趙中開，林 艷，楊建剛*，馬瑩瑩，林 秋，吳赫川

（四川理工學(xué)院 生工學(xué)院，四川 自貢 643000）

米曲霉（Aspergillus oryzae）是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局公布的40多種安全微生物菌種之一[1]，是食品釀造中的常用菌株，它不僅產(chǎn)酶種類多[2-3]，而且酶活力高，廣泛分布于各種酒曲中，是釀酒工業(yè)中的重要微生物。毛青鐘等[4]利用米曲霉制黃酒麥曲，所得曲的糖化力、液化力都得到很大的提高，此外，清酒曲是以大米為原料，以米曲霉為菌種，采用純種培養(yǎng)的方法制成的酒曲。種曲即為酒曲制作時(shí)的種子[5]，是高度富含制曲微生物孢子的生物制品，其在純種制曲領(lǐng)域占據(jù)著至關(guān)重要的地位[6-7]。目前，國(guó)外的種曲研究比較深入，生產(chǎn)應(yīng)用也比較普及，而我國(guó)這方面的研究與生產(chǎn)相對(duì)落后，有待進(jìn)一步加強(qiáng)[8]。

目前，我國(guó)已有關(guān)于米曲霉種曲的論文報(bào)道[9-10]，但是有關(guān)釀酒用米曲霉種曲的研究所見不多。該試驗(yàn)在前人所做研究的基礎(chǔ)上，以秈米為制曲原料，以種曲孢子數(shù)為優(yōu)化指標(biāo)[11]，采用均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法進(jìn)行試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)[12]，對(duì)米曲霉種曲的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為制備優(yōu)良的米曲霉酒曲提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米曲霉（Aspergillus oryzae）A52820121203：釀造酒實(shí)驗(yàn)室保藏。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，水1 000 mL，pH自然。

秈米：市售；釀造水，符合GB 5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》。

葡萄糖（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；乙醇體積分?jǐn)?shù)95%：成都市新都區(qū)木蘭鎮(zhèn)工業(yè)開發(fā)區(qū)；木灰：市售；無(wú)菌水：釀酒實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 儀器與設(shè)備

LHP-250恒溫培養(yǎng)箱：常州普天儀器制造有限公司；BH200生物顯微鏡：寧波舜字儀器有限公司；SYQ-DSX-280B高溫蒸汽滅菌鍋：申安醫(yī)療器誡廠；6102電子天平：杭州友恒稱重有限公司；BCD-256L電冰箱：青島樂(lè)家電器有限公司；WJ-JZX無(wú)菌接種箱：濟(jì)南杰康濟(jì)南凈化設(shè)備廠；血球計(jì)數(shù)板：玉環(huán)縣求精醫(yī)用儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 種曲制作工藝流程

1.3.2 工藝操作說(shuō)明

洗米：除去附在碎米表面的雜質(zhì)，如糠、塵土及夾雜物等。

浸米：由于秈米的吸水性較差，故需浸泡較長(zhǎng)時(shí)間，在20 ℃的條件下，需浸泡12 h以上。當(dāng)米粒從外觀上看透明感消失，變成純白色，用手碾米粒能將米粒碾碎時(shí)，即可將秈米撈出，瀝水0.5 h后，分裝蒸米。

蒸米：用高壓蒸汽滅菌鍋蒸米，條件為110 ℃、45 min。使蒸出的秈米熟而不爛，內(nèi)無(wú)白心生米。

接種：以無(wú)菌操作的方式按照相應(yīng)的接種量接入米曲霉孢子粉。

添加木灰：以無(wú)菌操作的方式按照相應(yīng)的木灰添加量加入木灰，拌勻。木灰是米曲霉種曲制備過(guò)程中非常關(guān)鍵的一種添加物，其主要作用體現(xiàn)在兩個(gè)方面，一是為米曲霉的生長(zhǎng)提供必要的礦物質(zhì)元素，促進(jìn)米曲霉產(chǎn)生孢子；二是使培養(yǎng)基更加的松散，為培養(yǎng)基內(nèi)部通氣和散熱創(chuàng)造條件。

扣瓶：米曲霉是一種好氧性微生物[13]，其菌絲在生長(zhǎng)時(shí)會(huì)相互纏繞，造成米粒結(jié)塊，導(dǎo)致曲料內(nèi)部缺氧，因此應(yīng)及時(shí)扣瓶，將結(jié)塊的米粒打散。本試驗(yàn)的扣瓶頻率為每12 h一次。

種曲培養(yǎng)：接種后第1天為米曲霉孢子的萌發(fā)階段，溫度為31 ℃，從第2天起根據(jù)不同試驗(yàn)要求設(shè)定培養(yǎng)溫度（14～46 ℃）。根據(jù)不同試驗(yàn)設(shè)定培養(yǎng)時(shí)間為1～10 d，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)一般肉眼可觀察到大量綠色米曲霉分生孢子的生成。

1.3.3 孢子數(shù)測(cè)定

樣品稀釋：精確稱取種曲1.00 g，倒入盛有玻璃珠的250 mL錐形瓶?jī)?nèi)，加體積分?jǐn)?shù)95%酒精5 mL，加無(wú)菌水20 mL，加稀硫酸10 mL，充分振搖，使分生孢子分散，然后用多層紗布過(guò)濾、沖洗，使濾渣不含孢子，稀釋至500 mL。

制片：用膠頭滴管取稀釋液l滴，滴于血球計(jì)數(shù)板的計(jì)算格上，然后將蓋玻片輕輕由一邊向另一邊壓下，使蓋片與計(jì)數(shù)板完全密合，計(jì)數(shù)區(qū)內(nèi)無(wú)氣泡，用濾紙吸干多余的溢出孢子液，靜置數(shù)分鐘，待孢子沉降。

觀察計(jì)數(shù)：采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用低倍鏡頭或高倍鏡頭觀察。孢子常位于大格的雙線上，應(yīng)全部取二邊計(jì)數(shù)，舍棄另二邊，以免重復(fù)計(jì)數(shù)。本試驗(yàn)采用的是25×16型的計(jì)數(shù)板，需要數(shù)左上、左下、右上、右下和中間共計(jì)5個(gè)大格的孢子數(shù)，每個(gè)樣品重復(fù)觀察兩次，其平均值即為該樣品種曲的孢子數(shù)，孢子數(shù)計(jì)算公式如下。

式中：N表示80個(gè)小格內(nèi)的孢子總數(shù)，個(gè)；n表示稀釋倍數(shù)。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

接種量對(duì)種曲孢子數(shù)的影響：在250 mL三角瓶中分別裝入30 g已浸泡并瀝干水的大米，經(jīng)高壓滅菌鍋滅菌后，分別按接種量0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%接入米曲霉孢子粉，再分別添加1%的木灰，拌勻后31 ℃培養(yǎng)1 d，30 ℃培養(yǎng)4 d，前兩天每隔12 h扣瓶一次，培養(yǎng)結(jié)束后計(jì)種曲孢子數(shù)。

木灰添加量對(duì)種曲孢子數(shù)的影響：在250 mL三角瓶中分別裝入30 g已浸泡并瀝干水的大米，經(jīng)高壓滅菌鍋滅菌后，分別按上述所確定的最佳接種量接入米曲霉孢子粉，再分別添加0、1%、2%、3%、4%的木灰，拌勻后按上述條件培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后計(jì)種曲孢子數(shù)。

溫度對(duì)種曲孢子數(shù)的影響：在250 mL三角瓶中分別裝入30 g已浸泡并瀝干水的大米，經(jīng)高壓滅菌鍋滅菌后，分別按上述所確定的最佳接種量接入米曲霉孢子粉，最佳的木灰添加量加入木灰，拌勻后31 ℃培養(yǎng)1 d，而后分別在14 ℃、22 ℃、30 ℃、38 ℃、46 ℃培養(yǎng)4 d，前兩天每隔12 h扣瓶一次，培養(yǎng)結(jié)束后計(jì)種曲孢子數(shù)。

時(shí)間對(duì)種曲孢子數(shù)的影響：在250 mL三角瓶中分別裝入30 g已浸泡并瀝干水的大米，經(jīng)高壓滅菌鍋滅菌后，分別按上述所確定的最佳接種量接入米曲霉孢子粉，以最佳的木灰添加量加入木灰，拌勻后31 ℃培養(yǎng)1 d，而后分別在上述所確定的最佳溫度下培養(yǎng)，包括種子萌發(fā)培養(yǎng)時(shí)間（1 d）分別培養(yǎng)3 d、5 d、7 d、9 d、11 d，前兩天每隔12 h扣瓶一次，培養(yǎng)結(jié)束后計(jì)種曲孢子數(shù)。

1.3.5 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以接種量、木灰添加量、培養(yǎng)時(shí)間和溫度為優(yōu)化種曲孢子數(shù)的4個(gè)因素，確定各因素與水平，具體的因素水平見表1。

其中，對(duì)溫度取4個(gè)水平，其余3個(gè)因素均取6個(gè)水平，具體的因素水平見表1。

表1 孢子數(shù)優(yōu)化均勻試驗(yàn)因素水平Table1 Factors and levels of the uniform experiment for spore number optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)優(yōu)化米曲霉培養(yǎng)條件

2.1.1 接種量對(duì)種曲孢子數(shù)的影響

不同接種量下培養(yǎng)結(jié)束后種曲孢子數(shù)結(jié)果見圖1。由圖1可知，接種量小時(shí)，接入的生物量不足，培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩，種曲的孢子數(shù)也少，隨著接種量增加種曲孢子數(shù)量也在增多，當(dāng)接種量增加至0.10%時(shí)，種曲孢子數(shù)最多，故選擇接種量為0.10%。

圖1 接種量對(duì)種曲孢子數(shù)的影響Fig.1 Effect of inoculum on spore number of seed koji

2.1.2 木灰添加量對(duì)種曲孢子數(shù)的影響

圖2 木灰添加量對(duì)種曲孢子數(shù)的影響Fig.2 Effect of wood ash addition on spore number of seed koji

不同木灰添加量下培養(yǎng)結(jié)束后種曲中孢子數(shù)測(cè)定結(jié)果見圖2。木灰的添加量過(guò)多過(guò)少都會(huì)影響種曲孢子的數(shù)量，一定量的木灰不僅可以為米曲霉的生長(zhǎng)提供必要的礦物質(zhì)元素，促進(jìn)米曲霉產(chǎn)生孢子，還可以使培養(yǎng)基更加松散，為培養(yǎng)基內(nèi)部通氣和散熱創(chuàng)造條件，由圖2可以看出，種曲孢子數(shù)隨木灰添加量先增加后減少，當(dāng)木灰添加量為1%時(shí)，種曲孢子數(shù)最多，故選擇木灰添加量為1%。

2.1.3 溫度對(duì)種曲孢子數(shù)的影響

不同培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)結(jié)束后種曲中孢子數(shù)測(cè)定結(jié)果見圖3。由圖3可知，微生物的活動(dòng)受溫度影響極其明顯，微生物的生長(zhǎng)均有其特定的最佳溫度范圍，溫度過(guò)低過(guò)高都影響其體內(nèi)的生理生化反應(yīng)，如酶活性，從而影響其生長(zhǎng)代謝。米曲霉的最適生長(zhǎng)溫度30～35 ℃，＜25 ℃生長(zhǎng)緩慢，＞40 ℃生長(zhǎng)困難。培養(yǎng)溫度過(guò)低或過(guò)高，均無(wú)法產(chǎn)孢子，在培養(yǎng)溫度30 ℃時(shí)種曲孢子數(shù)最多，故選擇培養(yǎng)溫度為30 ℃。

圖3 培養(yǎng)溫度對(duì)種曲孢子數(shù)的影響Fig.3 Effect of culture temperature on spore number of seed koji

2.1.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)種曲孢子數(shù)的影響

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)種曲孢子數(shù)的影響Fig.4 Effect of culture time on spore number of seed koji

不同培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)結(jié)束后種曲中孢子數(shù)測(cè)定結(jié)果見圖4。由圖4可知，培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短，菌絲處于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，產(chǎn)孢子不足，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，米曲霉生長(zhǎng)進(jìn)入繁殖階段，大量分生孢子形成，種曲孢子數(shù)增多，在第7天達(dá)到最高值，而后隨時(shí)間延長(zhǎng)，易產(chǎn)生大量的休眠孢子，也有一部分孢子二次萌發(fā)，種曲孢子數(shù)趨于穩(wěn)定。故選擇培養(yǎng)時(shí)間為7 d。

2.2 均勻試驗(yàn)優(yōu)化米曲霉種曲培養(yǎng)條件

由于本試驗(yàn)中包含3個(gè)6水平因素和1個(gè)4水平因素，故需采用混合水平均勻設(shè)計(jì)表來(lái)安排試驗(yàn)。根據(jù)本試驗(yàn)的實(shí)際情況，盡量減少試驗(yàn)誤差，選用均勻試驗(yàn)表U12（12×62×4）來(lái)安排試驗(yàn)。由于該表的第1列有12個(gè)水平，所以還需采用擬水平法將該列相鄰的2個(gè)水平合并為因素水平表中的1個(gè)水平，試驗(yàn)方案詳見表2，模型回歸統(tǒng)計(jì)與方差分析見表3～表5。

由表2可以看出，各因素的相關(guān)組合下米曲霉種曲的產(chǎn)孢子數(shù)的變化。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為8 d，接種量為0.10%，木灰添加量為1.8%，培養(yǎng)溫度30 ℃時(shí)，種曲產(chǎn)孢子數(shù)最多，為5.9×108個(gè)/g。

應(yīng)用SPSS軟件中的線性回歸分析程序?qū)υ囼?yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理[14-15]，得到統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3～表5。

表2 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Designation and results of uniform experiment

表3 模型回歸統(tǒng)計(jì)Table 3 Model regression statistics

表4 回歸方程的方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

表5 回歸系數(shù)方差分析Table 5 Variance analysis of regression coefficient

由表3可知，該模型的R2=0.952，說(shuō)明該回歸方程擬合較好。由表4可知，P=0.001（＜0.05），說(shuō)明回歸方程模型是極顯著的。由表5可知，回歸方程Y=7.996-0.482X2-0.083X12-0.004X42+0.509X1X3-0.048X3X4，根據(jù)R2=0.952和表4中方差分析可以判斷回歸方程非常顯著（P＜0.01）；再根據(jù)t檢驗(yàn)結(jié)果，所有的偏回歸系數(shù)也都顯著（P＜0.05）。所以，建立的回歸方程有意義。

由表5可知，各因素對(duì)種曲孢子數(shù)影響的主次順序?yàn)椋篨1X3＞X12＞X3X4＞X2＞X42。

利用Excel的規(guī)劃求解功能對(duì)回歸方程進(jìn)行求解，得到的極值點(diǎn)為：X1=6.43，X2=0.1，X3=2.1，X4=25，按實(shí)際操作即培養(yǎng)時(shí)間6.4 d，接種量0.1%，木灰添加量2.1%，培養(yǎng)溫度25 ℃。將此最佳培養(yǎng)條件代入回歸方程，得到最佳培養(yǎng)條件下的預(yù)期孢子數(shù)為6.37×108個(gè)/g。在最佳條件下對(duì)預(yù)測(cè)值進(jìn)行驗(yàn)證，最后得到的孢子數(shù)真實(shí)值為6.33×108個(gè)/g，與預(yù)測(cè)值接近。

3 結(jié)論

試驗(yàn)以秈米為原料，應(yīng)用均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)米曲霉種曲的制備工藝進(jìn)行了研究。經(jīng)均勻試驗(yàn)優(yōu)化后，確定按實(shí)際操作的最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)時(shí)間6.4 d，接種量0.1%，木灰添加量2.1%，培養(yǎng)溫度25 ℃。在此條件下制備的種曲的孢子數(shù)為6.33×108個(gè)/g，與預(yù)測(cè)值很接近，說(shuō)明回歸模型較為可靠。通過(guò)本試驗(yàn)種曲制備的優(yōu)化，在釀造生產(chǎn)中可直接減少種曲用量，有利于經(jīng)濟(jì)效益的提高。

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