武密山， 趙素芝， 任立中， 王 茹， 白 霞， 韓紅偉， 李 彬

（1.河北中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院方劑學(xué)教研室， 河北 石家莊 050200； 2.石家莊市橋東區(qū)勝北社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心， 河北 石家莊 050041； 3.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院骨科， 河北 石家莊 050031； 4.河北醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)教研室，河北 石家莊 050017）

密骨打老兒丸對(duì) 去卵巢骨 質(zhì) 疏松 大鼠 腰 椎 和腎 臟維 生 素 D受 體 m RNA表達(dá)的影響

武密山1， 趙素芝2*， 任立中3， 王 茹1， 白 霞1， 韓紅偉1， 李 彬4

（1.河北中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院方劑學(xué)教研室， 河北 石家莊 050200； 2.石家莊市橋東區(qū)勝北社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心， 河北 石家莊 050041； 3.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院骨科， 河北 石家莊 050031； 4.河北醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)教研室，河北 石家莊 050017）

目的 探討密骨打老兒丸 (打老兒丸加淫羊藿、 骨碎補(bǔ)、 補(bǔ)骨脂、 菟絲子等) 對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠生化指標(biāo)的影響。 方法 72 只 SD雌性大鼠, 隨機(jī)分為 6 組: 假手術(shù)組、 模型組、 維生素 D3(2 mg/kg) 組和密骨打老兒丸小、中、大劑量組。假手術(shù)組僅行假手術(shù),其余5組分別行卵巢切除術(shù)。術(shù)后1周分別灌胃給予密骨打老兒丸和維生素 D33 個(gè)月 。 采用 酶 聯(lián) 免疫吸附 法檢測(cè)血清 1,25-二羥 基 維生素 D3(1,25(OH)2D3) 水 平。 測(cè) 定股 骨 骨 密 度, 采 用實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR測(cè)定第 2 腰椎和腎臟組織維生素 D受體 (VDR)mRNA表達(dá)。 結(jié)果 與假手術(shù)組相比, 模型組股骨骨密度 、 血清和 腎 臟 1,25(OH)2D3、 腰椎和 腎 臟 組 織 VDR mRNA表 達(dá) 均 下 降 。 與 模 型 組 比 較, 密 骨 打 老 兒 丸 中 、大劑量組和維生素 D3組均可使股骨骨密度、 血清和腎臟 1,25(OH)2D3、 腰椎和腎臟組織 VDRmRNA表達(dá)增加。 結(jié)論 密骨打老兒丸和維生素 D3顯著提高去卵巢大鼠腰椎和腎臟組織 VDR mRNA表達(dá), 促進(jìn)腸鈣吸收與成骨細(xì)胞活性,增強(qiáng)骨質(zhì)量。

骨質(zhì)疏松癥； 密骨打老兒丸； 骨密度； 1,25-二羥基維生素 D3； 維生素 D受體； 大鼠

骨質(zhì)疏松癥 (Osteoporosis) 是以骨量減少、骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化 (松質(zhì)骨骨小梁變細(xì)、 斷裂、 數(shù)量減少,皮質(zhì)骨多孔、變薄)為特征,以致骨的脆性增高及骨折危險(xiǎn)性增加的一種全身骨病。前期研究表明,密骨打老兒丸在抑制骨丟失,改善骨密度,增強(qiáng)骨生物力學(xué)抗壓性能方面有明顯療效［1］。 本實(shí)驗(yàn)采取切除卵巢建立骨質(zhì)疏松模型,觀察密骨打老兒丸對(duì)大鼠股骨骨密度、 血清和腎臟 1,25-二羥基維生素 D3［1,25(OH)2D3］ 水平、腰椎和腎臟維生素D受體 (vitamin D receptor,VDR)mRNA表達(dá)的 影響,探討密骨打老兒丸防治去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨丟失和骨質(zhì)量下降的作用機(jī)理。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物 3 月齡 SPF級(jí)雌性 SD大鼠共 72 只,體質(zhì)量 (265 ±15)g, 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 中 心 提 供 ［ 許 可 證 號(hào):SCXK( 冀)2003-1-003］。

1.2 儀器與試劑 Lunar-XR型雙能 X線骨密度測(cè)定儀 (美國(guó) Lunar公司產(chǎn)品),ALCYON 300i型全自動(dòng)生化儀 (美國(guó) Abbott Laboratories公司產(chǎn)品), J 2—SH高速冰凍離心機(jī) (中國(guó)杭州華亭公司產(chǎn)品),D-800 LS 智能藥物溶出儀 (天津大學(xué)無線電公司產(chǎn)品),GENIOS 多功能酶標(biāo)儀 (奧地利 TECAN公司),RG-3000 Real-time PCR儀 (澳 大 利亞 Corbett Research 公 司), 美 國(guó) MIS—2000 SP型 3 Y顯 微 圖 像 分 析 儀,3 Y分 析 軟 件 (Pro,Ver, 4.0),1,25(OH)2D3酶 聯(lián) 免 疫 試 劑 盒 ( 英 國(guó) IDS公司),SYBR Green Ⅰ 熒光染料 (美國(guó) Biotium公司),Trizol總 RNA 提 取 試 劑 盒 (Takara公 司), cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Fermentas公司),Taq DNA聚合酶、 dNTP(MBI公司)。 維生素 D滴劑 (廈門星鱉制藥有限公司, 國(guó)藥準(zhǔn)字 H 35021450, 產(chǎn)品批號(hào) 2914002), 每粒含 維生素 D3400 單 位, 用雙蒸水配 制 成 0.5 μg/100 mL溶液, 溶 液配制好后分裝小試劑瓶?jī)?nèi),避光低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 中藥制備 打老兒丸來源于 《萬氏家抄方.卷四》, 組成是石菖蒲、 干山藥、 川牛膝、遠(yuǎn)志、巴戟天、川續(xù)斷、五味子、楮實(shí)子、杜仲、山萸肉、茯神、熟地黃、小茴香、肉蓯蓉、枸杞子各等分。打老兒丸加上本課題前期研究具有促進(jìn)成骨作用的 淫 羊 藿［2］、 骨 碎補(bǔ)［3］、補(bǔ) 骨 脂［4］、 菟 絲 子［1］各等分,組成密骨打老兒丸,飲片一次性購(gòu)自石家莊市樂仁堂,按處方配伍后,加8倍量水,共同浸泡 40 min, 煮沸后文 火 煎 煮 60 min, 濾 出 藥 液 ；藥渣加 2 倍水量繼續(xù)煎煮 40 min, 合并兩次濾液,水浴濃縮, 每1 mL藥 液 含 生 藥 5.5 g, 相 當(dāng) 于 臨 床用量的 20 倍。 小劑量密骨打老兒丸灌胃劑量為1.25 m L/kg, 中 劑 量密骨打 老 兒丸 灌 胃 劑 量 為 2.5 mL/kg, 大劑量密骨打老兒丸灌胃劑量為 5mL/kg。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)造模與分組 健康 3 月齡 SD雌性大鼠72只, 隨機(jī)分為 6 組: 假手術(shù)組、 模型組、 對(duì)照藥物維生素 D3組和密骨打老兒丸小、 中、大劑量組, 每組 12只。將動(dòng)物乙醚麻醉, 腰背部?jī)蓚?cè)剪毛,75%乙醇消毒, 假手術(shù)組大鼠從背部切口, 找到卵巢后,只切除少量脂肪組織后縫合；其他各組均參照本實(shí)驗(yàn)室的背馱式方法［2］從背側(cè)切口摘除雙側(cè)卵巢,縫合傷口,然后涂以紅霉素軟膏抗感染,于卵巢切除 1周后,給大鼠灌胃給藥:密骨打老兒丸 小 劑量組 大 鼠 灌 胃 給 予 1.25 m L/kg密 骨打老兒丸混懸液,密骨打老兒丸中劑量組大鼠灌胃給予 2.5mL/kg密骨打老兒丸混懸液, 密骨打老兒丸大劑 量 組大鼠灌胃 給 予 5 mL/kg密 骨 打 老 兒 丸混懸液,對(duì)照組大鼠灌胃給予對(duì)照藥物維生素 D3混懸液 (2 mg/kg), 假 手 術(shù) 組 和 模 型 組 分別 灌 胃給予與密骨 打 老 兒丸大劑 量 組 等 體 積 (5 mL/kg)的蒸餾水,連續(xù)給藥 3個(gè)月后,腹主動(dòng)脈取血,離心,分離出血清；取腎臟同一部位小部分組織于凍存管中 -70 ℃保存；取大鼠的第 2 腰椎和股骨,小心剝離,去除表面軟組織,保留完整骨膜,冷生理鹽水紗布冷藏保存。

2.2 骨密度 （BMD） 測(cè)定 取右側(cè)股骨, 按文獻(xiàn)［8］ 分別測(cè)出股骨整體、股骨近端 (為股骨近側(cè)干骺端 1/3), 股骨遠(yuǎn)端 (為股骨遠(yuǎn)側(cè)干骺端 1/4)骨密度,最終以平均值計(jì)。

2.3 血清和腎臟組織 1，25（OH）2D3水平的測(cè)定將腎組織室溫復(fù)融后用生理鹽水洗凈去雜、稱定質(zhì)量、 剪碎 至 10 mL的組織勻漿 器 中, 按 1 g組織加入 5 mL PBS 緩 沖 液 的 比 例 進(jìn) 行 組 織 勻 漿, 將 組 織勻 漿液 移 入 5 mL離心管中 20 ℃ 5 000 r/min 離心15 min, 取 上 清 后 再 10 000 r/min 離 心 10 min 后取上清備用。 血清和腎臟組織 1,25(OH)2D3水平檢測(cè)操作過程按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.4 腰椎和腎臟組織 VDRmRNA表達(dá)的檢測(cè) 引物由上海博亞生物工程公司依據(jù) Genebank 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得基因序列合成。 VDR引物序列: 上游 5′-GTG ACT TTG ACC ACG ATT TC-3′, 下 游 5′-ATC ATC TCC CTC CCTCTG GT-3′, 擴(kuò)增片 段 長(zhǎng)度為 285 bp。β-actin 引 物序列: 上 游 5′-TTG ATG TCA CGCGGC ACG TG-3′, 下游 5′-TGT CCC TGT ATG TTA CGC TG-3′, 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 216 bp。

① 總 RNA提取: 采用 Trizol一步法分別提取腰椎、 腎臟組織中總 RNA, 紫外分光光度計(jì)測(cè)定總 RNA濃度,A260/A280均在 1.8 ～2.0?？?RNA濃度 =OD260值 ×8( μg/μL), 用 前 調(diào) 整 質(zhì) 量 濃 度至1 μg/μL。 ② 在逆轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV的作用下, 將mRNA 逆 轉(zhuǎn) 錄 成 cDNA 分 子, 反 應(yīng) 體 系:H2O 5.5 μL,Oligo(dT 18)1.0 μL,tRNA 6.0 μL, Rnasin 0.5 μL,5 × buffer 4.0 μL,10 mmol/L dNTP 2.0 μL,RT ase 1.0 μL, 反 應(yīng) 條 件:42 ℃ 60 min,95 ℃ 5 min。 ③ 熒 光定量 PCR反應(yīng)體系: cDNA 1 μL,10 × buffer 5.0 μL,MgCl2(25 mmol/L)7.0 μL,10 mmol/L dNTP 1.0 μL, Primer F(20 pmol/μL)0.8 μL,Primer R(20 pmol/μL)0.8 μL,SYBR Green Ⅰ1 μL,Taq 酶(5 U/μL)0.5 μL。 反 應(yīng) 條 件:94℃ 30 min, 94 ℃ 30 s、53 ℃ 30 s、 72 ℃ 30 s,50 個(gè) 循 環(huán) 。Cycle threshold(Ct) 值 的 計(jì) 算 分 析: 待 測(cè) 樣 品 相對(duì)值 =2-ΔΔCt, ΔCtβ=Ct陰性對(duì)照 -Ct待測(cè)樣品, ΔΔCt=ΔCtβ-actin-ΔCt待測(cè)樣品。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)股骨骨密度 （BMD）， 血清和腎臟組織1，25（OH）2D3水平的影響 見表 1。 與假手術(shù)組比較, 模 型 組 股 骨 BMD、 血 清 和 腎 臟 組 織1,25(OH)2D3水平降 低 (P＜0.01)。 與 模 型 組 比較,密骨打老兒丸中劑量組、密骨打老兒丸大劑量組、 維生素 D3組的股骨 BMD、血清和腎臟組織1,25(OH)2D3水平顯 著 增 加 (P＜0.01)； 密 骨 打老兒丸小劑量組的股骨 BMD、 血清和腎臟組織1,25(OH)2D3水平無 顯 著 增 加 (P＞0.05)。密 骨打老兒丸中、大劑量組與維生素 D3組之間比較無明顯差異 (P＞0.05)。

3.2 對(duì)腎臟組織維生素 D受體 （VDR） mRNA表達(dá)的影響 見表 2。與假手術(shù)組比較,模型組腎臟組織 VDRmRNA表達(dá)降低 (P＜0.01)。 與模型組相比,密骨打老兒丸中劑量組、密骨打老兒丸大劑量組、 維生素 D3組的腎臟組織 VDR mRNA表達(dá)顯著增加 (P＜0.01)；密骨打老兒丸小劑量組的腎臟組織 VDRmRNA表達(dá)無顯著增加 (P＞0.05)。密骨打老兒丸中、 大劑量組與維生素 D3組之間比較無明顯差異 (P＞0.05)。

表 1 密骨打老 兒 丸 對(duì)去卵 巢 骨質(zhì)疏松 大 鼠 股骨骨 密 度 、 血清 和 腎臟組 織 1，25（OH）2D3水平的 影 響 （， n=12）Tab.1 Effects of M igu Dalao’ er Pills on BMD of femur and 1，25 （ OH）2D3contents of serum and renal of ovariectom ized osteoporosis rats（， n=12）

表 1 密骨打老 兒 丸 對(duì)去卵 巢 骨質(zhì)疏松 大 鼠 股骨骨 密 度 、 血清 和 腎臟組 織 1，25（OH）2D3水平的 影 響 （， n=12）Tab.1 Effects of M igu Dalao’ er Pills on BMD of femur and 1，25 （ OH）2D3contents of serum and renal of ovariectom ized osteoporosis rats（， n=12）

注:與假手術(shù)組比較,**P ＜0.01； 與模型組比較,▲▲P＜0.01

組 別 骨密度/(g.cm-2) 1,25(OH)2D3血 清 /(pg.m L-1) 腎臟 組織 /(pg.g-1) 0.258 ±0.017 141.25 ±34.23 710.28 ±130.48模型組 0.223 ±0.016** 90.32 ±32.81** 523.42 ±128.09**維生素 D3組 0.251 ±0.017▲▲ 142.26 ±33.01▲▲ 725.21 ±131.52▲▲密骨打老兒丸小劑量組 0.237 ±0.019 122.07 ±30.12 601.28 ±129.73密骨打老兒丸中劑量組 0.249 ±0.017▲▲ 139.18 ±31.42▲▲ 714.32 ±128.16▲▲密骨打老兒丸大劑量組 0.253 ±0.018▲▲ 143.15 ±30.97▲▲ 726.38 ±131.78假手術(shù)組▲▲

表 2 密骨打老兒丸對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠腎臟組織 VDR mRNA表達(dá)的影響 （， n=12）Tab.2 Effect of M igu Dalao’ er Pills on the expression of kidney vitam in D receptor m RNA of ovariectom ized osteoporosis rats（， n=12）

表 2 密骨打老兒丸對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠腎臟組織 VDR mRNA表達(dá)的影響 （， n=12）Tab.2 Effect of M igu Dalao’ er Pills on the expression of kidney vitam in D receptor m RNA of ovariectom ized osteoporosis rats（， n=12）

注:與假手術(shù)組比較,**P ＜0.01； 與模型組比較,▲▲P ＜0.01

組 別 腎 臟組織 VDRmRNA Ct值 β-actin 熒光 定量 PCRCt值 -ΔΔCt 2-ΔΔCt28.97 ±1.42 28.23 ±1.46 0.79 ±0.15 1.82 ±0.17模型組 26.84 ±1.54 26.15 ±1.53 0.59 ±0.14 1.51 ±0.15**維生素 D3組 28.86 ±1.45 28.16 ±1.48 0.77 ±0.13 1.83 ±0.14▲▲密骨打老兒丸小劑量組 27.85 ±1.34 27.12 ±1.52 0.65 ±0.14 1.68 ±0.18密骨打老兒丸中劑量組 28.87 ±1.53 28.17 ±1.54 0.78 ±0.13 1.84 ±0.16▲▲密骨打老兒丸大劑量組 29.36 ±1.51 29.06 ±1.47 0.79 ±0.15 1.85 ±0.18假手術(shù)組▲▲

3.3 對(duì)腰椎維生素 D受體 （VDR） mRNA表達(dá)的影響 見表 3。與假手術(shù)組比較, 模型組腰椎VDRmRNA表達(dá)降低 (P＜0.01)。 與模型組相比,密骨打老兒丸中劑量組、密骨打老兒丸大劑量組、維生 素 D3組 的 腰 椎 VDR mRNA表 達(dá) 顯 著 增 加(P＜0.01)；密骨打老兒丸小劑量組的腰椎 VDR mRNA表達(dá)無顯著增加 (P＞0.05)。 密骨打老兒丸中、 大劑量組與維生素 D3組之間比較無明顯差異 (P＞0.05)。

表3 密骨打老兒丸對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠腰椎 VDR mRNA表達(dá)的影響 （， n=12）Tab.3 Effect of M igu Dalao’ er Pills on the expression of the second lumbar vitam in D receptor m RNA of ovariectom ized osteoporosis rats（， n=12）

表3 密骨打老兒丸對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠腰椎 VDR mRNA表達(dá)的影響 （， n=12）Tab.3 Effect of M igu Dalao’ er Pills on the expression of the second lumbar vitam in D receptor m RNA of ovariectom ized osteoporosis rats（， n=12）

注:與假手術(shù)組比較,**P＜0.01； 與模型組比較,▲▲P ＜0.01

組 別 腰 椎 VDR mRNA Ct值 β-actin 熒光定量 PCR Ct值 -ΔΔCt 2-ΔΔCt22.98 ±1.24 22.13 ±1.16 0.67 ±0.15 1.61 ±0.13模型組 20.74 ±1.21 20.35 ±1.14 0.46 ±0.17 1.42 ±0.16**維生素 D3組 22.86 ±1.27 22.24 ±1.15 0.69 ±0.16 1.62 ±0.17▲▲密骨打老兒丸小劑量組 21.72 ±1.24 21.18 ±1.18 0.53 ±0.18 1.54 ±0.16密骨打老兒丸中劑量組 22.83 ±1.25 22.23 ±1.17 0.67 ±0.14 1.62 ±0.15▲▲密骨打老兒丸大劑量組 22.98 ±1.26 22.26 ±1.21 0.68 ±0.19 1.64 ±0.17假手術(shù)組▲▲

4 討論

無論 是 通 過 小 腸 吸 收 的 維 生 素 D3(Vit D3),還是皮膚光合作用合成的 Vit D3, 首先必須通過特異的維 生 素 D 結(jié) 合 蛋 白 (vitamin D binding proteins,DBP) 轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟中, 在肝細(xì)胞微粒體和線粒 體 25-羥 化 酶 的 作 用 下,Vit D3脫 氫 生 成25(OH)D3。 隨后進(jìn)入腎臟, 在腎小管細(xì)胞線粒體 1-α羥化酶催化下,25(OH)D3轉(zhuǎn)化成 Vit D的最終活性 形 式 1,25(OH)2D3, 成為具有 最 大 生 物活性的維生素 D代謝產(chǎn)物,然后轉(zhuǎn)運(yùn)到腸道、 腎臟、 骨等靶器官中,與靶組織中的維生素 D受體(VDR) 結(jié)合,VDR是介導(dǎo)1,25(OH)2D3發(fā)揮生物效應(yīng)的核內(nèi)生物大分子, 為類固醇激素/甲狀腺激素受體超 家族的成員, 其與 1,25(OH)2D3激 素 信號(hào)分子在靶細(xì)胞結(jié)合后形成激素-受體復(fù)合物, 該復(fù)合物 再 與 視 黃 醛 x受 體 (Retinoid X receptor, RXR) 形成雜二聚體, 后與維生素 D反應(yīng)元件(vitamin D responsive element,VDRE) 結(jié)合, 對(duì) 靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯進(jìn)行調(diào)控,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)鈣磷代謝的生物學(xué)功能。

1,25(OH)2D3是 重 要 的 骨 代 謝 調(diào) 節(jié) 激 素 (D激素), 是腎臟分泌的一種激素, 在骨發(fā)育、 分化、成熟過程中起著重要作用,其水平的表達(dá)和調(diào)節(jié)與甲狀旁腺激素、鈣磷濃度、胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ和降鈣素水平等因素有關(guān)［9］。 1,25(OH)2D3在體內(nèi)有多方面活性,如調(diào)節(jié)腎小管中的鈣結(jié)合蛋白(Calbindin binding proteins,CaBP)［10］, 促 進(jìn) 腎 調(diào)鈣素結(jié)合 蛋 白 (Calmodulin binding proteins,CaMBPs) 的合成［11］, 調(diào)控Ⅰ型膠原、 金屬蛋白酶、 骨唾液酸蛋白 (Bone sialoprotein,BSP) 等成 骨細(xì)胞外基 質(zhì) 成 分［12-13］, 影 響 成 骨 細(xì) 胞 的 礦 化、 凋 亡等［14］。在缺乏 VitD和鈣的老年患者中, 補(bǔ)充 Vit D和鈣可改善神經(jīng)肌肉的功能和協(xié)調(diào)性,增強(qiáng)肌肉的力量, 降低髖部和其他非脊 柱的骨折率［15］。 小腸黏膜上 皮 細(xì)胞中存在 VDR,1,25(OH)2D3通 過影響鈣從小腸進(jìn)入細(xì)胞外液的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)腸鈣吸收的調(diào)節(jié)［16］。VDR是細(xì)胞核激素受體, 其不僅存在 于 成 骨 細(xì) 胞 (osteoblasts,OB), 也 存 在 于破骨細(xì)胞 (osteoclasts,OC),VDR 本 質(zhì) 上反 映 了1,25(OH)2D3的功能, 位于骨組 織上的 VDR作用是雙向的, 成骨細(xì)胞上的 VDR可調(diào)節(jié)位于破骨細(xì)胞上的 VDR,VDR是一種依賴配體的核轉(zhuǎn)錄因子,對(duì)骨的合成和分解代謝起著雙向調(diào)節(jié)作用。

來源于 《萬氏家抄方.卷四》的打老兒丸是抗衰老的著名方劑。研究證實(shí),打老兒丸中地黃活性成分梓 醇 可 以 提 高 成 骨 細(xì) 胞 增 殖 和 分 化 能 力［5］,川續(xù)斷的有效成分川續(xù)斷皂苷 VI可誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化［6］, 牛膝引經(jīng)入肝腎［7］。 根據(jù)張?jiān)?“運(yùn)氣不齊, 今古異軌,古方新病不相能也”, 本課題組認(rèn)為:21 世紀(jì)的今天, 與內(nèi)經(jīng)時(shí)代藍(lán)天白云的 “自然環(huán)境”、 上古天真淳樸的 “人文環(huán)境”、 和諧的 “社會(huì)環(huán)境” 有很大變化。 今日之 “天”, 很少出現(xiàn)內(nèi)經(jīng)時(shí)代之藍(lán)天白云:工業(yè)文明使數(shù)千億噸的煙塵廢氣涌入大氣層,再加過度的森林砍伐,作為地球之 “腎” 的綠地沼澤枯涸,腎水不足,產(chǎn)生的溫室效應(yīng),沙塵暴賊風(fēng)數(shù)起,使清陽(yáng)不能上升而為天,人處于天地“氣交” 之中,就五行而言:水不足、火旺。 今日之 “地”: 在城市, 高樓林立, 大樹減少, 在有限的園林空地上種植占地多的草坪,使土壤板化；在鄉(xiāng)村,農(nóng)作物莊稼多依靠化肥提高產(chǎn)量,農(nóng)藥殺蟲,丟撒的農(nóng)藥滲滿遍地,化工污濁垃圾橫傾江河,作為萬物之母的脾土失去健運(yùn),必然痰濕濁陰內(nèi)生。就五行而言:土不足,金旺。今日之“人”: 職業(yè)升遷競(jìng)爭(zhēng)劇烈, 爭(zhēng)強(qiáng)好勝之心日盛,心理承受能力不堪重負(fù),肝氣郁結(jié)者日多,日久必致血瘀； 再加一有小病恙, 無暇服中藥使 “火郁發(fā)之”,多服寒涼抑遏的抗生素對(duì)癥治療, 傷及陽(yáng)氣,使邪氣內(nèi)陷于里,與痰瘀毒邪糾纏互結(jié),遂有錮結(jié)而不可解之勢(shì)。就五行而言:木郁,肝陽(yáng)不足。綜觀天、地、人呈現(xiàn)的五行太過與不及,本課題組在打老兒丸基礎(chǔ)上加入具有促進(jìn)成骨作用的淫羊藿［2］、 骨碎補(bǔ)［3］、 補(bǔ)骨脂［4］、 菟絲子各等分組成密骨打老兒丸,方中以川牛膝、巴戟天、川續(xù)斷、楮實(shí)子、杜仲、山萸肉、熟地黃、肉蓯蓉、枸杞子補(bǔ)腎水以降火；山藥補(bǔ)脾,五味子斂肺；小茴香溫肝,石菖蒲、遠(yuǎn)志、茯神養(yǎng)心安神,化痰行瘀。全方共奏補(bǔ)腎壯骨、健脾溫肝、養(yǎng)心斂肺之功, 體現(xiàn)五臟并調(diào)。 本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M BMD、 血清和腎臟組 織 1,25(OH)2D3水 平 降 低, 腰 椎 和 腎 臟VDR mRNA表達(dá)降低, 表明大鼠腰椎和腎臟維生素D受體分泌減少。與模型組相比,密骨打老兒丸中劑量組、密骨打老兒丸大劑量組、 維生素 D3組的 BMD、 血 清 和 腎 臟 組 織 1,25(OH)2D3水 平升高、 腰椎和腎臟組織 VDRmRNA表達(dá)顯著增加,表明密骨打老兒丸中、 大劑量組和活性 Vit D3組均能提高去卵巢骨質(zhì)疏松骨密度, 通過1,25(OH)2D3與靶器官 (骨、 腎) 組織細(xì)胞核上的 VDR作用,對(duì)含有 VDRE基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯進(jìn)行調(diào)控, 實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)鈣磷的代謝,詳細(xì)的機(jī)理尚待進(jìn)一步深入研究。

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Effect of M igu Dalao'er Pills on vitam in D receptor m RNA expression of lum bar vertebra and kidney in rat w ith osteoporosis caused by ovariectom y

WU Mi-shan1, ZHAO Su-zhi2*, REN Li-zhong3, WANG Ru1, BAI Xia1, HAN Hong-wei1, LIBin4
(1.Deptof Formulaology,BasicMedical College,HebeiUniversity of ChineseMedicine,Shijiazhuang 050091,China； 2.Qiaodong District Shengbei Community Health Centre of Shijiazhuang,Shijiazhuang 050041,China； 3.Dept of Orthopaedic,The First Hospital of HebeiMedical University,Shijiazhuang 050031,China； 4.Dept of Biochemistry,HebeiMedical University,Shijiazhuang 050017,China)

AIM To explore the influence of Migu Dalao'er Pills(Epimedii Herba,Drynariae Rhizoma, Psoraleae Fructus,Cuscutae Semen,etc.)on vitamin D receptormRNA expression of the second lumbar vertebra and kidney tissue in rats with osteoporosis caused by ovariectomy.METHODS Seventy-two Sprague Dawley female rats were randomly divided into six groups:the sham group,the model group,alfacalcidol treated group, and Migu Dalao'er Pills treated groups of low 1.25 mL/kg,middle and high doses.The sham group was only sham operated and the other five groups were ovariectomized respectively.One week after ovariectomy,the rats were consecutively given Migu Dalao'er Pills and alfacalcidol by intragastric administration for three months.ELISA was used to determine 1,25(OH)2D3contents of renal tissue and serum.The thighbone was taken out to determine bonemineral density(BMD).Real-time fluor-PCR was used for quantitative analysis of the vitamin D receptormRNA expression of second lumbar vertebra and renal tissue.RESULTS Compared with the sham group, BMD of femur,and 1,25(OH)2D3level and the expression of vitamin D receptormRNA significantly decreased in themodel group.Compared with the model group,middle and high doses of Migu Dalao'er Pills groups and the alfacalcidol group showed increased BMD,1,25(OH)2D3level,and vitamin D receptor mRNA expression. CONCLUSION Migu Dalao'er Pills could significantly stimulate vitamin D receptormRNA expression to accelerate intestinal calcium absorption and osteoblastactivity and reinforce the quality of bones.

osteroporosis； Migu Dalao'er Pills； bone mineral density(BMD) ； 1,25(OH)2D3； vitamin D receptor(VDR) ； rats

R285.5

:A

:1001-1528(2014)06-1133-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.06.005

2013-04-05

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (81073074,30472200)； 河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (H2013206005)； 河北省留學(xué)人員科技活動(dòng)項(xiàng)目擇優(yōu)資助項(xiàng)目 (200828)

武密山 (1966—), 男, 博士, 教授, 碩士生導(dǎo)師, 研究方向: 補(bǔ)腎中藥治療骨質(zhì)疏松癥作用機(jī)制。 Tel:(0311)89926089, E-mail:sjzwms1966@hotmail.com

*通信作者: 趙素芝 (1966—), 女, 副主任醫(yī)師, 研究方向: 中西醫(yī)結(jié)合治療風(fēng)濕骨病。 Tel:(0311)86858146,E-mail:okgood888@ 163.com