，發(fā)現(xiàn)載體上的多克隆位點(diǎn)均出現(xiàn)目的基因上，難以通過傳統(tǒng)雙酶切法克隆至表面展示載體pYDl上，文中通過對pYDl載體進(jìn)行改造后制備出T載體，除了內(nèi)切酶Xcm I外，無需考慮載體與目的基因上的其他酶切位點(diǎn)，重組的過程不需要考慮使用何種相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶，極大降低目的基因序列中含有與載體多克隆位點(diǎn)所用限制性內(nèi)切酶沖突的可能。通過TA可以連接，成功將目的基因克隆到載體pYD-T上，一步構(gòu)建表達(dá)載體。若使用高保真Taq酶擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物不具有dA粘性末端，可再使用Taq酶進(jìn)行擴(kuò)增，使得PCR產(chǎn)物3'端帶有dA，這樣既可減少PCR過程中的錯配率，也可提高PCR產(chǎn)物與載體的連接效率。

本文所構(gòu)建的酵母表面展示T載體具有操作簡便.快捷高效的特點(diǎn)，使具有藥用和工業(yè)應(yīng)用價值的蛋白能夠更簡捷地進(jìn)行酵母表面展示，為促進(jìn)更多蛋白在酵母細(xì)胞表面的展示和酶的固定化研究建立了表達(dá)平臺。