白 潔,劉小沙,侯 瑞,趙陽國,高會旺 (中國海洋大學環(huán)境科學與工程學院,海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室,山東 青島 266100)

南海南部海域浮游細菌群落特征及影響因素研究

白 潔,劉小沙,侯 瑞,趙陽國*,高會旺 (中國海洋大學環(huán)境科學與工程學院,海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室,山東 青島 266100)

采用高通量測序技術,對南海南部海域浮游細菌豐度、群落組成和群落多樣性的分布特征及與環(huán)境因子的關系進行了研究.結果表明,該研究區(qū)域浮游細菌豐度為107～108個/L,近岸大于離岸,同一站位不同水層細菌分布差異明顯.優(yōu)勢類群為變形菌門、藍藻門和擬桿菌門,優(yōu)勢亞群為 γ-變形菌綱、α-變形菌綱、藍藻菌綱和黃桿菌綱,研究區(qū)域內不同水體間物種組成存在較大差異,另外該海域還存在大量未被認知的細菌類群.該海域浮游細菌種類豐富,具有較高的多樣性指數(H′)(4.44～7.00),研究區(qū)域內表層水體H′接近,分別為5.26、5.33和5.07,處于上升流的次表層水體中H′為6.70明顯高于其他水層.DOC和磷酸鹽是影響該海域浮游細菌豐度的主要因素,同時磷酸鹽也是影響其群落多樣性的主要因素,表明該海域異養(yǎng)浮游細菌生長主要受P的限制.

南海南部；浮游細菌；16S rDNA；群落結構；環(huán)境因子

海洋浮游細菌是海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,參與物質循環(huán)和能量流動,在海洋生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的生態(tài)作用.海洋浮游細菌種類豐富、數量龐大,不同微生物群落具有其獨特的生態(tài)功能,構成了微生物功能多樣性.

隨著分子生物學的發(fā)展,DNA測序技術的廣泛應用,以環(huán)境DNA為模板進行微生物群落組成分析已成為環(huán)境微生物多樣性研究的一種有效手段[1].高通量測序技術以低成本、高通量、流程自動化為優(yōu)勢,廣泛應用于基因組測序和表觀基因組學以及功能基因組學研究的許多方面[2],也迅速發(fā)展為微生物群落結構研究中最先進的方法之一.

南海位于西太平洋,是我國面積最大的海域,南側延至赤道,終年高溫,受季風、地形及黑潮等影響,水文條件較復雜,獨特的地理環(huán)境使其具有豐富的微生物資源.對我國南海微生物多樣性的研究多集中在南海中部、北部海區(qū)[3]以及南沙海域的沉積物[4].南海南部海域是連結熱帶西太平洋和印度洋的熱帶邊緣海,地理環(huán)境較為復雜,對此海域浮游細菌多樣性的研究鮮有報道.

本研究選取了南海南部海域3個典型站位,采用高通量測序技術對浮游細菌群落16S rDNA多樣性進行分析,研究了其群落組成和分布特征,并進一步探討了細菌豐度分布、群落結構與環(huán)境因子間的關系.

1 材料與方法

1.1 樣品采集、處理與現場環(huán)境參數測定

于2012年8月在南海南部海域設定3個典型站位進行樣品采集和現場觀測,S1和S3站基本處于同一緯度,其中S1站離岸相對較遠,S3站離岸相對較近;S2站距赤道較近,站位布設見圖1.

圖1 采樣站位示意Fig.1 Sampling stations

海水樣品由船載CTD單次采集,其中S1和S2站采集表層(3m)和次表層(75m)海水, S3站僅采集表層水(3m).采集的部分水樣加入無顆粒多聚甲醛固定,4℃保存,用于細菌數量測定;部分水樣2L經0.22μm濾膜過濾,-80℃保存濾膜,用于細菌群落結構分析;部分水樣過濾后4℃保存,用于DOC和營養(yǎng)鹽分析.現場海水溫度、pH值、鹽度和溶解氧等環(huán)境參數由CTD(SBE9 型)直接測得.細菌豐度和理化性質測定,均設定3個平行樣.

1.2 DOC和營養(yǎng)鹽測定

DOC測定采用高溫催化氧化法,由島津TOC-Vcpn總有機碳分析儀測定.營養(yǎng)鹽由BRAN+LUEBBE AA3型營養(yǎng)鹽自動分析系統(tǒng)進行測定,其中NO3--N采用Cu-Cd還原法,NO2--N采用鹽酸萘乙二胺絡合顯色法,NH4+-N采用靛酚藍法,PO43-采用磷鉬藍法.

1.3 細菌豐度測定

浮游細菌數量采用熒光顯微鏡計數法進行測定,樣品經DAPI染色,采用LeicaDMLA型全自動落射熒光顯微計數.

1.4 高通量測序及分析

采用Power Soil DNA提取試劑盒(Mobio, USA)提取濾膜上總DNA,最終溶解于2mmol/L Tris-HCl (pH=8)中,取5μL DNA進行電泳檢測.

以總DNA為模板,以細菌16S rDNA的V1～V3區(qū)為目標,采用融合了454測序平臺的通用引物進行PCR擴增.融合V1～V3區(qū)的正向引物:CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAG+BAC ODE+PRIME F;融合V1～V3區(qū)的反向引物:CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAG+PRI ME R).PCR體系為50μL,反應條件為:94 ℃預變性30s, 94℃ 20s, 45℃ 20s, 65℃ 60s,循環(huán)5次;94℃ 20s, 60℃ 20s, 72℃ 20s,循環(huán)20次;72℃延伸5min.PCR結束后,對PCR產物進行瓊脂糖電泳,采用瓊脂糖回收試劑盒(上海生工)對DNA進行回收.

PCR回收產物用Qubit2.0定量,根據測得的DNA濃度,將所有樣品按照1:1的比例進行混合;混合后充分震蕩均勻,混合產物應用454測序平臺測序,測序委托上海生工進行.對原始序列進行預處理,選取高質量的序列進行分析,獲得的序列平均長度在450bp以上.

采用RDP classifier 軟件對預處理序列進行物種分類,對每條序列在genus水平上計算其分配到此rank中的概率值,大于0.8則說明此分類結果可信.

OTU聚類采用uclust軟件,首先篩選出序列中最長的reads作為種子序列,找出所有與該序列相似度在閾值范圍內(>97%)的序列,并將其歸為一個類,依次重復此步驟,直到所有序列均聚好類,每一個類作為一個OTU[5].

1.5 細菌群落多樣性

Alpha多樣性采用香農指數(H＇)進行分析.香農指數(H＇)衡量群落的異質性,計算用式(1):

其中:Pi為各種群物種數與樣本總物種比值,并以從樣本中隨機抽取到的序列數為橫坐標繪制稀疏分析圖.

Beta多樣性采用樣本PCoA分析法,此法基于Unifrac metric[6]來衡量樣本間物種組成的相似度,本研究采用加權重計算方式計算Unifrac值.加權重的計算方式計算時不僅評估樣本間物種的差異,并且加入了物種豐度(即OTU分配到的reads數及樣本總reads)作為權重.

群落多樣性、細菌豐度與環(huán)境因子之間的相關性采用SPSS19.0軟件進行分析.

2 結果

2.1 浮游細菌豐度的分布特征

本研究海域3個站位浮游細菌豐度分布見圖2,其平均值范圍為107～108個/L,與Chen等[7]在南海南部測定的浮游細菌豐度接近,但小于Ning等[8]測定的南海北部細菌豐度108～1010個/L.由圖2可見,離岸較近的S3站表層水體含有細菌數量最多,與之相比,處于同一緯度離岸較遠的S1站細菌數量較小,靠近赤道的S2站的表層含有的細菌數量最少.在垂直方向上細菌豐度分布差異更加明顯,S1站的表層細菌豐度大于其次表層,而S2站次表層的細菌豐度明顯大于其表層水體.細菌豐度分布的空間差異可能是營養(yǎng)物質含量及水文條件等環(huán)境因子共同影響的結果.

圖2 3個站位的細菌豐度分布Fig.2 Bacterial abundance in three stations

2.2 16S rDNA序列分析及群落特征

采用高通量測序法對南海南部海域3個站位不同水層的5個樣品所提取的16S rDNA基因片段進行序列分析,共獲得66118條有效序列和9316個OTU,其中S2站次表層水體(S2b)的OTU最多,為6775個;S3站表層水體(S3s)的最少,為889個;各樣品文庫的覆蓋率為84%～94%(表1).通過RDP classifier程序對不同樣品的基因序列從門到屬依次進行分類,結果見表1.

表1 細菌16S DNA序列分析Table 1 Sequential analysis of bacterial 16S DNA

本研究海域共獲得浮游細菌14門、28綱、54目、126屬、281科,主要類群組成見圖3.

在門水平上,S2站的次表層水樣S2b包含了所有的門類,S1b、S2s、S3s分別包含8門,S1s含有9門.其中S1s、S2s、S2b、S3s的優(yōu)勢菌群均為變形菌門(Proteobacteria),分別占其總群落的70.01%、62.85%、81.47%、58.14%,第二優(yōu)勢菌群為藍藻門(Cyanobacteria).S1b的優(yōu)勢菌群藍藻門(Cyanobacteria)所占比例大于變形菌門(Proteobacteria),分別為41.47%和40.23%.另外,擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和浮霉菌門(Planctomycetes)在所有水樣中均存在.在分類結果中有5門僅存在S2b中,所占比例均小于0.2%,分別為綠彎菌門(Chloroflexi)、黏膠球形菌門(Lentisphaerae)、侯選門OP10(Armatimonadetes )[9-10]、酸桿菌門(Acidobacteria)和綠菌門(Chlorobi).

圖3 不同水樣的群落組成Fig.3 The bacterial community composition in different water samples

在綱水平上,S1s包含12綱,S1b、S2s、S3s均包含15綱,而S2b包含了28綱.S1s、S1b、S2s以及S2b的優(yōu)勢菌群較為相似,均包含 γ-變形菌綱、α-變形菌綱、藍藻菌綱、黃桿菌綱,S3s優(yōu)勢菌群除這4綱外還包含了鞘脂桿菌綱(12.4%);S1b最大的優(yōu)勢菌群為藍藻菌綱,其他水樣均為 γ-變形菌綱.另外,由圖3可見,S1和S2站次表層水樣(S1b和S2b)中α-變形菌所占比例均大于其表層水樣(S1s和S2s).

此外,每個水樣中都含有大量無法確定其分類位置的序列,表明該海域存在大量未被認知的細菌類群.

2.3 浮游細菌多樣性和群落組成差異分析

通過計算每個樣品的香農指數(H′)來衡量各個水樣群落的異質性,本研究海域浮游細菌生物多樣性分布見圖4,可以看出各站位不同水層浮游細菌的香農指數(H′)均相對較高,但存在較大差異,表明該海域浮游細菌生物多樣性較高.3個表層水體S1s、S2s和S3s的H′較為接近,分別為5.26、5.33和5.07;而S1和S2站次表層水體的H′值差異較大,其中S1b的H′是4.44,S2b的H′是6.70.

圖4 不同水樣的香農指數(H′)Fig.4 The Shannon index in different stations

采用PCoA分析衡量樣本間物種組成的相似度,用加權重(weighted)計算方式獲得的Unifrac值見圖5.從圖5可以看出,不同水體間物種組成存在較大差異,S1的表層(S1s)和次表層(S1b)距離最近,物種組成最相似;S2表層(S2s)和S3站表層(S3s)距離相近,物種組成較相似;而S2b與其他水體的距離都很遠,說明S2b與其他區(qū)域的物種組成存在較大差異.

圖5 不同水樣物種組成相似度分析(weighted PCoA)Fig.5 The similarity analysis of species composition among different stations

3 討論

本研究通過對南海南部海域3個站位共5個水樣進行分析,表明該海域浮游細菌豐度分布存在明顯的空間差異;不同水樣中獲得的細菌基因序列數和OTU差異較大,并存在共同的優(yōu)勢菌群,但群落多樣性各不相同,說明該研究海域微生物種類豐富,群落組成復雜,海洋環(huán)境的不同可能是導致微生物多樣性的重要原因.

3.1 浮游細菌類群與生態(tài)功能

本研究海域5個水樣測得的細菌種類豐富,不同水樣中細菌群落組成具有相似性.5個水樣中變形菌門(Proteobacteria)為共同的優(yōu)勢類群,在各個水樣中所占比例在40%～70%之間,這一結果與國內外海洋微生物多樣性研究[11-15]結果一致.

本研究優(yōu)勢亞群為γ-和α-變形菌綱,其中γ-變形菌綱比例明顯大于α-變形菌綱.大量西太平洋海域研究表明γ-變形菌綱為其優(yōu)勢菌群[16-18],在波羅的海研究中發(fā)現在海水中γ-變形菌綱含量最大[19].γ-變形菌綱是目前所知的細菌中種類最多的一綱,包括一些重要的類群,其中交替單胞菌屬為化能異養(yǎng)菌,分子氧是一般的電子受體,部分能夠進行反硝化,海洋中營養(yǎng)物質和含氧量可能會影響其分布.Jing等[15]發(fā)現在南海深水層中存在大量的假交替單胞菌屬,其細菌能分泌多種胞外活性物質,有助于獲取營養(yǎng)和競爭生存空間等,具有重要的生態(tài)學作用.

本研究中α-變形菌綱為變形菌門(Proteobacteria)中第二大優(yōu)勢菌群,主要包含根瘤菌目、鞘脂單胞菌目和紅桿菌目,其中紅桿菌目微生物在S2站的次表層水體S2b中所占比例最大,為22.27%.Giovannoni等[20]發(fā)現紅桿菌目和SAR11占表層海水微生物的30～50%;Jing等[15]在研究熱帶和亞北極細菌群落分布中發(fā)現在南海海域、哥斯達黎加圓突區(qū)和亞北極海域中上部水層中(表層和次表層)α-變形菌綱所占比例最大.α-變形菌綱中的紅桿菌目細菌為光合異養(yǎng)菌,能夠利用環(huán)境中的硫化物和有機底物,根瘤菌目中大部分細菌可以進行固氮,因此這些微生物在海洋的碳、氮、硫循環(huán)中起著非常重要的作用.

藍藻門(Cyanobacteria)為本研究大部分水體的第二優(yōu)勢菌群,優(yōu)勢亞門為藍藻菌綱,主要的藍細菌為GpIIa,在其他海域的研究[21-22]中也有類似結論.本研究藍藻門在S1站次表層(S1b)分布最多,S2站的次表層(S2b)分布最少,各水樣中所占比例為5%～42%.藍藻門(Cyanobacteria)細菌為產氧光合細菌,是海洋生態(tài)系統(tǒng)和初級生產力的重要組成部分,同時在海洋碳、氮、硫的循環(huán)中發(fā)揮重要作用.

擬桿菌門(Bacteroidetes)為5個水樣的第三大優(yōu)勢菌群,主要包括黃桿菌綱和鞘脂菌綱,前者豐度大于后者,在波羅的海研究中也發(fā)現類似的結果[19],本研究黃桿菌綱主要分布在表層海水中(S1s和S3s),因其能夠產生胞外水解酶來降解大分子有機物質,是所在水域碳循環(huán)中的重要功能類群.

另外,本研究所有水樣中均發(fā)現放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和浮霉菌門(Planctomycetes)的存在,其比例均小于0.3%.厚壁菌門多為革蘭氏染色陽性,在近海和淺海沉積物中較為常見[23], Jing等[15]在南海海水中也發(fā)現了放線菌門、疣微菌門和浮霉菌門,但未發(fā)現本研究各水樣中均存在的厚壁菌門.

3.2 浮游細菌豐度與環(huán)境因子的關系

3個站位浮游細菌豐度與主要環(huán)境因子之間的關系見表2,研究結果發(fā)現,細菌豐度與DOC(P≤0.01)、磷酸鹽(P≤0.05)均呈顯著性正相關關系,與其他環(huán)境因子之間的相關性不顯著.

在海洋生態(tài)系統(tǒng)中,DOC是細菌維持生命活動、進行生長繁殖的營養(yǎng)來源,對細菌生產力起著決定性的作用.早在20世紀末Rivkin等[24]和Pomeroy等[25]就提出,細菌生長受海水溫度、DOC和無機營養(yǎng)鹽的限制.Hitchcock等[26]的實驗表明,向模擬環(huán)境中添加一定濃度的DOC,浮游細菌數量在短時間內明顯增加.本研究S1和S3站處于同一緯度,但S3站離岸較近, DOC含量豐富,細菌數量大,而S1離岸較遠,DOC含量很低,細菌數量較小,推測可能是含有豐富有機質的陸源水體進入S3站附近海域,促進了臨近水域浮游細菌的生長繁殖.

海洋中異養(yǎng)浮游細菌的生長還依賴于無機營養(yǎng)鹽的種類和數量,異養(yǎng)浮游細菌可以利用海水中的溶解性磷酸鹽作為P源進行生長繁殖.Cotner等[27]通過海洋調查發(fā)現,Sargasso Sea海區(qū)DOC含量很高但細菌生產力較低,向實驗水體添加無機磷酸鹽后,異養(yǎng)浮游細菌的生物量和生產力均明顯增加,認為正是由于磷的限制,才導致細菌二次生產力的下降.南海為寡營養(yǎng)鹽海區(qū),本研究海域中除S2b和S3s外磷酸鹽含量均較低,結合細菌豐度與磷酸鹽存在顯著性正相關的結果可以初步推斷,南海南部海域異養(yǎng)浮游細菌生長受P的限制.

表2 不同站位主要環(huán)境因子及與細菌豐度和群落多樣性之間的關系Table 2 The main environmental factors and their correlation with bacterial abundance and biodiversity

3.3 浮游細菌類群分布與環(huán)境因子的關系

由表2可見,研究海域細菌生物多樣性與磷酸鹽含量之間存在顯著性正相關關系(r=0.836 P≤0.05),而與其他環(huán)境因子之間的相關性不顯著.劉敏[28]在研究我國黃、東海典型生態(tài)過程中的微生物群落結構也發(fā)現磷酸鹽是控制群落分布的主要因子,另外Haukka等[29]也報道在淡水生態(tài)系統(tǒng)中添加磷酸鹽和總氮后,浮游細菌的群落結構發(fā)生變化,這種變化可能與生態(tài)系統(tǒng)中添加營養(yǎng)物質后引起的水體富營養(yǎng)化有關.

本研究中S2b的H′明顯高于其他區(qū)域,可能與該區(qū)域的化學、水文條件等多種因素有關.S2b位于S2站的次表層,水溫為23.7℃,明顯低于同緯度其他水域;其鹽度為33.9,DIN為8.65μmol/L,磷酸鹽為0.25μmol/L(見表2),均為5個水體中的最高值, DOC含量也僅低于S3s,推斷S2站可能處于上升流區(qū).底層海水上升帶入豐富的營養(yǎng)鹽,有利于浮游藻類的生長繁殖,并造成海水DOC的增加,從而導致細菌的旺盛生長,使細菌豐度明顯增加,群落結構更加復雜.本研究中S2b包含的細菌門類最多,綠彎菌門(Chloroflexi)、黏膠球形菌門(Lentisphaerae)、侯選門OP10 (Armatimonadetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)和綠菌門(Chlorobi)僅存在于該區(qū)域的結果也與其特殊的理化條件有關.有研究表明,α-變形菌廣泛存在于富營養(yǎng)化水體中,本研究S2b中α-變形菌數量最多,應該與其營養(yǎng)物質含量高有關.

此外,Agogu等[30]指出海水中細菌的組成由于潮流的影響會迅速發(fā)生變化,因此,細菌群落組成與多樣性的空間差異受到多種因素的共同影響,評價微生物群落與環(huán)境因素之間的關系進行多種因素的綜合影響分析更為科學.

4 結論

4.1 南海南部海水中細菌群落組成豐富,優(yōu)勢類群為變形菌門(Proteobacteria)、藍藻門(Cyanobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes);另外擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和浮霉菌門(Planctomycetes)在所有水樣中均存在.優(yōu)勢亞群為 γ-變形菌綱、α-變形菌綱、藍藻菌綱、黃桿菌綱.另外每個水樣中均含有大量無法確定其分類位置的序列,表明該海域存在大量未被認知的細菌類群.

4.2 細菌的豐度和群落組成存在明顯的空間差異.細菌豐度分布近岸大于離岸,垂直分布規(guī)律不明顯.S1站的表層和次表層群落組成相似,S2站的表層與S3站的表層群落組成相似.研究區(qū)域群落多樣性指數H′較高,表層水體H′相近;與其他站位相比,處于上升流的S2站的次表層的群落組成更加復雜,H′明顯偏高.

4.3 本研究海域發(fā)現細菌豐度與DOC、磷酸鹽呈顯著正相關關系,表明DOC和磷酸鹽是影響該海域浮游細菌豐度的主要因素,而細菌群落多樣性僅與磷酸鹽存在顯著正相關關系,表明該海域異養(yǎng)浮游細菌生長受P的限制;該海域群落組成與多樣性的空間差異可能是水文條件,地理位置等多種因素綜合影響的結果.

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Community structure and influencing factors of bacterioplankton in the southern South China Sea.

BAI Jie, LIU Xiao-sha, HOU Rui, ZHAO Yang-guo*, GAO Hui-wang (Key Laboratory of Marine Environmental Science and Ecology, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266100, China). China Envrionmental Scicence, 2014,34(11)：2950～2957

The high-throughput sequencing approach was adopted to analyze the distribution characteristics of the abundance, community structure and community diversity of bacterioplankton in the southern South China Sea and their relationship with environmental factors. The results indicated that the bacterioplankton abundance in the investigated area was about 107～108cells/L with high values in offshore stations and sharp differences among water layers. The dominant groups were Proteobacteria, Cyanobacteria and Bacteroidetes and the dominant classes were γ-Proteobacteria, α-Proteobacteria, Cyanobacterium and Flavobacteria. The community structure of bacterioplankton showed an obvious difference among various water bodies and numerous unidentified bacteria were recorded. The bacterioplankton showed a high species richness in the area with a biodiversity index (H') of between 4.44～7.00. The biodiversity index in surface layers of the area was 5.26, 5.33 and 5.07, respectively, whereas the index in the upwelling subsurface layer was 6.70, which was significantly higher than other layers. DOC and phosphate were the main factors influencing the bacterioplankton abundance, phosphate was also the main factor affecting the community diversity. The growth of bacterioplankton in the southern South China Sea was therefore mainly limited by phosphate.

southern South China Sea；bacterioplankton；16S rDNA；community structure；environmental factor

X171.1,Q938

A

1000-6923(2014)11-2950-08

白 潔(1962-),女,陜西神木人,教授,博士,主要從事海洋微生物生態(tài)學研究.發(fā)表論文30余篇.

《中國環(huán)境科學》獲評“百種中國杰出學術期刊”

《中國環(huán)境科學》編輯部

2014-02-28

國家自然科學基金重大國際合作研究項目(41210008)

* 責任作者, 副教授, ygzhao@ouc.edu.cn

《中國環(huán)境科學》2012年被中國科學技術信息研究所評為“2011年度百種中國杰出學術期刊”.“百種中國杰出學術期刊”是根據中國科技學術期刊綜合評價指標體系進行評定的,包含總被引頻次、影響因子、基金論文比、他引總引比等多個文獻計量學指標.