朱奕潼，苗 雅，何 婷，鐘 遠

（上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院老年病科，上海 200233）

我國糖尿病患者已超過9 200萬，成為世界第一糖尿病大國。長期血糖控制不良引起的糖尿病并發(fā)癥是糖尿病致殘、致死的主要原因。糖尿病對中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成的損害形成了糖尿病中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。1963年Nielsen提出糖尿病性腦?。╠iabetic encephalopathy，DE）概念。DE的發(fā)病機制不明，目前的研究熱點主要集中于血流動力學改變、胰島素代謝紊亂、炎癥反應、神經(jīng)營養(yǎng)因子作用等方面。近年來，學者們普遍認為突觸可塑性改變導致海馬依賴性情景記憶的缺失是DE發(fā)病、長時程記憶難以形成的重要機制[1,2]?；钚哉{(diào)節(jié)細胞骨架相關蛋白（activity-regulated cytoskeletal protein，Arc）/活性調(diào)節(jié)基因3.1蛋白同系物（activity-regulated gene 3.1 protein homolog，Arg3.1）是一種獨特的即早基因（immediate early gene，IEG），其表達產(chǎn)物Arc蛋白與長時程增強（long-term potentiation，LTP）密切相關，對記憶鞏固和突觸可塑性至關重要。本課題組前期研究中采用小劑量鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）腹腔注射聯(lián)合高脂飲食建立了DE大鼠模型，證實了DE大鼠學習、記憶能力較正常大鼠明顯下降[3]。本研究擬在此模型基礎上，觀察其海馬組織Arc和β淀粉樣蛋白肽（amyloidbeta peptide，Aβ）的表達變化，從而探討突觸可塑性改變在DE發(fā)病機制中扮演的角色，為預防和治療DE提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

30只SPF級8周齡雄性SD大鼠（體質量180～220g），由上海交通大學實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑及設備

40%高脂飼料（上海斯萊克實驗動物有限責任公司）；STZ（美國Sigma-Aldrich公司）；快速血糖儀（美國強生公司，SureStep）；Morris水迷宮及視頻分析系統(tǒng)（淮北正華生物儀器設備有限公司）；Arc/Arg3.1兔多克隆抗體（美國Abcam公司）；大鼠胰島素ELISA試劑盒（批號：E02I0004）、大鼠Aβ1-42ELISA試劑盒（批號：E02A0050）和Aβ1-42兔多克隆抗體（均上海藍基生物有限公司）。

1.3 動物分組和模型建立

SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為對照組（n＝15）和糖尿病組（diabetes mellitus group，DM組，n＝15）。對照組給予標準飼料，DM組給予高脂飼料喂養(yǎng)至第4周末。動物禁食不禁水12h，以30mg/kg和1ml/kg注射量對DM組動物行一次性腹腔注射，對照組腹腔注射同劑量檸檬酸緩沖液。STZ注射72h后用快速血糖儀檢測兩組動物尾靜脈血糖，以隨機血糖濃度≥16.7mmol/L視為造模成功，兩組動物以各自飼料飼養(yǎng)至16周末。

1.4 檢測指標及方法

每周監(jiān)測動物體質量、隨機血糖，于STZ注射1周后尾靜脈采血測量空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）和空腹血清胰島素（fasing serum insulin，F(xiàn)SI）。按照公式計算胰島素敏感指數(shù)（insulin sensitivity index，ISI）＝LN[1/（FBG×FSI）][6]，ISI呈非正態(tài)分布，分析時取其自然對數(shù)值。

1.5 Morris水迷宮測試

第16周行Morris水迷宮測試：（1）隱形平臺實驗：歷時5d，實驗前1d大鼠在水迷宮內(nèi)游泳2min適應環(huán)境。平臺置于目標象限中心水面下2cm，每天在其余3個象限隨機選定4個方向，將大鼠面壁置入池內(nèi)。若90s內(nèi)大鼠爬上平臺停留30s，則將入水至爬上平臺前的時間記為逃避潛伏期；若90s內(nèi)未找到平臺，則將其引至平臺學習30s，逃避潛伏期記為90s。每只大鼠每日進行4次入水訓練。（2）探索實驗：第6天撤去平臺，大鼠從距離原平臺位置最遠的方向入水，自由游泳90s，由視頻分析系統(tǒng)記錄90s內(nèi)大鼠在目標象限內(nèi)游泳的時間、路程及占總時間、總路程的百分比和原平臺穿越次數(shù)。

1.6 ELISA法和免疫組織化學法檢測Aβ表達

按2ml/kg注射10%水合氯醛麻醉動物，迅速斷頭后于冰上分離出一側海馬，按2.5ml/g加入冰凍磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS），勻漿器冰上研磨，超聲裂解細胞膜，4℃ 5000r/min離心15min后取上清，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作。將分離的海馬組織用10%多聚甲醛進行固定，經(jīng)乙醇脫水2次，二甲苯透明，石蠟包埋組織塊，切片，片厚5μm。按SP試劑盒說明書測定Aβ的表達，光學顯微鏡下仔細觀察大鼠海馬CA1區(qū)Aβ的表達。

1.7 蛋白印跡法（Western blotting）檢測Arc的表達

同樣的方法分離出另一側海馬，以10ml/g比例加入總蛋白提取液，冰上勻漿，4℃12 000×g離心10min取上清，BCA法測定蛋白濃度。樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）電泳轉移到PVDF膜上。將膜完全浸泡于3%BSA-TBST中，搖床上室溫封閉1h。后經(jīng)一抗（Arc/Arg3.1兔多克隆抗體，1∶1000）和二抗[HRP標記山羊抗兔IgG（H＋L），1∶5000]孵育后由Image-Pro Plus 6.0軟件分析條帶的積分光密度值，并計算相對密度。

1.8 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計學分析。計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，對所有數(shù)據(jù)進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 體質量、空腹血糖、空腹胰島素和胰島素敏感指數(shù)變化

實驗結束兩組各剩下13只，對照組2只打斗一死一傷退出實驗，DM組2只大鼠因高滲性昏迷死亡。實驗初DM組和對照組大鼠體質量相當，差異無統(tǒng)計學意義[（204.85±6.19）vs（205.46±9.98）g，t＝0.189，P＞0.05]。高脂飼養(yǎng)至第4周末DM組體質量高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義[（393.77±12.34）vs（367.08±18.59）g，t＝-4.312，P＜0.01]。第4周末注射STZ后DM組逐漸出現(xiàn)多飲多食多尿現(xiàn)象，體質量逐漸下降，至第16周末處死前DM組體質量低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義[（377.38±19.74）vs（481.38±19.50）g，t＝13.515，P＜0.01]。STZ注射1周后顯示DM組FBG、FSI高于對照組，DM組ISI低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01；表1）。

表1 兩組大鼠STZ注射后FBG、FSI和ISI的比較Table 1 Comparison of FBG, FSI and ISI between two groups of rats after STZ injection (n＝13, ±s )

表1 兩組大鼠STZ注射后FBG、FSI和ISI的比較Table 1 Comparison of FBG, FSI and ISI between two groups of rats after STZ injection (n＝13, ±s )

DM:diabetes mellitus;STZ:streptozotocin;FBG:fasting blood glucose;FSI:fasing serum insulin;ISI:insulin sensitivity index.ISI＝LN[1/(FBG×FSI)]. Compared with control group, **P＜0.01

Group FBG(mmol/L) FSI(mIU/L) ISI Control 4.36±1.13 20.41±3.12 -4.45±0.13 DM 19.63±1.40** 035.30±2.77** 0-6.54±0.13**

2.2 行為學測試結果

Morris水迷宮測試中，隱形平臺實驗第3～5天DM組逃避潛伏期相比對照組長，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。探索實驗中DM組在目標象限的探索時間比對照組短，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），DM組原平臺穿越次數(shù)相比對照組少，差異具統(tǒng)計學意義（P＜0.01），兩組大鼠游泳平均速度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05；圖1，圖2）。

2.3 大鼠海馬組織Arc和Aβ的表達

2.3.1 ELISA法和免疫組織化學法檢測Aβ1-42的表達 Aβ1-42是構成老年斑的主要成分，測定海馬組織中的Aβ可作為DE的診斷指標，確定DE模型是否成功，ELISA測定結果顯示，DM組Aβ1-42表達高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義[（201.41±8.31）vs（182.23±6.09）ng/L，t＝-6.712，P＜0.01；圖3]。免疫組織化學檢測發(fā)現(xiàn)2型糖尿病大鼠模型海馬區(qū)域有明顯的Aβ的沉積（圖4）。

圖1 兩組大鼠隱形平臺實驗逃避潛伏期比較Figure 1 Comparison of escape latency in Stealth platform experiment between two groups

圖2 兩組大鼠Morris水迷宮探索實驗對比Figure 2 Comparison of Morris water maze exploration between two groups

圖3 兩組大鼠海馬組織Aβ1-42的表達的比較（ELISA檢測）Figure 3 Comparison of the expression of Aβ1-42 in the hippocampus of rats in two groups (ELISA)

圖4 對照組和糖尿病組大鼠海馬組織Aβ沉積圖片比較Figure 4 Aβ1-42 deposition in the hippocampus of rats from two groups (SP×400)

2.3.2 Western印跡法檢測Arc的表達 DM組Arc/Arg3.1的表達低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義[（0.6445±0.1046）vs（0.0460±0.0138），t＝18.818，P＜0.001；圖5]。

圖5 兩組大鼠海馬組織Arc/Arg3.1的表達Figure 5 The expression of Arc/Arg3.1 in hippocampus of rats from two groups

3 討 論

糖尿病是與遺傳因素和環(huán)境因素共同作用相關、以胰島素分泌不足和（或）胰島素作用抵抗、慢性高血糖為特點的常見的代謝性疾病[4]。糖尿病可導致嚴重的并發(fā)癥，如心臟病，卒中，失明，以及腎臟、神經(jīng)和足部損害。隨著人均壽命的延長和生活質量的提高，近年來，由糖尿病引起的中樞神經(jīng)損害日益受到人們的重視。本課題組前期對328例老年患者的隨訪研究顯示，老年2型糖尿病患者認知功能下降水平與高胰島素血癥、胰島素抵抗以及血糖波動水平密切相關，認知評分較對照組明顯下降，主要表現(xiàn)為延遲記憶等受損，而這些患者均無明確腦血管病的臨床和影像學證據(jù)[5,6]。

本課題組前期實驗中SD大鼠經(jīng)過高脂飼料喂養(yǎng)和小劑量STZ破壞胰島細胞后，出現(xiàn)了類似2型糖尿病多飲多食多尿、體質量下降、高血糖、高胰島素血癥及胰島素敏感性下降的表現(xiàn)。實驗末的水迷宮測試中，糖尿病組大鼠目標象限探索時間較對照組更短，原平臺穿越次數(shù)更少，說明糖尿病大鼠學習和記憶能力下降，認知功能受到損害，同時EILSA檢測可觀察到糖尿病組大鼠海馬組織的Aβ表達升高，與其他研究采用的建模方法和成模表現(xiàn)相似，說明該類建模方法可靠，具有良好的重復性和穩(wěn)定性[7,8]。動物模型的成功建立，為后續(xù)其他指標檢測提供了可靠的前提。

近年來，學者們普遍認為突觸可塑性改變導致海馬依賴性情景記憶的缺失是糖尿病性腦病發(fā)病、長時程記憶難以形成的重要機制。突觸可塑性是神經(jīng)活動引起的神經(jīng)元之間信息傳遞效能增強或減弱的現(xiàn)象，其中和學習記憶相關的兩種主要細胞機制是LTP和長時程抑制（long-term depression，LTD）。海馬是學習記憶的重要器官，LTP的首次發(fā)現(xiàn)是在海馬部位，心理學家和神經(jīng)科學家普遍認為海馬對新記憶的形成有重要作用。阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）發(fā)病早期即可見海馬的萎縮[9]，值得注意的是臨床上糖尿病患者出現(xiàn)認知功能下降的同時往往也伴隨海馬的萎縮超過正常的老化速度[10]。

Arc/Arg3.1作為神經(jīng)活性標志物參與突觸可塑性?？茖W家們開展了一系列實驗探究Arc/Arg3.1在AD發(fā)生發(fā)展中的作用。Ginsberg等[11]發(fā)現(xiàn)AD患者出現(xiàn)神經(jīng)元纖維纏結的CA1區(qū)，其Arc mRNA水平較正常組明顯下降，而Lacor等[12]卻在原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)Arc表達上升。Wegenast-Braun等[13]和Dickey等[14]利用多種轉基因小鼠模型發(fā)現(xiàn)年幼和年老小鼠的海馬中Arc的表達均下降。有趣的是，Palop等[15]在4～7月齡不等的小鼠海馬中同時觀測到Arc表達上升和下降的現(xiàn)象。可見，目前研究者對AD患者體內(nèi)Arc表達的變化趨勢莫衷一是。但是可以確定的是，AD患者大腦神經(jīng)元中Arc表達的失調(diào)干擾了正常的神經(jīng)生理活動，參與了AD的發(fā)病。在本實驗中，我們通過ELISA、Western印跡法和免疫組織化學法觀察到認知功能下降的糖尿病大鼠海馬組織不僅Aβ表達增高，Arc的表達較對照組大鼠也明顯降低，提示2型糖尿病引起的DE病理改變和認知功能下降可能與Arc蛋白表達失調(diào)有關，驗證了我們的推測。

綜上所述，本實驗在DE大鼠模型的基礎上，觀察到Arc表達降低，我們推測DE引起的學習和記憶下降與Arc表達降低導致突觸可塑性失衡加劇Aβ的沉積和神經(jīng)元損傷有關。盡管DE具體機制仍未明，但突觸可塑性可能是預防和治療DE認知功能損害的關鍵。然而目前我們?nèi)匀幻媾R許多問題需要解決，最主要的是探索一條具體的誘導途徑。在DE狀態(tài)下進一步研究Arc在大腦不同發(fā)育階段和不同區(qū)域的表達以及上游各種因子的相互作用，并使用藥物改善突觸可塑性將作為我們下一步研究的思路和方向。

【參考文獻】

[1]Kerrigan TL, Randall AD. A new player in the“synaptopathy” of Alzheimer’s disease—arc/arg3.1[J].Front Neurol, 2013, 4:9.

[2]Korb E, Finkbeiner S. Arc in synaptic plasticity:from gene to behavior[J]. Trends Neurosci, 2011, 34(11):591?598.

[3]He T, Miao Y, Zhu YT,et al. A study on correlation of cognitive function and expression with beta-amyloid,tumor necrosis factor alpha in hippocampus of diabetic rats[J]. Geriatr Health Care,2014, 20(2):93?98. [何 婷,苗 雅, 朱奕潼, 等. 糖尿病大鼠認知功能與海馬組織β-淀粉樣蛋白、腫瘤壞死因子α表達相關性的研究[J].老年醫(yī)學與保健, 2014, 20(2):93?98.]

[4]American Diabetes Association. Diagnosis and classification of diabetes mellitus[J]. Diabetes Care, 2013,36 Suppl 1:S67?S74.

[5]Zhong Y, Zhang XY, Miao Y,et al. The relationship between glucose excursion and cognitive function in aged type 2 diabetes patients[J]. Biomed Environ Sci, 2012,25(1):1?7.

[6]Zhong Y, Miao Y, Jia WP,et al. Hyperinsulinemia, insulin

resistance and cognitive decline in older cohort[J].Biomed Environ Sci, 2012, 25(1):8?14.

[7]Liu JP, Feng L, Zhang MH,et al. Neuroprotective effect of Liuwei Dihuang decoction on cognition deficits of diabetic encephalopathy in streptozotocin-induced diabetic rat[J]. J Ethnopharmacol, 2013, 150(1):371?381.

[8]Shi X, Lu XG, Zhan LB,et al. The effects of the Chinese medicine ZiBu PiYin recipe on the hippocampus in a rat model of diabetes-associated cognitive decline:a proteomic analysis[J]. Diabetologia, 2011, 54(7):1888?1899.

[9]Epifanio I, Ventura-Campos N. Hippocampal shape analysis in Alzheimer’s disease using functional data analysis[J]. Stat Med, 2014, 33(5):867?880.

[10]Kamiyama K, Wada A, Sugihara M,et al. Potential hippocampal region atrophy in diabetes mellitus type 2:a voxel-based morphometry VSRAD study[J]. Jpn J Radiol,2010, 28(4):266?272.

[11]Ginsberg SD, Hemby SE, Lee VM,et al.Expression profile of transcripts in Alzheimer’s disease tangle-bearing CA1 neurons[J]. Ann Neurol, 2000, 48(1):77?87.

[12]Lacor PN, Buniel MC, Chang L,et al. Synaptic targeting by Alzheimer’s-related amyloid beta oligomers[J]. J Neurosci, 2004, 24(45):10191?10200.

[13]Wegenast-Braun BM, Fulgencio Maisch A, Eicke D,et al.Independent effects of intra- and extracellular Abeta on learning-related gene expression[J]. Am J Pathol, 2009,175(1):271?282.

[14]Dickey CA, Gordon MN, Mason JE,et al. Amyloid suppresses induction of genes critical for memory consolidation in APP+PS1 transgenic mice[J]. J Neurochem, 2004, 88(2):434?442.

[15]Palop JJ, Chin J, Bien-Ly N,et al. Vulnerability of dentate granule cells to disruption of arc expression in human amyloid precursor protein transgenic mice[J]. J Neurosci, 2005, 25(42):9686?9693.