李金華，曾萬勇，黃 強，田 靜

(武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北武漢430023)

草莓是薔薇科(Rosaceae)草莓屬(Fragaria)多年生草本植物，原產(chǎn)南美洲，后被世界各地廣泛引種栽培，是當今世界十大水果之一，享有“水果皇后”之美譽。中國是草莓生產(chǎn)大國［1］。除直接被食用外，草莓還可深加工成果醬、果汁、果酒、糖水罐頭及各種冷飲和速凍食品，是發(fā)展?jié)摿薮蟮乃?/p>

在生產(chǎn)上，草莓常用匍匐莖繁殖，繁殖速度慢。離體培養(yǎng)技術(shù)應用于草莓生產(chǎn)，可在較短時間內(nèi)提供整齊的良種苗、脫毒苗，與常規(guī)育種相結(jié)合可更有效地培育抗病高產(chǎn)良種，也可以作為離體再生途徑研究和種質(zhì)資源保存的一種手段。

目前，有關(guān)草莓組培的報道很多，但不同品種特性不同，培養(yǎng)方法也有差異［2-8］。“紅顏”草莓品種(簡稱“紅顏”)是近年來深受消費者喜愛的優(yōu)質(zhì)品種，但其自然繁殖率非常低。本研究以“紅顏”草莓品種為材料，探索了其組培各階段的最佳生長條件，對影響快速繁殖的幾個重要因素，即激素濃度、pH值、碳源和蔗糖濃度進行了探討，試圖解決草莓品種“紅顏”繁殖效率低，種苗供應不足的問題。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

“紅顏”草莓品種匍匐莖幼芽采自武漢市東西湖區(qū)涇河農(nóng)場草莓栽培戶。

1.2 實驗方法

1.2.1 外植體滅菌、接種及培養(yǎng)

將草莓匍匐莖頂端葉片剝?nèi)ィＡ艏s2 cm的幼芽，流水沖洗過夜。接種前在超凈工作臺用無菌水沖洗3次，75%酒精浸泡1 min，0.1%升汞殺菌15 min，無菌水沖洗5次，吸干水份，接種至不同處理的培養(yǎng)基中。每個培養(yǎng)瓶接2棵外植體，置于光照強度2 000—4 000 lx，光照時間16 h，溫度為23±2℃的恒溫培養(yǎng)室中進行恒溫培養(yǎng)，45 d后統(tǒng)計繁殖系數(shù)。繁殖系數(shù)的計算公式為:繁殖系數(shù)=總的草莓苗數(shù)/接種外植體數(shù)。

1.2.2 不同激素濃度配比對草莓快繁的影響

以MS為基本培養(yǎng)基，加蔗糖30 g/L，瓊脂7 g/L，按不同濃度配比加入6-芐基嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)(見表 1)，pH 5.6—5.8，每種配方設置5個重復，分裝滅菌接種培養(yǎng)。

表1 培養(yǎng)基中激素濃度的配比

1.2.3 培養(yǎng)基pH值對草莓快繁的影響

以 MS+6-BA0.2 mg/L+NAA0.05 mg/L+蔗糖30 g/L 為配方，自 pH 5.2—6.0，間隔0.2，配制不同pH值培養(yǎng)基，每種配方設置5個重復，分裝滅菌接種培養(yǎng)。

1.2.4 不同碳源對草莓快繁的影響

以 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.05 mg/L 為配方，瓊脂7 g/L，pH 5.6，分別以30 g/L 的蔗糖、葡萄糖、麥芽糖為碳源，每種配方設置5個重復，分裝滅菌接種培養(yǎng)。

1.2.5 不同蔗糖濃度對草莓快繁的影響

配制 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA0.05 mg/L 培養(yǎng)基，以1%—5%設置5個梯度加入蔗糖，pH 5.6，取生長良好的叢生芽，隨機接種于培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 激素濃度對“紅顏”繁殖系數(shù)的影響

從表2中可以看出，各處理組所接材料都能誘導出芽。從NAA濃度來看高或低都能誘導出芽，但添加一定濃度的NAA后出芽率明顯升高，最適濃度為0.05 mg/L;NAA濃度超過0.05 mg/L后，繁殖系數(shù)降低。對6-BA來說，濃度為0.5mg/L時，繁殖系數(shù)達到最大值，即當NAA的濃度為0.05 mg/L，6-BA的濃度為0.5 mg/L，叢生芽誘導率最高，繁殖系數(shù)為3.2。由此可見，適宜“紅顏”莖尖誘導的培養(yǎng)基激素配比為 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L。

表2 激素對“紅顏”增殖的影響

2.2 pH值對“紅顏”繁殖系數(shù)的影響

實驗比較了5個pH值對“紅顏”生長的影響。由圖1可知，pH為5.6時繁殖系數(shù)最高達到2.5，且外植體生長良好。當pH值為5.2時，培養(yǎng)基不能完全凝固，外植體很容易陷入培養(yǎng)基中，影響叢生芽的生長和增殖。

圖1 pH對草莓品種“紅顏”繁殖系數(shù)的影響

2.3 碳源對“紅顏”繁殖系數(shù)的影響

試驗比較了三種糖作為碳源對植株叢生芽的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以麥芽糖作為碳源，“紅顏”的繁殖系數(shù)最小，增殖效果最差(表3)。而用蔗糖和葡萄糖的增殖效果差異不顯著，但在具體應用中，蔗糖成本較低，因此，“紅顏”繁殖最佳碳源可選擇蔗糖。

表3 不同碳源對“紅顏”草莓快速繁殖的影響

2.4 蔗糖濃度對“紅顏”繁殖系數(shù)的影響

由圖2可知，在“紅顏”快繁時，隨著蔗糖的濃度升高，“紅顏”的繁殖系數(shù)也逐漸增加，但蔗糖濃度超過3%以后，隨著蔗糖濃度的升高，繁殖系數(shù)則逐漸降低，組培苗黃化現(xiàn)象加重。蔗糖濃度以3%時最適宜，繁殖系數(shù)最高。

圖2 不同蔗糖濃度對“紅顏”繁殖系數(shù)的影響

3 討論

3.1 激素濃度問題

激素是影響植物組織培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵因素之一。物種、基因型、外植體部位及不同培養(yǎng)階段在組織培養(yǎng)中所需求的激素的種類和濃度不同。在草莓的組織培養(yǎng)中，高水平的細胞分裂素有利叢芽的形成，但濃度過高，則形成的叢生芽過于細密且質(zhì)量下降，不利于生根和田間移栽。從誘導的試管苗來看，激素濃度過高的試管苗葉片出現(xiàn)了畸形，葉柄變脆等現(xiàn)象(見圖3)。本實驗結(jié)果表明“紅顏”在不同的激素組合條件下，叢生芽再生能力不同，應適度使用植物激素。

3.2 pH值對草莓快繁的影響

pH值主要通過改變生物大分子空間結(jié)構(gòu)影響分子活性，從而影響植株的生長，也是影響快繁的主要因素之一。本實驗表明“紅顏”在不同的pH條件下，增殖能力不同，生長狀況也有很大的差異(見圖4)。當pH值低于5.4時，培養(yǎng)基不能完全凝固，質(zhì)地較軟，外植體很容易陷入培養(yǎng)基中，造成外植體缺氧，從而影響外植體不定芽的再生，外植體甚至因缺氧而死。本實驗研究表明“紅顏”增殖的最適pH值為5.6，在此條件下繁殖系數(shù)最高，生長狀況最好。

圖3 不同激素濃度對“紅顏”草莓快繁的影響

圖4 不同pH對“紅顏”草莓品種快繁的影響

3.3 碳源及濃度對草莓快繁的影響

碳源的功能是提供培養(yǎng)材料合成大分子的碳骨架和所需能量。對碳源的利用能力取決于自身酶系的活性。本實驗結(jié)果表明麥芽糖作為碳源的增殖效果最差，而用葡萄糖和蔗糖的增殖效果差異不顯著(見圖5)。雖然用葡萄糖作為碳源繁殖系數(shù)稍高，但考慮到大規(guī)模生產(chǎn)過程中降低成本的問題，筆者建議用蔗糖代替葡萄糖。

圖5 不同碳源對“紅顏”快繁的影響

糖濃度的大小影響培養(yǎng)材料能量的獲取，但糖也是調(diào)節(jié)培養(yǎng)基滲透壓的重要成分。本實驗結(jié)果表明隨著蔗糖的濃度升高，“紅顏”的繁殖系數(shù)也逐漸增加。但蔗糖濃度超過3%，繁殖系數(shù)反而逐漸降低，草莓的生長受到影響，如出現(xiàn)黃化現(xiàn)象等。草莓黃化會使葉綠素的含量顯著降低，在某種程度上會影響到草莓植株的光合作用，植株光合效率降低［9］。朱至清提出在生根培養(yǎng)基中，蔗糖的濃度降低到1%—1.5%，不僅促使試管苗增強自養(yǎng)能力，還可使根系發(fā)育更加健全［10］。

與其它植物類似，草莓的組培快繁受基因及外植體部位的影響。近年來，段黃金［4］、張年忠［5］、艾勇［6］等的研究表明在草莓的組培快繁工作中，要根據(jù)品種及外植體的部位，采用不同的激素種類和配比，不能盲目套用?？梢?，尋找適合草莓快速增殖的最佳培養(yǎng)基，滿足生產(chǎn)需要，仍是植物組織培養(yǎng)工作者不斷地研究和探討的課題。

［1］趙密珍，王靜，王壯偉，等.世界草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及江浙滬草莓產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展對策［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學，2012，40(2):1-3.

［2］徐振南，萬蜀淵.影響草莓花藥培養(yǎng)效率的若干因素［J］.上海農(nóng)業(yè)學報 1995，11(3):27-30.

［3］崔廣榮，陳家剛.草莓的叢芽誘導及生根研究［J］.中國林副特產(chǎn)，2004.2(1):14-16.

［4］段黃金，段新玲，趙書珍.草莓莖段組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)的初步研究［J］.塔里木農(nóng)墾大學學報，2000(2):31-33.

［5］張連忠，李文金，蔚承祥，等.四季草莓“賽娃”的組織培養(yǎng)與快速繁殖［J］.植物生理通訊，2002(1):55.

［6］艾勇，趙佐敏，唐紅.草莓組織培養(yǎng)及產(chǎn)業(yè)化應用初步研究［J］.種子，2002(5):56-58.

［7］和秀云，畢海林，薛潤光，等.草莓‘托特母’的組培快繁技術(shù)研究［J］.西南農(nóng)業(yè)學報，2013，26(2):701-704.

［8］王新華，趙恒田，盛慶軍.草莓脫病毒與離體快繁［J］.農(nóng)業(yè)系統(tǒng)與科學研究，2003，19(4):300-301.

［9］曹善東、賈洪濤.不同碳源對草莓脫毒苗組培快繁的影響［J］.山東林業(yè)科技，2003(3):6-7.

［10］朱至清.植物細胞工程［M］.北京:化學出版社，1998:116-144.