田友清， 丁 平

（1.江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學院連云港中醫(yī)藥分院， 江蘇 連云港 222007；2.中國藥科大學新藥篩選中心，江蘇 南京 210009）

香附油滴丸中 α-香附酮在血液及細胞中的移行情況探討

田友清1，2， 丁 平1

（1.江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學院連云港中醫(yī)藥分院， 江蘇 連云港 222007；2.中國藥科大學新藥篩選中心，江蘇 南京 210009）

目的 探討香附油滴丸中 α-香附酮在血液及細胞中的移行情況， 為確定香附油滴丸的定量測定指標提供依據(jù)。方法 以高效液相色譜法 （HPLC） 為手段， 分別檢測香附油滴丸、 香附油滴丸灌胃給藥后大鼠血清及香附油滴丸給予 H9c2 細胞后細胞破碎液中 α-香附酮的移行情況。 結(jié)果 α-香附酮作為香附的主要成分， 在香附油滴丸、 含藥血清及細胞破碎液中均被檢測到。 結(jié)論 α-香附酮以原型移行到血液和細胞中發(fā)揮相應的藥理作用， 以 α-香附酮為香附油滴丸的定量測定指標具有合理性。

香附； 香附油滴丸； α-香附酮； 質(zhì)量控制

香附油滴丸是以從香附中提取的揮發(fā)油為原料制成的現(xiàn)代中藥制劑，為了制定質(zhì)量標準，需要科學確定其主要成分定量測定指標。鑒于藥物的活性成分往往通過進入血液循環(huán)并與相應的靶細胞結(jié)合而發(fā)揮作用， 本研究通過考察香附油滴丸中 α-香附酮在血液及細胞中的移行情況， 探討 α-香附酮作為香附油滴丸定量測定指標的合理性，并為中成藥成分測定指標的確定提供新思路。

1 儀器與材料

1.1 動物 SPF級 SD大鼠， 體質(zhì)量 200 ～250 g，雄性， 動物許可證號 SCXK （蘇）2007-0008，由南京青龍山實驗動物中心提供。大鼠于 SPF級動物房飼養(yǎng)， 定時給予全價營養(yǎng)飼料喂食， 室溫22～25 ℃， 相對濕度 50% ～70%。

1.2 藥物與試劑 香附油滴丸 （自制，批號110310）。α-香附酮對照品 （110748-200608， 中國藥品生物制品檢定所）； 甲醇 （色譜純， 德國 Merk公司）； DMEM、 胰酶、 FBS （由 GIBCO公司）。

1.3 主要儀器 LC-2010C四元泵高效液相色譜儀、 SPD-10Avp 紫 外-可 見 檢 測 器 （ 日 本 島 津）；SAVANT SPD 2010 真 空 濃 縮機 （ Thermo Electron公司）； 倒 置 顯 微鏡 （ Olympus）； 培 養(yǎng)箱 （ Thermo）； LEGEND Micro 21R型離心機 （ 德國 Thermo scientific公司）； AE240 電子天平 （梅特勒公司）。

1.4 細胞系 H9c2 心肌細胞系， 購自武漢博士德生物工程有限公司。

2 方法和結(jié)果

2.1 香附油滴丸中 α-香附酮的檢測

2.1.1 色譜條件 Diamond C18色譜柱 （150 mm× 4.6 mm， 5 μm）； 檢測波長 254 nm； 柱溫 30 ℃；體積流量 0.8 mL/min； 進樣量 20 μL；流動相為甲醇-冰醋酸水溶液 （冰醋酸體積分數(shù)為 1%）， 梯度見表1。

表1 流動相梯度Tab.1 G radient of mobile Phase for HPLC

2.1.2 對照品溶液的制備及標準曲線的制作 精密稱取 α-香附酮對照品 0.015 34 g置于 50 mL量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。 分別精密量取上述對照品溶液 1、 3、 5、 7、10 mL置于50 mL量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻， 依法測定。 以 α-香附酮的質(zhì)量濃度對色譜峰面積進行線性回歸，得回歸方程為 Y= 58 726X+39 618， r=0.999 7， 表明 α-香附酮在6.136 ～61.36 μg/mL內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.3 供試品溶液的制備 取香附油滴丸或空白滴丸 10 粒 （約 0.20 g）， 及相當量的香附油， 精密稱定， 置 50 mL量瓶中， 加入甲醇 10 mL，超聲溶解， 放冷， 定容， 搖勻， 用 0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液作為供試品溶液。

2.1.4 樣品檢測 取各供試品溶液及 α-香附酮溶液，依法測定， 結(jié)果見圖 1。 通過比較 α-香附酮對照品、 香附油、香附油滴丸及空白滴丸 HPLC， 確定峰 1、 2、 3 為香附油滴丸的主要峰， 其中峰 2 為α-香附酮， 質(zhì)量分數(shù)為 3.286 mg/g。

圖 1 香附油滴丸中 α-香附酮的 HPLC檢測Fig.1 Assay ofα-cyPerone in droPPing Pills of volatile oil from Cyperus rotundus by HPLC

2.2 香附油滴丸灌胃給藥后大鼠血清中 α-香附酮的檢測

2.2.1 含藥血清和空白血清樣品制備 取大鼠 6只， 禁食 12 h 后眼眶采集空白血， 然后按 1.0 g/kg體質(zhì)量灌胃給予香附油滴丸藥液，每天 2 次，連續(xù)4 d， 末次給藥 1 h后采集含藥血。 空白血和含藥血 低 溫 放 置 后 低 速 離 心 （ 3 000 r/min ×10 min）， 取上層血清 150 μL， 加甲醇 1.2 m L， 渦旋混勻， 高速離心， 取上清， 揮干， 殘留物用 0.15 mL甲醇復溶， 再離心， 取上清液供 HPLC分析用。

2.2.2 樣品檢測 取各供試品溶液及 α-香附酮溶液， 依 “2.1.1” 項測定， 結(jié)果見圖 2。 通過比較α-香附酮對照品、 香附油滴丸含藥血清、 空白血清HPLC， 確定峰 2 為香附油滴丸的主要入血成分峰，即 α-香附酮， 質(zhì)量濃度為 25.42 μg/mL血液，轉(zhuǎn)移率為 15.47% （按大鼠平均體質(zhì)量 250 g， 血液量均為10 m L計）。

2.3 香附油滴丸給予 H9c2 心肌細胞后細胞破碎液中 α-香附酮的檢測

圖 2 香附油滴丸灌胃給藥后大鼠血清中 α-香附酮的HPLC檢測Fig.2 Assay ofα-cyPerone in serum of rat adm inistered orally w ith droPPing Pills of volatile oil from Cyperus rotundus by HPLC

2.3.1 H9c2 心肌細胞培養(yǎng)及給藥 H9c2 心肌細胞用含 12%FBS 的 DMEM培養(yǎng)基于 37 ℃、 5% CO2條件下培養(yǎng)。 稱取4 mg香附油滴丸，用4 mL PBS （含 1‰的 DMSO） 渦旋溶解， 過濾滅菌， 得質(zhì)量濃度為 1 mg/mL的供試液， 加入到處于對數(shù)生長期的 H9c2 心肌細胞， 并設(shè)空白對照組， 繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3.2 樣品制備 24 h 后， 棄上清， 用適量冷PBS 洗滌 3 次， 再用適量三蒸水迅速洗滌 3 次，加三蒸水適量浸泡過夜，至細胞破裂，刮取細胞置5 mL Doff管中， 超聲破碎 2 min （ 超聲 10 s， 停頓15 s），加甲醇旋渦提取捕獲成分并沉淀蛋白， 高速離心， 取上清在金屬浴中80℃揮干。加甲醇適量超聲溶解， 高速離心， 取上清供 HPLC測定用。2.3.3 樣品測定 取各供試品溶液及 α-香附酮溶液， 依 “2.1.1” 項測定， 結(jié)果見圖 3。 通過比較α-香附酮對照品、 加入香附油滴丸的 H9c2 心肌細胞破碎液及加入空白滴丸的 H9c2 心肌細胞破碎液HPLC， 確定峰 1、 2、 3 為香附油滴丸的細胞捕獲成分峰， 其中峰 2 為 α-香附酮， 質(zhì)量濃度為 4.92 μg/mL破碎液， 轉(zhuǎn)移率為 74.96%。

3 討論

香附油滴丸是為深入開發(fā)傳統(tǒng)中藥香附而自主研發(fā)的現(xiàn)代中藥制劑，是以二氧化碳超臨界流體萃取技術(shù)從傳統(tǒng)中藥香附中提取的揮發(fā)油為原料，按適宜比例與聚乙二醇 4000 等輔料混合，通過滴制法制備而成。為了有效控制香附油滴丸的質(zhì)量，合理選擇香附的主要活性成分進行測定是十分必要的。

圖 3 香附油滴丸給予 H 9c2 心肌細胞后細胞破碎液中α-香附酮的 HPLC檢測Fig.3 Assay ofα-cyPerone in disruPtion med ium of H 9c2 cells Pretreated w ith droPPing Pills of volatile oil from Cyperus rotundus by HPLC

鑒于大多數(shù)情況下藥物的活性成分不但能在制劑中易被檢測出來，且能進入血液并與相關(guān)的靶細胞結(jié)合。因此，選擇具有該特點的成分作為藥物含量測定的指標， 具有合理 性 和 科學性［1-3］。 α-香附酮作為香附的主要成分， 其活性相當廣泛［4］， 在香附及香附油滴丸的質(zhì)量控制中曾作為定量測定指標［5-6］。為了進一步證實 α-香附酮作為香附油滴丸定量測定指標的合理性，本實驗對香附油滴丸、香附油滴丸灌胃給藥后大鼠血清及香附油滴丸給予H9c2 心肌細胞后細胞破碎液中 α-香附酮的移行情況進行了考察， HPLC法測定結(jié)果表明， α-香附酮能進入血液， 且能與靶細胞相結(jié)合， 從而說明 α-香附酮作為香附油滴丸的含量測定指標是合理的。

本實驗選擇 H9c2 心肌細胞作為 α-香附酮的靶細胞，是依據(jù)香附提取物對在體蛙心、兔心和貓心具有強心或減慢心率的作用［7］。 香附油滴丸除 α-香附酮外， 尚有其他成分進入血液或與 H9c2 心肌細胞結(jié)合，但由于缺乏相應的對照品，因此尚無法判斷為何種移行成分，如能通過質(zhì)譜進一步研究，可能為確定香附油滴丸其他的定量測定指標提供依據(jù)。

同時，本實驗為中成藥活性成分定量測定指標的確定提供了一種新的研究模式。

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Transitional situation ofα-cyPerone in the droPPing Pills of volatile oil from Cyperus rotundus in blood and cells

TIAN You-qing1，2， DING Ping1

（1.Lianyungang TCM Branch， Jiangsu Union Technical Institute， Lianyungang 222007， China； 2.New Drug Screening Center， China Pharmaceutical University， Nanjing 210009， China）

Cyperus rotundus； dropping pills of volatile oil from Cyperus rotundus； α-cyperone； quality control

R969

： A

： 1001-1528（2014）01-0069-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.017

2013-02-16

2012 年江蘇省高校 “青藍工程” 中青年學術(shù)帶頭人培養(yǎng)對象基金； 江蘇省衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)教育研究課題 （J201215）

田友清 （1975—） ， 男， 副教授， 理學博士， 從事中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究。 Tel： 15950733866， E-mail： tyq0505@163.com