彭 菲， 葉正良， 李德坤， 楊悅武， 周大錚

（1.天津中醫(yī)藥大學， 天津 300193； 2.天津天士力之驕藥業(yè)有限公司， 天津 300410）

HPGPC-ELSD法檢測注射用益氣復脈 （凍干） 中糖苷類大分子物質(zhì)

彭 菲1， 葉正良2*， 李德坤2， 楊悅武2， 周大錚2

（1.天津中醫(yī)藥大學， 天津 300193； 2.天津天士力之驕藥業(yè)有限公司， 天津 300410）

目的 建立 HPGPC-ELSD法檢測注射用益氣復脈 （凍干） 中糖苷類大分子物質(zhì) （雜質(zhì)） 的限量方法。 方法采用 ELSD為檢測器， Ultrahydrogel250 色譜柱 （7.8mm×300mm）， 以甲酸-水 （1 ∶5 000） 為流動相， 建立大分子物質(zhì) （雜質(zhì)） 的液相測定方法， 并對 10 批注射用益氣復脈 （凍干） 進行了糖苷類大分子物質(zhì)的檢測。 結(jié)果 10 批注射用益氣復脈 （凍干） 中均無糖苷類大分子物質(zhì)。 結(jié)論 此方法簡便、 快捷和靈敏， 可用于注射用益氣復脈 （凍干）中糖苷類大分子物質(zhì)的檢查，具有一定的實用意義。

HPGPC-ELSD； 注射用益氣復脈 （凍干）； 大分子物質(zhì)檢測

注射用益氣復脈 （凍干） 為中藥保護品種， 由紅參、麥冬、五味子三味藥材經(jīng)提取純化后制成的制劑，具有益氣復脈，養(yǎng)陰生津功能。臨床上主要用于預(yù)防和主治冠心病、心絞痛及合并心功能不全或心源性休克等。注射用益氣復脈 （凍干） 中主要成分為糖類、 皂苷類、 木脂素類等； 其中主要活性成分為皂苷類和木脂素類［1-4］， 其相對分子質(zhì)量大多數(shù)不超過 1 000。 而處方藥材中相對分子質(zhì)量較大的物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多肽、多糖等在提取和制劑工藝過程中是作為雜質(zhì)而去除的物質(zhì)。本研究正是基于上述情況，建立了高效凝膠滲透液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法并對注射用益氣復脈 （凍干） 中可能存在的糖苷類大分子物質(zhì)進行檢測，結(jié)果令人滿意。

1 儀器和試藥

Waters2695 高效液相色譜儀， Waters 2420 型蒸發(fā)光散射檢 測 器， Waters UltrahydrogelTM250 凝 膠 色 譜 柱 （ 7.8 mm×300 mm）， XWK-3A空氣泵 （ 天津市華生分析儀器廠）， XS105 梅特勒精密電子分析天平 （上海梅特勒-托利多儀器上海有限公司）； 右旋糖苷分子量對照品由中國藥品生物制品檢定所提供 （批號 140640-201002， 相對分子質(zhì)量為 180， 2 500， 4 600， 7 100， 10 000， 21 400， 41 100，84 400）， 注射用益氣復脈 （凍干） 由天津天士力之驕藥業(yè)有限公司提供，超純水自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為 Waters UltrahydrogelTM250 凝膠色譜柱 （7.8 mm×300 mm）； 柱溫 30 ℃； 流動相為甲酸-水（1 ∶5 000）； 體積流量 0.5 mL/min。 檢測器參數(shù)： 飄移管溫度 90 ℃， 氣壓 0.17 MPa； 進樣量 20 μL。

2.2 分子量標記物保留時間考察 精密稱取上述 9 份對照品適量， 用超純水配制成各約 1 mg/mL的溶液， 同時水作空白對照溶液，按上述色譜方法，分別進樣，測定，圖譜見圖 1， 保留時間見表 1。

圖1 8種不同相對分子質(zhì)量右旋糖酐對照品及空白對照品的 HPGPC圖

從表 1 結(jié)果可知， 保留時間大于 16 min 的均為小分子物質(zhì)， 故保留時間在 16 min 內(nèi)的可初步推測其為大分子物質(zhì)。

表1 8種不同相對分子質(zhì)量右旋糖酐對照品的保留時間

2.3 精密度 考察 精密稱 量相對 分 子質(zhì)量為 2 500、4 600、 10 000 和 41 100 的右旋糖酐對照品， 分別用水稀釋至刻度， 得質(zhì)量濃度為 1.18、 1.24、 1.32、 1.36 mg/mL的溶液， 分別連續(xù)進樣6 次， 測定保留時間， 計算 RSD， 結(jié)果相對分子質(zhì)量為 2 500、 4 600、 10 000 和 41 100 的右旋糖酐對照品和保留時間的 RSD分別為 0.106 2%、 0.309 3%、0.307 7%和 0.271 7% （n=6）， 表明精密度良好。

2.4 最低檢 出限 精密稱 取相對 分 子質(zhì)量為 2 500、4 600、 10 000 和 41 100 的右旋糖酐對照品， 分別用水稀釋至刻度， 得質(zhì)量濃度為 2.16、 2.25、 2.08、 2.44 mg/mL的溶液， 分別稀釋至 20 倍、 50 倍、 100 倍、 200 倍、 500 倍，進樣分析。 結(jié)果表明， 二者在稀釋到 500 倍時， 樣品峰的S/N分別為 7.52、 3.13、 4.21 和 3.37， 故可判斷右旋糖苷對照品的最低檢出限約為 4 μg/mL。

2.5 穩(wěn)定性考察 取上述兩種右旋糖酐對照品溶液， 分別放置 0、 2、 4、 8 h 后按上述條件進樣測定， 計算保留時間的 RSD， 結(jié)果相對分子質(zhì)量為 2 500、 4 600、 10 000 和41 100的 右 旋 糖 酐 對 照 品 的 保 留 時 間 的 RSD 分 別 為0.101 3%、 0.126 0%、 0.351 4%和 0.223 7% （n=4），結(jié)果表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 樣品測定 分別取 10 批注射用益氣復脈 （凍干） 用超純水配制成質(zhì)量濃度約為 100 mg/mL的溶液， 搖勻， 經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾， 取續(xù)濾液， 進樣 20 μL測定。 樣品HPGPC圖見圖 2。

結(jié)果表明所測 10 批注射用益氣復脈 （凍干） 樣品的出峰時間均高于 16 min， 可判斷樣品中無糖苷類大分子物質(zhì)或含有量極低在此檢測方法靈敏度以下。

2.7 樣品穩(wěn)定性考察 精密稱取注射用益氣復脈 （凍干）， 用水溶解并定容至100 mg/mL。 分別考察在0、 2、 4、8 h放置后樣品在水溶液中的穩(wěn)定性。 所得 HPGPC圖見圖3。

結(jié)果表明：樣品溶解于水溶液中后在8 h內(nèi)測定沒有出現(xiàn)大分子物質(zhì)，因此樣品在水溶液中8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3 分析與討論

3.1 目前， 對于中藥注射劑中的大分子物質(zhì)的檢測尚無法規(guī)性方法可作參考， 且相關(guān)文獻報道較少［3-8］。 本研究中的方法學驗證是參照 《中國藥典》 2010 年版一部附錄XⅧ中藥質(zhì)量標準分析方法驗證基本要求進行的。

圖 2 10 批 注 射 用 益 氣 復 脈 （凍 干） 的 HPGPCELSD圖

圖3 樣品在水溶液中的穩(wěn)定性

3.2 結(jié)合注射用益氣復脈 （凍干） 中的各類化學成分所占的比例的研究結(jié)果：其中總糖量在制劑中的比例較高［3］， 故本 研 究 選 用 右 旋糖 苷 不 同 相 對 分 子 質(zhì) 量 對 照品［9-10］為標記， 來建 立檢測方法， 用于檢測 制 劑 中可能存在的糖苷類大分子物質(zhì)。

3.3 依據(jù)凝膠色譜的分離原理 相同實驗條件下， 物質(zhì)的相對分子質(zhì)量越大，越不易進入凝膠空隙，保留時間越短；反之相對分子質(zhì)量越小， 保留時間越長［11］。 基于這一原理建立此方法對中藥注射劑生產(chǎn)工藝過程中的大分子物質(zhì)進行檢 測， 簡 便 易 行。 并 通 過 對 Ultrahydrogel 250 色 譜 柱（7.8 mm×300 mm） 和 Ultrahydrogel 500 色譜柱 （7.8 mm× 300mm） 的適用性進行對比， 選用 Ultrahydrogel 250 色譜柱（7.8mm×300mm） 來建立方法。 蒸發(fā)光散射檢測器設(shè)計用于高效液相色譜系統(tǒng)，較之前所利用示差折光檢測器所建立的方法［9］更有優(yōu)勢， 此方法不僅穩(wěn)定性更高， 精密度更好，而且靈敏度也有提高， 最低檢出限 （以右旋糖酐計） 約為4 μg/mL。 此外， 蒸 發(fā) 光 散 射 檢 測 器 可 以 用 于 梯 度 洗脫［12-13］， 較示差折光檢測器更便于進一步優(yōu)化開發(fā)新方法，適用范圍更廣。

3.4 此方法選用甲酸-水 （1 ∶5 000） 為流動相 pH約為3.0， 經(jīng)考察用此流動能夠排除皂苷類和木脂素類成分因物理聚合形 式 聚 集 物［14-15］而 對 大分 子 物 質(zhì) 測 定 結(jié) 果 產(chǎn) 生 干擾。 樣品測定時選用樣品質(zhì)量濃度約為 100 mg/m L， 即取本品 1 瓶， 加注射用水 2.6 mL使溶解； 與 RID檢測方法［4］相比既明顯增大了樣品質(zhì)量濃度，提高檢測樣品中糖苷類大分子物質(zhì)的靈敏度，又與注射用益氣復脈 （凍干） 質(zhì)量標準檢查項中雜質(zhì)檢測的質(zhì)量濃度相一致。

本研究采用 HPGPC-ELSD檢測注射用益氣復脈 （凍干）中糖苷類大分子物質(zhì)，操作簡便、結(jié)果可靠且靈敏度更高。因此，本方法可作為益氣復脈 （凍干） 的質(zhì)量控制方法。也可為其他中藥制劑中大分子物質(zhì)的檢測提供參考。

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R927.1

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： 1001-1528（2014）05-1098-04

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2013-04-15

國家 “重大新藥創(chuàng)制” 科技重大專項 （2010ZX09502-004）

彭 菲 （1989—）， 女， 碩士生， 研究方向： 藥物分析與質(zhì)量控制。 Tel： 13302193298

*通信作者： 葉正良， 男， 研究員。 Tel：（022）26732066， E-mail： yezl@tasly.com