張四海， 王意錕， 朱強(qiáng)根， 黃 鍵*， 金愛武， 張 國(guó)

(1 麗水學(xué)院生態(tài)學(xué)院， 浙江麗水 323000； 2 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心城市與區(qū)域生態(tài)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100085)

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試土壤采于北京市大興區(qū)魏善莊張家廠村農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)示范基地。該基地主要種植作物為番茄，由于長(zhǎng)年連作，根結(jié)線蟲病危害嚴(yán)重，產(chǎn)量連年下降。2008年7月，采集該基地0—20 cm耕層的根際土壤，過(guò)5 mm篩網(wǎng)，濾去雜質(zhì)后混勻，作為試驗(yàn)用土。供試作物為番茄，品種為易感線蟲的“合作908”。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

底肥用量參照北京周邊地區(qū)的施用量，每千克土中加入1 g復(fù)合肥(N 140 mg，P 80 mg，K 120 mg)1g餅肥(N、P、K不超過(guò)20 mg/kg)。試驗(yàn)期間每盆每天澆500 mL水1次，每盆每周澆250 mL營(yíng)養(yǎng)液1次。營(yíng)養(yǎng)液配方如下: 尿素0.5 g/L、磷酸二氫鉀0.3 g/L、硫酸鈣0.1 g/L、硫酸鎂0.05 g/L、硫酸鋅0.0001 g/L、硫酸鐵0.0003 g/L、硫酸銅0.0001 g/L、硫酸錳0.0003 g/L、硼酸粉0.0002 g/L。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

番茄收獲后，土樣采用破壞性取樣，將土樣先過(guò)2 mm篩網(wǎng)，濾去雜質(zhì)，而后放置于-80℃的超低溫冰箱保存，以供微生物磷脂脂肪酸(PLFA)測(cè)定所用。磷脂脂肪酸組成可以指示微生物群落結(jié)構(gòu)及生物量，從土壤中直接提取磷酯類化合物的量可準(zhǔn)確表達(dá)成土壤微生物生物量(表1)[8]。PLFA中脂肪酸常用的命名格式為X:YωZ(c/t)，其中X是碳原子總數(shù)，Y代表不飽和烯鍵的數(shù)目，ω表示甲基末端，Z為烯鍵或環(huán)丙烷鏈的位置，前綴a(anteiso)和i(iso)分別代表支鏈的反異構(gòu)和異構(gòu)；cy代表環(huán)丙基支鏈，后綴c和t分別代表順式和反式同分異構(gòu)體。10Me表示一個(gè)甲基團(tuán)在距分子末端第10個(gè)碳原子上[9]。

PLFA測(cè)定方法在Kontro等[10]的方法上加以改進(jìn)，通過(guò)帶有MIDI Sherlock軟件(Vision 6.0B, MIDIInc.，Newark, DE)的Agilent 6850氣相色譜進(jìn)行色譜分析。色譜柱為ULTRA-2 (25.0m ×200 μm×0.33 mm)，載氣為氫氣，氣相色譜的升溫程序按MIDI Sherlock軟件自動(dòng)進(jìn)行(樣品酯化C19 ∶0作為內(nèi)標(biāo))。

表1 估算微生物生物量的脂肪酸

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析方法

采用Excel 2003、DPS和SPSS 16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)和兩因素方差分析(Analysis of Variance，ANOVA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加不同秸稈量對(duì)土壤微生物生物量的影響

由圖1可以看出，添加不同秸稈量處理土壤微生物總生物量表現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)。方差分析表明，添加秸稈各處理(S3、S2和S1)與未添加秸稈處理(S0)之間土壤微生物PLFA總量有顯著差異(P<0.01)，以添加秸稈S3處理微生物PLFA總量最高，為30.17nmol/g；S2其次、再次為S1，分別比未添加秸稈處理(S0)增加31.40%、 23.78%和20.73%。對(duì)其進(jìn)行回歸分析，發(fā)現(xiàn)乘冪增長(zhǎng)，乘冪方程為Y=23.346X0.1913(R2= 0.9506**)。這說(shuō)明，添加秸稈碳源能提高土壤微生物的生物總量，且隨著種植年限的延長(zhǎng)對(duì)土壤微生物總生物量的提高作用比較明顯[13]。

圖1 添加不同秸稈量土壤的PLFA總量Fig.1 Total PLFA contents with different added straw amounts

2.2 添加不同量秸稈對(duì)土壤細(xì)菌生物量的影響

由圖2可知，土壤細(xì)菌生物量在添加不同秸稈量條件下，只有添加秸稈碳源的S3處理與未添加秸稈的S0處理存在顯著差異(P<0.05)，S2和S1處理與S0處理不存在顯著差異。S3處理土壤細(xì)菌生物量最高為24.27 nmol/g，比S0處理增加27.20%。對(duì)其進(jìn)行回歸分析得出，乘冪方程為Y=19.44X0.1685(R2= 0.9279**)，說(shuō)明添加秸稈碳源不僅能提高土壤微生物的生物總量，也提高土壤中細(xì)菌的生物量。也可以看出，土壤微生物細(xì)菌的生物量在微生物總量中占有絕對(duì)大的比例，且變化與微生物總生物量變化大致相同，說(shuō)明土壤微生物是以細(xì)菌為主體的群落結(jié)構(gòu)(圖1、圖2)。

圖2 不同秸稈量處理對(duì)土壤細(xì)菌、真菌PLFA量以及真菌/細(xì)菌的影響Fig.2 PLFA of bacteria and fungi contents and fungi/bacteria in the treatments with different added straw amounts

2.3 添加不同量秸稈對(duì)土壤真菌生物量的影響

圖2表明，在添加不同秸稈量條件下，土壤真菌生物量變化趨勢(shì)和細(xì)菌生物量大致相同，也是隨秸稈添加量的增加而增加。方差分析表明，添加秸稈各處理(S3、S2和S1)與S0處理之間土壤真菌生物量有顯著差異(P<0.05)，以添加秸稈S3處理土壤真菌生物量最高，為5.90 nmol/g，其次是S2，再次為S1，分別比S0處理增加52.06%、36.60%和27.06%。對(duì)其進(jìn)行回歸分析得出，乘冪方程為Y=3.9126X0.2946(R2= 0.9875**),說(shuō)明添加秸稈碳源提高土壤中細(xì)菌的生物量的同時(shí)，也提高土壤中真菌的生物量。也可以看出，土壤微生物真菌的生物量在微生物總量中占有很少一部分，且變化與微生物總生物量和細(xì)菌生物量變化大致相同(圖1、圖2)，說(shuō)明土壤真菌不是土壤微生物的主體群落結(jié)構(gòu)。

2.4 不同添加秸稈量對(duì)土壤真菌/細(xì)菌(F/B)的影響

真菌/細(xì)菌的比例可反映真菌和細(xì)菌相對(duì)含量的變化范圍[9]和2個(gè)種群的相對(duì)豐富程度[8]。由圖2看出，在添加不同秸稈量條件下，土壤F/B變化趨勢(shì)也是隨秸稈添加量的增加而增加。方差分析表明，除S1處理外，添加秸稈的S3、S2處理與未添加秸稈的S0處理間達(dá)到顯著性差異(P<0.05)。S3處理的F/B比例最高，與其他處理均到達(dá)差異顯著(P<0.05)(S2除外)，S3和S2處理分別比S0增加了19.93%和13.04%。對(duì)其進(jìn)行回歸分析得出，乘冪方程為：Y=0.2012X0.1274(R2= 0.9710**)，說(shuō)明添加秸稈碳源提高土壤中細(xì)菌、真菌的生物量的同時(shí)，更提高了F/B(圖2)。也可以看出，添加秸稈碳源改善了土壤環(huán)境更有利于土壤真菌的生長(zhǎng)。

2.5 不同添加秸稈量對(duì)土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

經(jīng)主成分分析(圖3)得出，主成分一和主成分二基本上能把不同添加秸稈量處理區(qū)分開來(lái)。S3和S2處理與主成分一表現(xiàn)出高度正相關(guān)，而S1處理與主成分一表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)；S1處理變異很大，與主成分二之間呈正相關(guān)關(guān)系，其次是S0處理也與主成分二之間呈正相關(guān)關(guān)系，S2和S3處理表現(xiàn)出負(fù)關(guān)。S2和S3與S0處理相距較遠(yuǎn)，說(shuō)明S2和S3這兩種處理土壤與S0處理的土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)差異很大。而S2和S3處理相距較近且還有些重合說(shuō)明這兩種處理土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)較為相似。

通過(guò)每種脂肪酸在主成分上的因子載荷分析結(jié)果表明(圖4)，i17 ∶00、15 ∶0、a17 ∶0、a15 ∶0、i14 ∶0、14 ∶0、cy19 ∶0、18 ∶1ω9c和16 ∶1ω5c，在主成分一上的載荷值較高，主成分一是它們的代表因子。其中支鏈脂肪酸多來(lái)自于革蘭氏陽(yáng)性菌，i17 ∶0、15 ∶0、a17 ∶0、a15 ∶0、i14 ∶0、14 ∶0是用來(lái)表征革蘭氏陰性菌的脂肪酸，而cy19 ∶0，是用來(lái)表征革蘭氏陰性菌的脂肪酸，18 ∶1ω9c和16 ∶1ω5c是真菌的標(biāo)志性脂肪酸。說(shuō)明添加秸稈配合磷素施用處理使土壤中革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌增多，同時(shí)也有利于真菌的生長(zhǎng)。i14 ∶1、12 ∶0、a16 ∶0、16 ∶1 2OH、18 ∶0和16 ∶0在主成分二上有較高的載荷值，而18 ∶1ω9t、18 ∶1ω5c、15 ∶0 3OH、18 ∶2ω6c和i17 ∶1在主成分二上的載荷值較低，可以認(rèn)為主成分二是i14 ∶1、12 ∶0、a16 ∶0、16 ∶1 2OH、18 ∶0和16 ∶0的代表因子。說(shuō)明添加秸稈處理使土壤中土細(xì)菌的含量較高。綜合分析得出，添加秸稈處理使土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，產(chǎn)生明顯的種群優(yōu)勢(shì)。

圖3 添加秸稈處理土壤微生物群落PLFA的主成分分析 Fig.3 Principe components analysis of PLFA profile from soil microbial communities under the straw adding treatments

圖4 添加秸稈對(duì)土壤微生物群落PLFA載荷因子貢獻(xiàn)Fig.4 Eigenvector loading of PLFA contribution to soil microbial communities under the straw adding treatments

3 討論

添加秸稈處理土壤微生物總生物量、細(xì)菌和真菌生物量與未添加秸稈處理相比有明顯增加作用。秸稈碳源施入土壤中后，為微生物提供了適宜的生長(zhǎng)繁殖的土壤環(huán)境，也為微生物的生長(zhǎng)提供了豐富的食物來(lái)源(即碳源和氮源)，提高了土壤微生物的活性，促進(jìn)了微生物的生長(zhǎng)，特別是增加了真菌和細(xì)菌比例[13-15]。在土壤中有機(jī)物的分解途徑分為兩條途徑，即真菌和細(xì)菌途徑。真菌途徑多存在于難分解以及高碳氮比的有機(jī)物，資源循環(huán)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)[16]，為慢周轉(zhuǎn)方式；細(xì)菌途徑主要發(fā)生容易分解的有機(jī)質(zhì)，碳周轉(zhuǎn)和營(yíng)養(yǎng)循環(huán)速度較快[17-18]。

本試驗(yàn)研究的土壤是來(lái)自長(zhǎng)年連作根結(jié)線蟲病危害嚴(yán)重的土樣，在根結(jié)線蟲爆發(fā)的土壤有一個(gè)顯著的特點(diǎn)，食細(xì)菌線蟲高達(dá)90%以上，食真菌線蟲所占比例卻很小[19]。食真菌線蟲的比例很小，暗示土壤中真菌(食真菌線蟲的食物來(lái)源)的比例很小，說(shuō)明土壤食物網(wǎng)中在真菌能量途徑上的營(yíng)養(yǎng)位缺失，特別是真菌的生物量和多樣性。在一個(gè)比較健康的土壤食物網(wǎng)中，食細(xì)菌途徑和食真菌途徑上的土壤生物是同時(shí)存在的，這兩條途徑上的土壤生物種類和數(shù)量比較平衡，接近1 ∶1，各個(gè)營(yíng)養(yǎng)位點(diǎn)都被占據(jù)，特別是捕食者的種類多，數(shù)量豐富。這樣的土壤食物網(wǎng)對(duì)病原生物有較強(qiáng)的抑制作用。自然狀態(tài)下的草原和森林土壤中就存在著這種類型的土壤碎屑食物網(wǎng)。土壤食物網(wǎng)間接作用于根系，通過(guò)構(gòu)建良好的土壤和養(yǎng)分條件來(lái)幫助有益生物與病原生物進(jìn)行養(yǎng)分競(jìng)爭(zhēng)、捕食病原生物、占據(jù)病原生物侵染位點(diǎn)、改變土壤條件等來(lái)抑制病原生物[20]。秸稈碳源主要組成是難分解的半纖維素、纖維素和木質(zhì)素，以真菌分解途徑為主，因而相應(yīng)提高真菌的相對(duì)比例。秸稈碳源的施入為真菌提供了豐富的食物來(lái)源，保證真菌繁育，為食真菌線蟲提供了豐富的食物來(lái)源，為真菌提供了更好的生長(zhǎng)發(fā)育環(huán)境，也會(huì)相應(yīng)的提高真菌和食真菌線蟲的相對(duì)比例，從而達(dá)到修復(fù)食物網(wǎng)中缺失的營(yíng)養(yǎng)位，改善整個(gè)土壤食物網(wǎng)的結(jié)構(gòu)，使其趨于平衡與穩(wěn)定(健康土壤食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)是平衡穩(wěn)定的)，達(dá)到抑制病蟲害，特別是根結(jié)線蟲病害的目的。

土壤中添加秸稈對(duì)土壤中微生物總生物量、細(xì)菌和真菌生物量和真菌/細(xì)菌(F/B)比值的影響比較顯著。在土壤F/B比值，既反映了真菌和細(xì)菌相對(duì)含量，也是農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性指標(biāo)[21, 22]，F(xiàn)/B比值越高，暗示農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)更為持續(xù)穩(wěn)定。各個(gè)不同處理F/B比值的結(jié)果表明，秸稈碳源施入各處理與未添加秸稈碳源處理相比微生物總生物量、細(xì)菌和真菌生物量和真菌/細(xì)菌(F/B)均有所提高；添加秸稈碳源后，隨著秸稈施入量的的增加，微生物總生物量、細(xì)菌和真菌生物量和F/B比值均有升高的趨勢(shì)。特別是有利于F/B比值增加，說(shuō)明秸稈碳源的施入改變F/B比值，從而改善病土食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)和土壤生態(tài)系統(tǒng)食物網(wǎng)營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)。

4 結(jié)論

1)添加不同水平秸稈碳源下, 土壤微生物總生物量、土壤細(xì)菌量和土壤真菌量存在差異，隨著秸稈量的增加土壤微生物總生物量、土壤細(xì)菌量、土壤真菌量相應(yīng)增加。

2) 添加不同水平秸稈碳源下，對(duì)土壤真菌和細(xì)菌比值(F/B)也產(chǎn)生了顯著的影響, F/B有隨著秸稈量的增加而增加的趨勢(shì)。

參考文獻(xiàn):

[1] Singh J S, Raghubanshi A S, Singh R Setal. Microbial biomass acts as a source of plant nutrients in dry tropical forest and savanna[J]. Nature, 1989, 338(6215): 499-500.

[2] Ritz K, Wheatley R E. Effects of water amendment on basal and substrate-induced respiration rates of mineral soils[J]. Biology and Fertility of Soils, 1989, 8(3): 242-246.

[3] 高云超，朱文珊，陳文新. 秸稈覆蓋免耕土壤微生物生物量與養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 1994, 27(6): 41-49.

GAO Y C, Zhu W S, Chen W X. The relationship between soil microbial biomass and the transformation of plant nutrients in straw mulched no-tillage soils[J]. Scienta Agricultura Sinica, 1994, 27(6): 41-49.

[4] 張平究，李戀卿，潘根興，等. 長(zhǎng)期不同施肥下太湖地區(qū)黃泥土表土微生物碳氮量及基因多樣性變化[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2004, 24(12): 2818-2824.

Zhang P J, Li L Q, Pan G Xetal. Influence of long-term fertilizer management on top soil microbial biomass and genetic diversity of a paddy soil from the Taihu Lake region, China[J]. Acta Ecologica Sinica, 2004, 24(12): 2818-2824.

[5] 曾晶，龔大春，田毅紅，等. 堿法-酶法處理麥稈木質(zhì)纖維素的工藝研究 [J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工, 2007, 10(115): 7-10.

Zeng J,Gong D C, Tian Y Hetal. Study on the process of pretreatment and hydrolysis of lignocellulosic wheat straw through alkali-enzymatic method [J]. Academic Periodical of Farm Products Processing, 2007, 10(115): 7-10.

[6] 韓魯佳，閆巧娟，劉向陽(yáng)，等. 中國(guó)農(nóng)作物秸稈資源及其利用現(xiàn)狀[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2002, 18(3): 87-91.

Han L J, Yan Q J, Liu X Yetal. Straw resources and their utilization in China[J]. Transactions of the CSAE, 2002, 18(3): 87-91.

[7] Yang Z P, Guo K Q, Zhu X Hetal. Straw resources utilizing industry and pattern[J]. Transactions of the CSAE, 2001, 17(1): 27-31.

[8] Frosteg?rd ?, B??th E. The use of phospholipid fatty acid analysis to estimate bacterial and fungal biomass in soil[J]. Biology and Fertility of Soils, 1996, 22(1-2): 59-65.

[9] Frosteg?rd ?, B??th E, Tunlio A. Shifts in the structure of soil microbial communities in limed forests as revealed by phospholipid fatty acid analysis[J]. Soil Biology and Biochemistry, 1993, 25(6): 723-730.

[10] Kontro M, Korhonen L, Vartiainen Tetal. Selected ion monitoring in quantitative gas-liquid chromatographic-mass spectrometric detection of fatty acid methyl esters from environmental samples[J]. Journal of Chromatography B, 2006, 831(1): 281-287.

[11] Wilkinson S G. Gram-negative bacteria[J]. Microbial Lipids, 1988, 1: 299-488.

[12] Olsson P A. Signature fatty acids provide tools for determination of the distribution and interactions of mycorrhizal fungi in soil[J]. FEMS Microbiology Ecology, 1999, 29(4): 303-310.

[13] 張四海，連健虹，曹志平，等. 根結(jié)線蟲病土引入秸稈碳源對(duì)土壤微生物生物量和原生動(dòng)物的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2013, (6): 1633-1638.

Zhang S H, Lian J H, Cao Z Petal. Effects of adding straw carbon source to root knot nematode diseased soil on soil microbial biomass and protozoa abundance[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2013, 24(6): 1633-1638.

[14] 張四海，曹志平，胡嬋娟. 添加秸稈碳源對(duì)土壤微生物生物量和原生動(dòng)物豐富度的影響[J]. 中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2011, 19(6): 1283-1288.

Zhang S H, Cao Z P, Hu C J. Effect of added straw carbon on soil microbe and protozoa abundance[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2011, 19(6): 1283-1288.

[15] Frey S D, Six J, Elliott E T. Reciprocal transfer of carbon and nitrogen by decomposer fungi at the soil-litter interface[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2003, 35(7): 1001-1004.

[16] Blagodatskaya E V, Anderson T. Interactive effects of pH and substrate quality on the fungal-to-bacterial ratio and qCO2 of microbial communities in forest soils[J]. Soil Biology and Biochemistry, 1998, 30(10-11): 1269-1274.

[17] Ingwersen J, Poll C, Streck Tetal. Micro-scale modelling of carbon turnover driven by microbial succession at a biogeochemical interface[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2008, 40(4): 864-878.

[18] Holtkamp R, Kardol P, van der Wal Aetal. Soil food web structure during ecosystem development after land abandonment[J]. Applied Soil Ecology, 2008, 39(1): 23-34.

[19] Lucia Popescu. Comparative study on soil food web of two agricultural ecosystems: vegetable greenhouse and winter wheat farmland[D]. Beijing: PhD dissertation China Agricultural University, 2009

[20] Wardle D A, Bardgett R D, Klironomos J Netal. Ecological linkages between aboveground and belowground biota[J]. Science, 2004, 304(5677): 1629-1633.

[21] Thiet R K, Frey S D, Six J. Do growth yield efficiencies differ between soil microbial communities differing in fungal ∶bacterial ratios? Reality check and methodological issues[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2006, 38(4): 837-844.

[22] De Vries F T, Hoffland E, van Eekeren Netal. Fungal/bacterial ratios in grasslands with contrasting nitrogen management[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2006, 38(8): 2092-2103.