李 強， 劉華偉， 王渭玲

(西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 陜西楊凌 712100)

近年來，化肥的不合理施用不僅造成了土壤生產(chǎn)力的衰退，而且引發(fā)的農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境問題日益嚴(yán)重，因而探尋新型肥料(尤其是生物肥料)以替代或部分替代化肥的研究倍受關(guān)注[1]。如果小麥等非豆科作物能夠?qū)崿F(xiàn)生物固氮，不僅能夠提高產(chǎn)量，而且可以減少化肥的使用、 保護環(huán)境，建立生態(tài)平衡，實現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[2]。

植物根際促生菌(PGPR，Plant Growth-promoting Rhizobacteria)是指定殖于植物根際系統(tǒng)并能促進植物生長的一類細菌[3]。PGPR可以通過產(chǎn)生植物激素(IAA,GA等)，促進根部生長增加根表面積，增加植物幼苗的活力[4-5]， 提高植物對土壤中氮素的利用率[4]和對礦質(zhì)元素的吸收能力[6]，促進可溶磷鹽的吸收[7]和根呼吸作用[8]，從而促進植物的生長。

田菁莖瘤固氮根瘤菌AzorhizobiumcaulinodansORS 571(A.caulinodans)屬于固氮根瘤菌屬，在其天然寄主豆科植物田菁(Sesbaniarostrata)的根部和莖部結(jié)瘤固氮，共生固氮效率較高，對氧的要求低于其他根瘤菌，已成為研究非豆科作物生物固氮的模式菌之一，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域表現(xiàn)出極大的應(yīng)用潛力[11]。本研究在室內(nèi)限菌條件下利用綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的A.caulinodans侵染小麥種子，利用激光共聚焦顯微鏡檢測 GFP-A.caulinodans在小麥根中的定殖規(guī)律。利用實時定量PCR研究A.caulinodans侵染后小麥幼苗根中與營養(yǎng)元素有關(guān)的 miRNA 的表達變化，為深入研究A.caulinodans對小麥的促生機制，更好地將其應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小麥品種與菌株 小麥品種小偃22由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院趙繼新博士提供。GFP標(biāo)記A.caulinodans(GFP-A.caulinodans)由中國科學(xué)院植物研究所荊玉祥研究員饋贈。

1.1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件 TY液體培養(yǎng)基: 胰蛋白胨5 g/L、酵母粉3 g/L、 CaCl2·2H2O 0.88 g/L、pH 7.4，120℃滅菌20 min，用于A.caulinodans的活化和擴培。PBS液體緩沖液: KH2PO40.24 g/L，KCl 0.2 g/L，NaCl 8 g/L，Na2HPO41.44 g/L, pH 7.4，120℃滅菌20 min，用于A.caulinodans菌液稀釋。瓊脂粉-水固體培養(yǎng)基： 1 L水加瓊脂粉5 g，120℃滅菌20 min，用于小麥種子預(yù)培養(yǎng)。1/2 Hoagland培養(yǎng)基[12]： 清洗石英砂，放在烘箱中180℃烘4h，冷卻后分裝至1L的三角瓶中，每瓶加400 mL石英砂，然后再向每瓶石英砂中加50 mL的1/2 Hoagland培養(yǎng)基，120℃滅菌20 min，模仿大田土壤結(jié)構(gòu)，用于小麥種子的接菌培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 種子處理及培養(yǎng) 選取飽滿、 均勻一致的小麥種子，用75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗3次，進行表面消毒； 再用1%次氯酸鈉浸泡10 min，無菌水沖洗3次。參照Senthilkumar方法將表面消毒的小麥種子均勻置于大三角瓶中已事先滅菌的瓊脂粉-水固體培養(yǎng)基上，種溝朝下，胚朝向同一個方向[13]。培養(yǎng)條件: 光照16 h，光強4級，溫度25℃，相對濕度46%； 黑暗 8 h，光強0級，溫度18℃，相對濕度37%。

1.2.4 根系總RNA的提取及miRNA的反轉(zhuǎn)錄 先采集0 h的小麥幼根，然后在無菌條件下向處理組中均勻加入20 mL PBS稀釋GFP-A.caulinodans菌液，同時向?qū)φ战M中均勻加入等量的PBS緩沖液。用透明膜封住瓶口，放入光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別在6 h、 12 h、 24 h、 48 h、 72 h、 96 h等不同時間點取樣，每個樣品做3個重復(fù)，平行對照組同步進行，樣品迅速冷凍于液氮中，-80℃保存。

根系總RNA采用Trizol(Invitrogen)提取。提取總RNA后使用One Step PrimeScript? miRNA cDNA Synthesis Kit(寶生物工程有限公司，大連)試劑盒， 包括小RNA3’加polyA和利用帶有接頭的oligo dT進行反轉(zhuǎn)錄2個過程。反應(yīng)體系為20 μL，包括3 μL總RNA、 10 μL 2×miRNA Reaction Buffer Mix、 2 μL 0.1%BSA和2μL miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix。反應(yīng)條件為37℃ 1 h，然后85℃ 5 s。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20℃。

1.2.5 實時定量RT-PCR 使用SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(寶生物工程有限公司，大連)試劑盒在CFX96 Real-Time System(BIO-RAD，USA)儀器上進行實時定量RT-PCR，使用β-tubulin作為內(nèi)參基因，所用每條miRNA的正向引物和通用反向引物由上海生工公司合成(表1)。反應(yīng)體系為25 μL，包括1 μL cDNA、 1 μL(10 μmol/L)miRNA上游引物、 1 μL(10 μmol/L)miRNA反向引物、 12.5 μL SYBR Premix Ex Taq和9.5 μL dH2O。反應(yīng)條件為: 95℃ 30 s， 95℃ 5 s，60℃ 30 s，40循環(huán)。將PCR產(chǎn)物的溫度從45℃上升到95℃，每升高0.5℃測定1次熒光值，最后由儀器生成溶解曲線，根據(jù)溶解曲線可驗證PCR反應(yīng)產(chǎn)物的單一性。每個樣品設(shè)置3個重復(fù)，每次反應(yīng)均設(shè)置1個無模板對照。實時定量的miRNA表達量采用相對定量法，即2-ΔΔCT法進行處理[14]。

表1 實時定量RT-PCR所用引物序列

1.2.6 miRNA靶基因預(yù)測 植物miRNA與靶基因高度互補，便于預(yù)測靶基因。使用psRNATarget 在線軟件(http: //plantgrn.noble.org/psRNATarget/)進行預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 激光共聚焦顯微鏡檢測GFP-A.caulinodans在小麥幼苗組織中的定殖

為了檢測GFP-A.caulinodans在小麥根中的定殖情況，利用激光共聚焦顯微鏡對GFP-A.caulinodans侵染的小麥幼苗根進行掃描，結(jié)果顯示GFP-A.caulinodans可定殖于根的表皮細胞和細胞間隙(圖1A、 B)，在根尖的破損處和根毛部位也發(fā)現(xiàn)了GFP-A.caulinodans(圖1C、 D)。對根進行橫切，在根的維管組織和細胞間隙等部位發(fā)現(xiàn)了GFP-A.caulinodans(圖1E)。

利用激光共聚焦顯微鏡對小麥幼苗葉片進行掃描，結(jié)果顯示定殖于小麥根中的GFP-A.caulinodans可向上遷移至小麥葉片，在氣孔定殖(圖1F)。

圖1 激光共聚焦顯微鏡檢測GFP-A.caulinodans 在小麥體內(nèi)的定殖Fig.1 Colonization of GFP-A.caulinodans in wheat seedings via confocal laser scanning microscopy

2.2 根中營養(yǎng)元素相關(guān)miRNA的表達

實時定量RT-PCR(圖2)分析結(jié)果表明，所選取的6條與營養(yǎng)元素代謝有關(guān)的miRNA相對表達量均發(fā)生了變化，其中miR164、 miR167和miR827相對表達量呈現(xiàn)出先上調(diào)后下調(diào)的趨勢，miR169 和miR398相對表達量也基本呈現(xiàn)出這一趨勢。miR164、 miR167、 miR169和miR398的相對表達量在接菌12 h時上調(diào)至最高點，分別為對照的4.13倍、 2.84倍、 2.46倍和3.99倍； miR827相對表達量在接菌24 h時上調(diào)至最高點，為對照的2.17倍。miR399相對表達量呈現(xiàn)出先下調(diào)后上調(diào)的趨勢，在接菌24 h時相對表達量下調(diào)至最低點，為對照的0.21倍。

圖2 GFP-A.caulinodans侵染小麥后根中營養(yǎng)元素相關(guān)miRNA的表達變化Fig.2 Nutrient-related miRNAs Expression of wheat roots after noculation of GFP-A.caulinodans

2.3 小麥根中6條miRNAs的靶基因預(yù)測

利用psRNATarget 在線軟件對miRNAs進行靶基因預(yù)測(表2)，在小麥現(xiàn)有的EST序列信息中沒有找到miR167、 miR399和miR827的靶基因，但在水稻基因組中可以預(yù)測到其靶基因，分別編碼生長素應(yīng)答因子(ARF)、 蛋白綴合酶PHO2和SPX-MFS(Major Facility Superfamily)亞家族蛋白。在小麥中預(yù)測到miRNA的靶基因，其中miR164的靶基因編碼的是調(diào)節(jié)生長素信號通路的轉(zhuǎn)錄因子NAC1，miR169的靶基因是可與CCAAT框結(jié)合并控制基因表達的轉(zhuǎn)錄因子HAP，miR398的靶基因是Cu/Zn 超氧化物歧化酶(Cu/Zn-superoxide dismutase, CSD)。

3 討論

3.1 A.caulinodans在小麥幼苗中的定殖與遷移

根瘤菌可以和多種宿主植物通過聯(lián)合作用對植物產(chǎn)生有益影響，不僅可以通過經(jīng)典的豆科根瘤共生，還可以通過內(nèi)生菌的形式與谷類植物產(chǎn)生有益的聯(lián)合作用。遲峰等[15]研究表明，多種根瘤菌不僅可以通過“裂隙進入”的方式侵入到水稻的根內(nèi)定殖，而且可以以動態(tài)的過程從植物內(nèi)部上升遷移至鞘和葉。劉華偉等[16]研究了巴西固氮螺菌(azospirillum brasilense)在小麥體內(nèi)的定殖規(guī)律及其促生作用。

表2 6條miRNAs的靶基因預(yù)測

本研究利用激光共聚焦顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)，小麥幼苗根與根際環(huán)境在與PGPR的互作中發(fā)揮關(guān)鍵作用。A.caulinodans可通過側(cè)根表面、 根尖破損處和根毛等部位侵入小麥根部，進入根維管束組織，并可以向上遷移至葉片，通過氣孔從小麥葉內(nèi)遷移到葉表。本研究結(jié)果與Chi等[15]研究固氮菌在水稻、 煙草等非豆科作物中的分布定殖與遷移規(guī)律一致。

3.2 響應(yīng)營養(yǎng)元素的miRNAs表達分析

近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在植物生長、 發(fā)育、 逆境脅迫等各種生物學(xué)過程中起重要的調(diào)控作用。植物中miRNA的鑒定和功能研究已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一。

3.2.1 響應(yīng)氮素的miRNAs表達分析 氮是植物三大營養(yǎng)元素之一，對植物生長發(fā)育具有重要作用。近年的研究表明miRNA參與了氮素的響應(yīng)。

Meng等[17]研究表明，擬南芥中miRNA164和miRNA167與氮信號相關(guān)。本研究中，miR164表達量略微下調(diào)后上調(diào)，然后下調(diào)。通過靶基因預(yù)測表明miR164作用于NAC1基因，miR164在接菌12 h后下調(diào)，可推測靶基因NAC1表達上調(diào)，從而使側(cè)根數(shù)量增加，促進對氮的吸收[18]。

miR167能夠抑制靶基因ARF8(auxin response factor 8)的表達[19]，ARF8能夠參與生長素信號通路調(diào)控，促進側(cè)根的生長[20]。本研究中，miR167表達量在接菌12 h達到最大，之后表達量下調(diào)，miR167在接菌96 h的相對表達量只有對照的0.35倍，說明此時氮素供應(yīng)不足，可以推測ARF8大量表達，刺激側(cè)根的起始和出現(xiàn)，促進根的形態(tài)建成，增強了對土壤中氮素的吸收和固定[21-22]。本試驗室之前的研究也支持這一推測[23]。

Pant等[24]利用實時定量PCR方法研究了擬南芥營養(yǎng)元素響應(yīng)的miRNA，發(fā)現(xiàn)氮素不足抑制miR169和miR398的表達。同時，在正常供氮的植株韌皮部汁液中檢測到miR169，認為miR169可能是氮代謝中的長距離信號分子。本研究中，miR169在接菌12 h后相對表達量顯著降低，在72 h相對表達量僅為對照的0.18倍，miR169表達水平的顯著降低會導(dǎo)致靶基因HAP的表達，促進側(cè)根形成和氮素的吸收。這與miR169在豆科植物根瘤發(fā)育過程中起重要作用的研究結(jié)果一致[25]。

擬南芥中miR398能夠抑制COX(cytochrome coxidase)基因的表達[26]，COX能夠有效地促進根部細胞的呼吸作用，形成大量的ATP[27]。本研究中miR398在接菌12 h后表達量下調(diào)，在接菌72 h時顯著降低，說明此時氮素供應(yīng)不足，miR398的表達受到抑制?？梢酝茰yCOX能夠大量表達，參與一系列氧化還原反應(yīng)，生成的ATP可以為植物根部主動運輸過程提供充足的能量，從土壤中吸收氮素等必需的營養(yǎng)元素。

3.2.2 響應(yīng)磷素的miRNAs表達分析 土壤有效磷缺乏是一個世界性問題，已成為許多地區(qū)作物生長的限制因素。目前大量研究對低磷脅迫誘導(dǎo)基因包括miRNA表達和調(diào)控在一定程度上揭示了miRNA低磷響應(yīng)機制，但其詳細調(diào)控機制仍不明確。

擬南芥miR399能夠?qū)Φ土酌{迫發(fā)生響應(yīng)并保持體內(nèi)磷素穩(wěn)定平衡[28]。擬南芥基因組中分布有6個miR399基因，均受低磷脅迫誘導(dǎo)。研究表明，無機磷轉(zhuǎn)運子(Pi transporter)和泛素結(jié)合酶(UBC24)[29]兩個基因家族為miR399的靶基因，共同調(diào)節(jié)植物體內(nèi)磷素平衡。低磷酸鹽水平強烈誘導(dǎo)miR399表達，其靶mRNA豐度下降首先在根部出現(xiàn)[30]。miR399通過與UBC24 mRNA的5’-UTR結(jié)合下調(diào)其表達，同時UBC24 mRNA的5’-UTR區(qū)已被證實與植物缺磷響應(yīng)有關(guān)。本研究中miR399在接菌24 h后表達量顯著下調(diào)然后上調(diào)，miR399表達量增加致使靶基因UBC表達下調(diào)，可以緩解被抑制的無機磷吸收和轉(zhuǎn)運，增加植物對無機磷的吸收以應(yīng)對磷素缺乏。此結(jié)果與miR399參與體內(nèi)磷素平衡模型相一致[30-31]，從miRNA角度揭示了文獻報道A.caulinodans作為根際促生菌促進可溶磷鹽的吸收和轉(zhuǎn)運的分子機制。

除了miR399以外，擬南芥中還有幾種磷響應(yīng)的miRNA， 如miR778、 miR827和miR2111。其中miR778、 miR827和miR2111在低磷環(huán)境中上調(diào)表達[24]。 水稻的根和葉中miR827受低磷脅迫強烈誘導(dǎo)[32]，miR827的靶基因OsSPX-MFS1則表達量下調(diào)。本研究中，miR827的表達量在接菌24 h時達到最大值，推測靶基因SPX-MFS表達受到抑制，以增強小麥幼苗對磷的吸收和轉(zhuǎn)運，具體機制有待進一步試驗驗證。

3.2.3 響應(yīng)微量元素的miRNAs表達分析 miRNA不僅響應(yīng)氮、 磷等大量元素，也會響應(yīng)一些微量元素含量變化并調(diào)節(jié)相應(yīng)生理活動。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中缺銅會抑制Cu/Zn超氧化物歧化酶(Cu/Zn-superoxide dismutase，CSD)的表達，其在葉綠體中的作用被Fe超氧化物歧化酶(Fe-superoxide dismutase)代替，miR398在該過程中發(fā)揮重要作用[33]。本研究中，miR398在接菌12 h表達量上調(diào)至最高值，說明此時可能銅素不足，Cu/Zn-CSD的表達下調(diào)，表明通過miRNA的作用，可以下調(diào)植物體內(nèi)非必需銅蛋白表達，減少銅素消耗，從而在缺銅條件下保證植物體正常生理活動必需銅素的供應(yīng)。

4 結(jié)論

1)A.caulinodans可從根部侵染小麥，定殖于根的表皮、 皮層、 維管系統(tǒng)的細胞間隙和細胞內(nèi)，并可以向上遷移到達葉片。

2)接種A.caulinodans使小麥根中響應(yīng)氮素、 磷素、 微量元素的miRNAs相對表達量發(fā)生變化。miR164、 miR167和miR827相對表達量呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢， miR169 和miR398相對表達量也基本呈現(xiàn)這一趨勢， miR399相對表達量呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的趨勢。

3) 6條miRNA預(yù)測得到的靶基因參與生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、 無機磷轉(zhuǎn)運等生理過程，推測通過miRNA的作用，A.caulinodans可促進小麥根的形態(tài)建成，增強小麥幼苗對營養(yǎng)元素的吸收和利用。

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