平金良 顧棟樺 徐煒 顧元忻 張靖華 宋鵬濤 方煒 劉進 戴利成

Snail、Slug在喉鱗狀細胞癌中表達與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系

平金良 顧棟樺 徐煒 顧元忻 張靖華 宋鵬濤 方煒 劉進 戴利成

目的 研究Snail、Slug基因在喉鱗狀細胞癌中的表達，探討其與腫瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系及臨床意義。方法 采用免疫組化EnVision法檢測74例喉鱗狀細胞癌組織及30例癌旁組織中Snail、Slug及Vimentin、E-cadherin的表達情況，統(tǒng)計分析其表達的相關(guān)性及與各臨床病理指標之間的關(guān)系。結(jié)果 Snail、Slug蛋白在喉鱗狀細胞癌組織中的陽性率為58．2%和55．4%，高于癌旁組織中陽性率（13．3%和16．7%，P＜0．05）。Snail、Slug蛋白表達與E-cadherin呈負相關(guān)性（r=-0．567，P＜0．001及r=-0．457，P＜0．001），與Vimentin的表達呈正相關(guān)性（r=0．453，P＜0．001及r=0．376，P＜0．001）。Snai、Slug蛋白表達與分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（均P＜0．05）。結(jié)論 轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug可能通過參與與調(diào)控EMT過程，與喉鱗狀細胞癌的發(fā)展和侵襲相關(guān)。

SnailSlug 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 喉腫瘤 鱗狀細胞癌

侵襲與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最本質(zhì)特征之一，也是臨床腫瘤治療失敗和死亡的主要原因。腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移受多基因、多因素、多步驟控制的極其復雜的過程。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是多細胞生物胚胎發(fā)生過程中的基本過程，在腫瘤發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移進展過程中扮演重要角色，成為近年腫瘤研究的熱點之一[1]。研究表明轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug參與了EMT的發(fā)生，促使腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[2]。喉鱗狀細胞癌是頭頸部常見的一種惡性腫瘤，且近年有上升趨勢，嚴重威脅人類的健康。本文通過檢測喉鱗狀細胞癌中Snail、Slug的表達，探討其介導EMT在喉鱗狀細胞癌浸潤、轉(zhuǎn)移中的作用及意義。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 收集湖州市中心醫(yī)院2005-01—2010-12資料完整的74例喉癌根治手術(shù)標本，其中男61例，女13例；年齡43～88歲，平均63.68歲，中位年齡64歲；根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（UICC）TNM分期標準（2010版），Ⅰ～Ⅱ期26例，Ⅲ～Ⅳ期48例；分化程度：高、中分化55例，低分化19例；腫瘤甲狀軟骨受累20例，未累及54例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例；患者術(shù)前均未接受過放療和化療。同時選取30例癌旁黏膜上皮組織（距腫瘤外緣距離＞2cm）作為對照組。樣本組織均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋。

1.2 主要試劑 兔抗人多克隆Snail、Slug抗體購自美國Santa Cruz公司，Vimentin和E-cadherin單克隆抗體及EnVision免疫組化試劑盒購自丹麥DAKO公司，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 免疫組織化學染色 免疫組織化學采用EnVision二步法，按產(chǎn)品說明書操作。操作步驟簡述如下：組織切片經(jīng)脫蠟、脫二甲苯、水化后，0.3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶15min，檸檬酸鈉緩沖液（0.01mol/L，pH6.0）微波抗原修復10min，冷卻至常溫，滴加一抗（Snail、Slug工作濃度1∶100，Vimentin和E-cadherin工作濃度1∶200），37℃孵育40min，滴加酶標抗鼠/兔聚合物，室溫下孵育30min，滴加二氨基聯(lián)苯胺（3，3＇-diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木精復染細胞核，常規(guī)脫水，透明，封片，光鏡下觀察。以PBS代替一抗作陰性對照，已知陽性切片作陽性對照。

1.4 結(jié)果判定 免疫組化染色結(jié)果由2位高年資病理醫(yī)師采用雙盲法閱片進行判定。Snail、Slug蛋白以細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃或棕紅色顆粒為陽性表達，染色結(jié)果綜合染色強度及陽性細胞數(shù)進行分析，染色強度積分分值（IRS）=SI×PP。SI表示染色強度：無著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分；PP表示陽性細胞數(shù)百分比：無陽性細胞為0分，＜10%為1分，10%～50%為2分，＞50%為3分，積分分值（IRS）0～2分為陰性，3～9分為陽性。

圖1 喉鱗癌細胞中snail表達陽性，細胞核及細胞漿呈現(xiàn)棕黃色顆粒（Envision法，×100）

圖2 喉鱗癌細胞中slug表達陽性，細胞核及細胞漿呈現(xiàn)棕黃色顆粒（Envision法，×200）

Vimentin以細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色顆粒為陽性表達，≤20%為陰性，＞20%為陽性。E-cadherin免疫組化結(jié)果判讀：染色后隨機選取10個400倍高倍視野，以細胞膜呈明顯棕紅色圈狀染色為陽性，陽性細胞數(shù)≥50%判為E-cadherin正常表達，＜50%為E-cadherin表達減弱[3]。1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料比較采用t檢驗，Snail、Slug、Vimentin和E-cadherin表達及與喉鱗狀細胞癌臨床病理關(guān)系分析選擇χ2檢驗，各基因蛋白表達間的關(guān)系分析采用Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 Snail、Slug蛋白在喉鱗狀細胞癌、癌旁組織中的表達 Snail在陽性表達位于細胞質(zhì)和（或）細胞核，喉鱗狀細胞癌組織43例呈陽性表達（陽性率58.2%）（圖1），癌旁組織4例陽性表達（陽性率13.3%），兩者的差異有統(tǒng)計學意義（χ2=14.816，P＜0.01）。Slug陽性表達定位于細胞質(zhì)和（或）細胞核，在喉鱗狀細胞癌組織41例陽性表達（陽性率55.4%，圖2），癌旁組織的5例陽性表達（陽性率16.7%），兩者差異有統(tǒng)計學意義（χ2=12.986，P＜0.01）。

2.2 E-cadherin及Vimentin蛋白在喉鱗狀細胞癌、癌旁組織中的表達 E-cadherin陽性信號均勻分布于細胞連接處的細胞膜上，清晰溝畫出細胞輪廓（圖3）。喉鱗狀細胞癌中，39例樣本腫瘤細胞的E-cadherin表達下降（占52.7%），35例表達正常水平（占47.3%），30例癌旁黏膜上皮組織E-cadherin均正常表達（100%），鱗癌細胞中E-cadherin表達明顯低于癌旁黏膜（χ2= 25.297，P＜0.01）。Vimentin陽性表達主要定位于細胞漿（圖4），26例喉鱗狀細胞癌組織呈陽性表達（占35.1%），而癌旁組織未見陽性表達，兩者差異有統(tǒng)計學意義（χ2= 14.054，P＜0.01）。

2.3 Snail、Slug及Vimentin、E-cadherin喉鱗狀細胞癌中表達的相關(guān)性 經(jīng)Spearman相關(guān)分析，喉鱗狀細胞癌中Snail、Slug與E-cadherin蛋白表達呈負相關(guān)（r=-0.567，P＜0.01及r=-0.457，P＜0.01），與Vimentin蛋白表達呈正相關(guān)（r=0.453，P＜0.01及r=0.376，P＜0.01）。Snail與Slug在喉鱗狀細胞癌中表達呈正相關(guān)（r=0.616，P＜0.01）。

圖3 喉鱗癌中E-cadherin表達下降，局部高分化癌細胞呈正常表達（Envision法，×200）

圖4 喉鱗癌中vimentin表達陽性（Envision法，×400）

2.4 Snail、Slug表達與喉鱗狀細胞癌臨床病理關(guān)系 見表1。

表1 Snail和Slug的表達與喉鱗癌臨床病理的關(guān)系

由表1可見，Snail與Slug蛋白表達與腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)（均P＜0.05），Snail與Slug表達陽性組病例的分化程度更差，表現(xiàn)更高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率及更高的TNM分期。

3 討論

EMT是上皮細胞在特定生理和病理情況下向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，是具有極性的上皮細胞黏附性下降和細胞移動能力增加，重塑細胞骨架的過程。其中E-cadherin功能喪失被認為是EMT發(fā)生的一個標志性事件。E-cadherin是細胞間黏附分子，主要介導同種細胞間的黏附反應，是維護上皮細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整性和極性的重要分子。在EMT過程中的重要特征之一是細胞的表型發(fā)生改變，上皮細胞標志的E-cadherin逐漸下降、喪失，間質(zhì)標志Vimentin表達上調(diào)，使癌細胞的獲得浸潤和轉(zhuǎn)移能力在腫瘤的侵襲和遠處轉(zhuǎn)移中起重要作用[4]。

Snail和Slug是鋅指轉(zhuǎn)錄因子snail家族中的主要成員，在生物的胚胎發(fā)育及生命活動中發(fā)揮重要的作用，研究表明snail家族成員是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中的重要調(diào)控因子。Snail和Slug可以和E-cadherin基因啟動區(qū)的E-box結(jié)合，抑制靶蛋白表達[2]。

本研究結(jié)果顯示74例喉鱗狀細胞癌中39例E-cadherin表達下降，26例Vimentin呈陽性表達，提示在部分喉鱗狀細胞癌中可能發(fā)生了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。進一步分析發(fā)現(xiàn)，Snail、Slug表達與E-cadherin呈負相關(guān)性，與Vimentin陽性呈正相關(guān)，提示Snail、Slug參與或誘導了喉鱗狀細胞癌EMT的發(fā)生。本研究顯示在癌旁組織中Snail、Slug很少表達，而在喉鱗癌中的表達明顯增加，并且Snail、Slug表達均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和甲狀軟骨侵犯密切相關(guān)，并且預示更差的組織學分級以及臨床TNM分期。張華東等[5]的研究也發(fā)現(xiàn)喉鱗狀細胞癌組織中Snail的表達發(fā)生上調(diào)，并且與患者的預后密切相關(guān)，與本文的結(jié)果相一致；雖然許多實驗證明了Slug在腫瘤EMT過程中非常重要[6-7]，但其在喉鱗癌中的研究較少報道，本研究結(jié)果提示Slug同樣促進喉鱗癌的EMT，并且使腫瘤獲得了更強的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

綜上，本文結(jié)果表明在喉鱗狀細胞癌中存在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，Snail、Slug在喉鱗癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮一定作用，可以對臨床預后的判斷和分子生物治療有潛在價值。

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Expression of snail and slug in laryngeal squamous carcinoma and its relation to epithelial-mesenchymal transition,tumor invasion and

metastasis

Objective To investigate the expression of snail and slug in laryngeal squamous carcinoma and its relation to epithelial-mesenchymal transition(EMT),tumor invasion and metastasis．Methods The expression of snail,slug,E-cadherin and vimentin was detected by immunihistochemistry in 74 specimens of laryngeal squamous carcinoma and 30 specimens of pericancerous mucosal tissue． Results The positive rates of snail and slug expression in laryngeal squamous carcinoma were 58．2%and 55．4%respectively,which were significantly higher than those in pericancerous mucosal tissue(13．3%and 16．7%,P＜0．05)．The expression of snail and slug were negatively correlated with E-cadherin(r=-0．567,P＜0．001 and r=-0．457,P＜0．001) and positively corrected with vimentin(r=0．453,P＜0．001 and r=0．376,P＜0．001)in laryngeal squamous carcinoma．The expression of snail and slug was closely correlated with pathological grade,TNM stage,thyroid cartilage involvement and lymph node metastasis of laryngeal squamous carcinoma．Conclusion Snail and slug are highly expressed in squamous laryngeal carcinoma;it may be involved in epithelial-mesenchymal transition,invasion and metastasis of the tumor．

SnailSlug Epithelial-mesenchymal transition Largneal tumorSquamous carcinoma

2014-09-18）

（本文編輯：田云鵬）

湖州市科技計劃項目（2012YSB19，2013GYB11）

313000 湖州市中心醫(yī)院病理科（平金良、顧棟樺、徐煒、顧元忻、宋鵬濤、方煒、劉進），頭頸外科（張靖華），中心實驗室（戴利成）

平金良，E-mail:pjl0173@163.com