李南南，張軍平，仲愛芹，呂仕超

(天津中醫(yī)藥大學(xué)1.研究生院;2.第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，天津300073)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，表現(xiàn)為慢性進(jìn)行性炎性反應(yīng)、脂質(zhì)沉積和管壁纖維化等，是引起死亡的許多疾病的病理基礎(chǔ)，嚴(yán)重危害人類健康和生存質(zhì)量。RhoA/ROCK通路參與AS 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，包括從內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)功能改變到斑塊的形成與破裂。本文對(duì)有關(guān)RhoA/ROCK 信號(hào)通路及其在AS 發(fā)展中的作用機(jī)制作一綜述。

1 RhoA/ROCK 通路構(gòu)成

1.1 Rho 和ROCK 的基本特征

Rho 家族蛋白是一類廣泛存在于所有真核組織中的具有GTP 酶活性的小G 蛋白，它們被形象的稱為“分子開關(guān)”，在細(xì)胞的增生、凋亡和基因的表達(dá)等方面起著十分重要的作用［1］。Rho 蛋白受3 類因子(GEFs、GAPs 和GDIs)調(diào)節(jié)，GEFs、GAPs 控制Rho 兩種狀態(tài)的轉(zhuǎn)化，而GDIs 結(jié)合Rho 蛋白作為其錨定裝置調(diào)節(jié)特定部位的空間活性［2］。此外，亦有其他調(diào)節(jié)機(jī)制，如microRNA 參與Rho GTP 酶mRNA 的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié);棕櫚?；秃硕ㄏ蛴绊懫浼?xì)胞內(nèi)分布等［3］。

RhoA 是Rho 家族成員之一，其最主要的效應(yīng)分子——ROCK 包括兩種同工型:ROCK1 和ROCK2。結(jié)構(gòu)上與其他許多激酶相似，ROCK 也有自抑制性的C 末端區(qū)域，包括RBD(Rho 結(jié)合區(qū)域)和PH 區(qū)域，靜息狀態(tài)下均能獨(dú)立的與N 端的激酶區(qū)域結(jié)合，抑制激酶活性。

激活的GTP-RhoA 能夠與ROCK 的RBD 區(qū)域結(jié)合，從而破壞激酶區(qū)域與C 末端區(qū)域的自抑制性結(jié)合，釋放激酶活性。此外，一些脂類如花生四烯酸可與PH 區(qū)域結(jié)合，不依賴Rho 而激活ROCK;蛋白的低聚化也能調(diào)節(jié)ROCK 的活性，該機(jī)制可能是通過(guò)氨基末端的轉(zhuǎn)磷酸作用。近來(lái)的研究表明［4］，其他的一些小GTPase 如Gem、Rad 和RhoE 表現(xiàn)出ROCK 的負(fù)性調(diào)控作用。

1.2 RhoA/ROCK 通路的下游底物

在細(xì)胞外界如血漿與溶血磷脂酸(LPA)［5］等刺激下，細(xì)胞募集并激活GEFs，GEFs 催化GDP 向GTP 的轉(zhuǎn)化，活化狀態(tài)的GTP-Rho 激活ROCK 使其表現(xiàn)出激酶活性并磷酸化多種下游底物，尤其是一些參與肌動(dòng)蛋白纖維組裝與收縮的相關(guān)蛋白，如肌球蛋白輕鏈(MLC)、肌球蛋白磷酸酶(MLCP)、LIM激酶(LIMK)和埃茲蛋白/根蛋白/膜突蛋白復(fù)合體(ERM)等。

MLC 和MLCP 與細(xì)胞收縮密切相關(guān)，ROCK 能直接磷酸化MLC 的Ser19［6］，ROCK2 可磷酸化MLCP的Thr697、Ser854和Thr855［7］，抑制MLCP 對(duì)MLC 的去磷酸化作用，最終表現(xiàn)為MLC 磷酸化水平的增加和細(xì)胞收縮。

LIMK 是一類參與調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白骨架的激酶，能夠磷酸化絲切蛋白(Cofilin)——一種肌動(dòng)蛋白解聚蛋白，受LIMK 磷酸化后，Cofilin 活性受到抑制。ROCK 對(duì)LIMK 的磷酸化能增強(qiáng)其抑制Cofilin 介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白骨架解聚作用，增加肌動(dòng)蛋白骨架的數(shù)量。ROCK 還可激活并調(diào)節(jié)其他下游底物，如內(nèi)收蛋白、ERM 蛋白復(fù)合體、GFAP 和NF-L 等［8］，在細(xì)胞中發(fā)揮不同的作用。

2 RhoA/ROCK 通路與動(dòng)脈粥樣硬化

AS 以內(nèi)皮功能損傷為起始，引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞激活和促炎性細(xì)胞聚集，活化的血小板沉積于損傷的內(nèi)皮，釋放多種細(xì)胞介質(zhì)活化血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)和單核-巨噬細(xì)胞，致使VSMC 從肌層遷移到內(nèi)膜層并增生產(chǎn)生大量基質(zhì)，誘導(dǎo)單核-巨噬細(xì)胞的趨化和遷移，最終導(dǎo)致管壁對(duì)血漿中脂類物質(zhì)的通透性增加，脂質(zhì)沉積和巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成［9］。隨著其他炎性細(xì)胞和脂類物質(zhì)的不斷增加，逐漸形成了脂質(zhì)斑塊和血管狹窄。

2.1 RhoA/ROCK 通路與內(nèi)皮功能損傷

AS 炎性反應(yīng)多個(gè)階段均有RhoA/ROCK 通路的參與。內(nèi)皮功能損傷即內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)生物活性的減低，是AS 最早期的表現(xiàn)［10］。eNOS 在維持血管正常生理功能方面起著十分重要的作用，而ROCK 則通過(guò)多個(gè)途徑下調(diào)eNOS 的表達(dá)與活性。

eNOS 的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)，慢性缺氧和細(xì)胞增殖過(guò)程能夠激活RhoA/ROCK 通路，而他汀類藥物能夠抑制該通路，增加eNOS mRNA 的穩(wěn)定性。表明RhoA/ROCK 能夠通過(guò)改變eNOS mRNA 的穩(wěn)定性，負(fù)性調(diào)節(jié)eNOS 的表達(dá)。eNOS mRNA 的3'端非翻譯區(qū)域復(fù)合物(3'UTR)能夠通過(guò)與多種胞質(zhì)蛋白的結(jié)合，調(diào)節(jié)其穩(wěn)定性。由于RhoA/ROCK 通路與肌動(dòng)蛋白骨架也能夠調(diào)節(jié)eNOS mRNA 的半衰期，推測(cè)與3'UTR 相結(jié)合的胞質(zhì)蛋白可能也是一類肌動(dòng)蛋白骨架相關(guān)蛋白［11］。

此外，它還能直接調(diào)節(jié)eNOS 的活性，后者有賴于細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，及eNOS 相關(guān)蛋白和翻譯后修飾。在抑制RhoA/ROCK 通路后，能引起PI3K/Akt的迅速激活及eNOS Ser1177 的磷酸化，表明除調(diào)節(jié)eNOS 的表達(dá)外，RhoA/ROCK 通路直接調(diào)節(jié)eNOS活性的潛在作用［12］。

2.2 RhoA/ROCK 通路與血管內(nèi)皮通透性

內(nèi)皮通透性包括細(xì)胞旁途徑和跨細(xì)胞途徑，均受機(jī)械力和生物信號(hào)的精確調(diào)節(jié)。在血管內(nèi)皮細(xì)胞-細(xì)胞間不同的連接結(jié)構(gòu)中，最重要的是緊密連接(tight junction)和黏附連接(adherens junction)，共同形成了細(xì)胞-細(xì)胞間的黏附和屏障。黏附連接存在于所有血管床中，尤其是外周微血管系統(tǒng)，其分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是血管內(nèi)皮鈣黏著蛋白(VE-cadherin)［13］。內(nèi)皮細(xì)胞間通過(guò)VE-cadherin 連接，并與細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架相通，形成內(nèi)皮的緊密結(jié)構(gòu)。黏著斑作為一種維持細(xì)胞屏障功能的骨架連接復(fù)合體，使內(nèi)皮細(xì)胞固定于細(xì)胞外基質(zhì)，維持其正常通透性。

多種炎性刺激信號(hào)分子均能與細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列的信號(hào)傳導(dǎo)活動(dòng)，破壞細(xì)胞間的連接結(jié)構(gòu)，引起內(nèi)皮通透性的相應(yīng)改變。細(xì)胞內(nèi)這一信號(hào)的傳導(dǎo)可通過(guò)不同的途徑發(fā)揮作用，RhoA/ROCK 在細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架、黏著斑的形成和非肌細(xì)胞的收縮方面起著關(guān)鍵的作用。生理?xiàng)l件下，血管機(jī)械力的變化通過(guò)RhoA/ROCK活化演變?yōu)榧?xì)胞內(nèi)信號(hào)，維持內(nèi)皮完整性，尤其是細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)。當(dāng)受到凝血酶、VEGF 和嗜中性粒細(xì)胞等刺激時(shí)，血管內(nèi)皮通透性增加與RhoA/ROCK 通路活性的升高密切相關(guān)［14］。RhoA/ROCK通過(guò)直接磷酸化MLC 或抑制MLCP 活性，使MLC磷酸化水平增高，引起細(xì)胞收縮，細(xì)胞與細(xì)胞分離形成細(xì)胞間隙，內(nèi)皮通透性增高。也有研究表明這種作用只能導(dǎo)致暫時(shí)性的內(nèi)皮細(xì)胞高通透性，其持久效應(yīng)的維持可能與進(jìn)一步的應(yīng)力纖維和黏附斑的形成相關(guān)，但這些過(guò)程均依賴于RhoA/ROCK 通路的參與。RhoA 還能刺激Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，作用于骨架蛋白和細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)，影響細(xì)胞旁途徑通透性［15］。

2.3 RhoA/ROCK 通路與AS 斑塊的形成和破裂

AS 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，VSMC 在各類炎性因子的刺激下，穿過(guò)動(dòng)脈內(nèi)膜遷移進(jìn)入內(nèi)皮下增殖，并分泌一系列促炎性反應(yīng)分子，促進(jìn)局部炎性反應(yīng)的發(fā)展。纖維組織和增殖的VSMC 覆蓋、包被內(nèi)部脂質(zhì)核，逐步形成粥樣硬化性壞死，部分轉(zhuǎn)變?yōu)槠交〖?xì)胞源性的泡沫細(xì)胞。平滑肌細(xì)胞的遷移與增生促進(jìn)了血管的重塑和狹窄損傷，VSMC 的遷移與覆蓋增加了斑塊的穩(wěn)定性。當(dāng)VSMC 缺失，動(dòng)脈栓塞的風(fēng)險(xiǎn)也相應(yīng)增加。

RhoA/ROCK 通路介導(dǎo)了VSMC 的增殖與遷移。與野生型小鼠相比，血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor，PDGF)誘導(dǎo)的VSMC遷移在ROCK1+/-小鼠中顯著下降，但高濃度的PDGF 可以下調(diào)ROCK1/2，抑制VSMC 遷移［16］。ERK 核轉(zhuǎn)位可以作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，增加增殖細(xì)胞核抗原和細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，促進(jìn)VSMC 增殖，也可磷酸化肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白Palladin抑制細(xì)胞遷移，而ERK 的活性又受ROCK 調(diào)節(jié)［17］。一磷酸鞘氨醇(sphingosine I phosphate，SIP)是一種由血小板釋放的參與調(diào)控AS 的鞘脂類代謝產(chǎn)物，在VSMC 與EC 的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高濃度的SIP激活RhoA/ROCK 信號(hào)通路，產(chǎn)生金屬蛋白酶組織抑制劑因子TIMP-2，通過(guò)減少黏著連接的形成從而抑制細(xì)胞遷移效應(yīng)［18］。在血管炎性反應(yīng)與損傷的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭幸泊_定了ROCK 的激活。RhoA/ROCK還可通過(guò)參與AT1 受體激活誘導(dǎo)的細(xì)胞膜“出泡(membrane blebbing)”現(xiàn)象從而引起細(xì)胞遷移［19］?？傊琑hoA 可以通過(guò)多個(gè)途徑促進(jìn)/抑制VSMC 遷移，在不同的生理或病理?xiàng)l件下所表現(xiàn)出的效應(yīng)可能不盡相同，可能與黏著斑的形成有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

另一種參與AS 斑塊形成的重要細(xì)胞是單核巨噬細(xì)胞。局部炎性反應(yīng)引發(fā)單核細(xì)胞在損傷部位的趨化與黏附，內(nèi)皮下轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞大量吞噬清除沉積的脂質(zhì)，富含脂質(zhì)的巨噬細(xì)胞逐漸演變?yōu)榫奘杉?xì)胞源性泡沫細(xì)胞，該細(xì)胞發(fā)生壞死，便形成粥樣斑塊的一部分。在這種巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中，ROCK 活性顯著增強(qiáng)。使用RocK1 基因敲除小鼠，病理模型中動(dòng)脈粥樣硬化損傷明顯減輕，其部分原因與RocK1 缺乏的巨噬細(xì)胞黏附、脂質(zhì)攝取、泡沫細(xì)胞形成的減少有關(guān)。ROCK 在巨噬細(xì)胞中這些作用的具體機(jī)制及RocK2 是否參與了該過(guò)程尚不清楚。臨床觀察中也發(fā)現(xiàn)在AS 患者中，ROCK 活性顯著增高［20］。

RhoA/ROCK 通路還參與AS 形成過(guò)程的其他方面，如血栓形成及氧化應(yīng)激等，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3 展望

越來(lái)越多的證據(jù)表明，RhoA/ROCK 通路在AS發(fā)生中起著重要作用，ROCK 活性檢測(cè)有望成為心血管疾病新的診斷和預(yù)后指標(biāo)，抑制RhoA/ROCK通路也許是心血管疾病一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。盡管ROCK 參與AS 的多個(gè)階段，其中的許多分子機(jī)制并不清楚，并且ROCK 兩種亞型各自在AS 中的功能差異尚不明確。這需要更具選擇性的ROCK抑制劑或基因?qū)W方法特定敲除不同ROCK 亞型基因來(lái)研究其功能，進(jìn)一步了解ROCK 下游的確切分子機(jī)制，同時(shí)需要大量、長(zhǎng)期的臨床試驗(yàn)為更安全有效的ROCK 抑制劑的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

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