程存剛， 趙德英， 呂德國， 姜 曼， 杜國棟

(1 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院， 遼寧沈陽 110866； 2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所， 遼寧興城 125100)

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中極其重要和最活躍的部分，是驅(qū)動土壤有機(jī)物質(zhì)和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、 循環(huán)的主要動力[1]。微生物的群落多樣性在很大程度上反映了土壤有機(jī)碳庫的轉(zhuǎn)化情況[2-3]。研究表明，植物凋落物、 根系殘?bào)w、 外源有機(jī)物投入的種類和存在狀態(tài)的差異會改變土壤微生物生長所需能量物質(zhì)的數(shù)量和質(zhì)量，進(jìn)而影響土壤微生物數(shù)量、 群落結(jié)構(gòu)及活性[4]。Degens[5]已證明向土壤中添加簡單有機(jī)物可改變土壤微生物的代謝特征和代謝多樣性。

目前測定土壤微生物多樣性的方法很多，從最常規(guī)的稀釋平板法到微生物量測定、 磷脂脂肪酸分析法、 BIOLOG 微平板分析法到分子生物技術(shù)方法等。以Biolog微孔板碳源利用為基礎(chǔ)的定量分析為描述微生物群落功能多樣性提供了一種更為簡單、 快速的方法，已在評價不同類型土壤微生物的群落功能方面被廣泛應(yīng)用[6]。

由于蘋果園大多數(shù)分布在緩坡丘陵地，土壤有機(jī)質(zhì)含量低，特別是連年大量施用化肥和農(nóng)藥以及一些不合理的土壤管理措施，導(dǎo)致土壤肥力持續(xù)下降，特別是氮、 磷嚴(yán)重流失、 土壤酸化，不僅產(chǎn)生了較大的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，而且妨礙樹體對營養(yǎng)元素的吸收，降低了果實(shí)品質(zhì)，嚴(yán)重地制約著蘋果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[7-8]。有機(jī)肥料在保持、 改善和提高土壤肥力， 活化土壤養(yǎng)分， 增強(qiáng)土壤酶活性方面有著不可替代的作用[9]。禽畜廢棄物是傳統(tǒng)有機(jī)肥的主要來源，但近年來動物源有機(jī)肥嚴(yán)重不足，傳統(tǒng)的施肥方式費(fèi)時費(fèi)工，同時施用禽畜廢棄物在重金屬、 鹽脅迫及病原物危害等方面存在風(fēng)險(xiǎn)[10-11]。因此如何合理利用有機(jī)肥，充分發(fā)揮其在培肥地力方面的作用，已成為生產(chǎn)中亟待解決的重要問題。隨著果樹有機(jī)化栽培的開展，生產(chǎn)者越來越重視通過施用植物源有機(jī)肥來改善果園土壤狀況，進(jìn)而提高果品的產(chǎn)量與品質(zhì)[12]。研究表明，葡萄糖、 尿素等小分子有機(jī)物以及土壤動物如蚯蚓在加快植物源有機(jī)物料在土壤中的腐解與轉(zhuǎn)化方面發(fā)揮著重要作用[13-15]。由于前人的研究主要集中在有機(jī)物料對土壤理化性狀、 微生物量、 酶活性的影響等方面[16-18]，而在有機(jī)物料對土壤微生物群落多樣性的影響，特別是有機(jī)物料腐殖化過程中驅(qū)動因子作用方面的報(bào)道較少，本試驗(yàn)研究了蘋果枝條、 秸稈和雜草覆蓋后果園土壤微生物群落多樣性的差異，旨在探求葡萄糖、 尿素等小分子有機(jī)物和蚯蚓在植物源有機(jī)物料向土壤碳庫轉(zhuǎn)化中的作用，為揭示果園土壤質(zhì)量的演變機(jī)制，實(shí)現(xiàn)果園內(nèi)部的物質(zhì)能量循環(huán)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2011年4月至2012年11月在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹試驗(yàn)基地(41°83′ N，123°56′E)進(jìn)行。供試土壤取自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所砬山試驗(yàn)基地蘋果園0—20 cm土層，采樣園面積為4.3 hm2，土壤質(zhì)地為砂壤土，母質(zhì)主要為花崗片麻巖風(fēng)化物。采用Z形五點(diǎn)取樣法。試驗(yàn)地為緩坡地(坡度<5°)，土壤肥力和管理水平一致。試驗(yàn)前果園0—20 cm土壤有機(jī)質(zhì)含量為19.9 g/kg、 堿解氮122.79 mg/kg、 速效磷6.08 mg/kg、 速效鉀219.83 mg/kg(于2011年4月30日測定)。3種植物源有機(jī)物(蘋果枝條、 玉米秸稈和果園雜草)采用FZFS665Y型移動式枝椏粉碎機(jī)粉碎，將通過1.70 mm篩的土壤和3種有機(jī)粉碎物分別以質(zhì)量比為30 ∶1的比例混合均勻，作為盆栽基質(zhì)。

盆栽基質(zhì)中栽植生長勢整齊一致的2a生蘋果砧木山定子幼苗，栽植容器為21cm×21cm的黑色聚乙烯營養(yǎng)缽，每個營養(yǎng)缽內(nèi)裝3.0 kg基質(zhì)，每種基質(zhì)栽植45盆。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

盆栽試驗(yàn)采用L9(34) 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(見表1)，于2011和2012年6月1日進(jìn)行小分子有機(jī)物和蚯蚓的添加，小分子有機(jī)物均以水溶液的形式進(jìn)行澆灌，以達(dá)到土壤飽和含水量為準(zhǔn)，并以托盤放于盆底，回收外滲溶液。尿素、 葡萄糖用量為4.0 g/pot。試驗(yàn)用蚯蚓為太平2號Eiseniafoetida(Savigny)成年蚓，于添加前1d對蚯蚓進(jìn)行24 h的饑餓處理，選擇大小一致的蚯蚓放入盆中，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)每盆放0 條、 6條和12條，各處理重復(fù)15次。

于處理后第20 d取樣，采用破壞性取樣方法。將黑色營養(yǎng)缽?fù)实?，松動土團(tuán)，提出植株，抖動植株根系，將土壤混合均勻，過0.85 mm篩，于4 ℃條件下保存，用于土壤微生物群落多樣性分析。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3 試驗(yàn)方法

土壤微生物功能多樣性采用 BIOLOG生態(tài)測試板( EcoPlatesTM，美國Matrix Technologies Corporation生產(chǎn))測定。稱取相當(dāng)于10 g烘干土重的新鮮土樣，加入到盛有90 mL 0.85% NaCl無菌溶液的三角瓶中，封口后在搖床上震蕩(200 r/min)30 min，按10倍稀釋法用0.85% NaCl無菌溶液將其稀釋至原來的10-3用于接種。接種量為150 μL，每樣1板，3次重復(fù)，將接種好的測試版加蓋置于25 ℃暗箱培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)192 h，期間每隔 24 h用BIOLOG讀數(shù)儀在590 nm下讀數(shù)[19]。

Biolog Eco Plate微孔板的總體顏色變化用平均孔顏色變化率(AWCD，average well color development)表示。AWCD=∑(Ci-R)/31，其中Ci為各反應(yīng)孔在590 nm下的吸光值，R為對照孔的吸光值，Ci-R<0的孔在計(jì)算中記為0[20]。本研究取培養(yǎng)96 h時微平板光密度值進(jìn)行多樣性指數(shù)計(jì)算、 主成分分析[19]。微生物群落功能多樣性的計(jì)算，包括:

豐富度(Richness)指數(shù)S，指被微生物群落利用的基質(zhì)的數(shù)量。微孔的光密度值≥0.25，則認(rèn)為是陽性值并計(jì)入微生物群落的豐富度 S (即此類微孔的總和)；

多樣性指數(shù)(Diversity)H H =-∑Pi×lnPi，式中， Pi= (Ci-R)/∑(Ci-R)，表示反應(yīng)孔與對照孔光密度值之差和整塊板總差的比值；

均勻度(Evenness)指數(shù) E， E =H/lnS；

優(yōu)勢度(Simpson)指數(shù)Ds，Ds=1-∑Pi2，用于評估某些最常見種的優(yōu)勢度。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS 7.05數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行處理，用Duncan′s 多重比較法(P<0.05)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)過程中AWCD值的變化

圖1 不同處理微生物的平均顏色變化率Fig.1 AWCD of soil microbial process under different treatments

2.2 土壤微生物群落多樣性指數(shù)分析

微生物群落功能多樣性是反映其群落狀態(tài)與功能結(jié)構(gòu)的指標(biāo)。從表2可以看出，不同處理微生物功能多樣性不同。培養(yǎng)96 h后，微生物的平均顏色變化率(AWCD)和優(yōu)勢度指數(shù)(Ds)以T4最大，豐富度指數(shù)(S)以T2最大，而多樣性指數(shù)(H)和均一度指數(shù)(E)各處理差異不顯著。 小分子有機(jī)物種類對S指數(shù)(F2=5.83)和DS指數(shù)(F2=5.32)的影響顯著，而有機(jī)物種類和蚯蚓數(shù)量對S指數(shù)和DS指數(shù)的影響不顯著； 有機(jī)物種類、 小分子有機(jī)物種類及蚯蚓數(shù)量均對H、E指數(shù)的影響不顯著。

表2 土壤微生物群落多樣性指數(shù)和96 h AWCD

圖2 盆栽試驗(yàn)不同處理微生物對六類碳源的利用Fig.2 Utilization of 6 groups of C sources by soil microbial community of different treatments in the pot culture

2.3 微生物利用碳源情況的分析

土壤微生物對不同碳源的利用反映了微生物的代謝功能類群。根據(jù)BIOLOG-ECO板的碳源類型，將其31種碳源分為碳水化合物類、 氨基酸類、 羧酸類、 多聚物類、 芳香族類、 胺類6類，觀察不同處理微生物利用碳源的吸光值變化。

如圖2所示，各處理土壤微生物對各類碳源的利用率均有所提高。碳水化合物種類各處理間差異顯著，表現(xiàn)為T4>T6>T3、 T2>T1>T8>T9>T7>T5，由主體間效應(yīng)檢驗(yàn)看出，有機(jī)物料種類、 小分子有機(jī)物、 蚯蚓數(shù)量3個因素均對碳水化合物類碳源影響顯著，表現(xiàn)為F2=99.28>F3=90.04>F1=75.61； 氨基酸類的AWCD值表現(xiàn)為T4>T6、 T7、 T3>T5、 T2>T8、 T1>T9，3個因素均對氨基酸類AWCD值的影響顯著，且以蚯蚓數(shù)量與有機(jī)物料種類影響較為顯著，表現(xiàn)為F3=128.65>F1=111.43>F2=20.19； 羧酸類AWCD值表現(xiàn)為T5>T4>T3>T7、 T2>T8>T6、 T9>T1，表明3個因素均對羧酸類AWCD值的影響顯著，且以小分子有機(jī)物種類的影響最為顯著，表現(xiàn)為F2=1786.13>F1=1028.95>F3=722.96； 多聚物類的AWCD值表現(xiàn)為T4、 T1、 T2>T3>T6>T8、 T9>T7>T5，顯示3個因素均對多聚物類AWCD值的有顯著影響，且有機(jī)物料種類的影響最顯著，表現(xiàn)為F1=1370.78>F2=1035.46>F3=574.86； 芳香族類AWCD的值表現(xiàn)為T3>T8>T6>T9>T1>T7、 T5>T4、 T2，說明3個因素均對芳香類AWCD值的影響顯著，表現(xiàn)為F2=86.40>F1=28.35>F3=23.01； 胺類AWCD值表現(xiàn)為T1>T2、 T4>T7>T9、 T3>T8>T5>T6，3個因素均對胺類AWCD值也有顯著影響，且以有機(jī)物料種類影響最為顯著，表現(xiàn)為F1=324.36>F2=170.08>F3=8.57。

2.4 微生物群落主成分分析

土壤微生物多樣性反映了群落總體的變化，但未能反映微生物群落代謝的詳細(xì)信息，研究土壤微生物對不同碳源利用能力的差異，有助于更全面地了解微生物群落代謝功能特性[22]。從表3可以看出，以培養(yǎng)96 h時不同處理微生物對微孔板上31種碳源利用情況做PCA分析，31個成分因子中前5個的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到84.03%，從中提取可以聚集單一碳源變量的數(shù)據(jù)變異的前2個主成分PC1和PC2(它們的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為48.37%，特征根分別為10.11和4.88)來分析土壤微生物功能多樣性。

表3 主成分的特征根

圖3 不同處理微生物群落碳源利用主成分分析Fig.3 PCA of carbon utilization of the soil microbial community

圖3顯示，不同處理對微生物利用碳源的分異情況差異顯著。第1主成分(PC1)聚集了42.15%的數(shù)據(jù)變異，第2主成分(PC2)聚集了 16.15%的數(shù)據(jù)變異，兩主成分基本能夠反映土壤微生物群落碳源利用情況的主要信息。PC1軸T2、 T4主要分布在正方向，T5、 T7、 T8主要分布在負(fù)方向，表明小分子有機(jī)物葡萄糖、 尿素以及蚯蚓數(shù)量是影響土壤微生物對碳源利用能力差異的主要因素。

由表4可以看出，對PC1貢獻(xiàn)大(特征向量≥0.20)的碳源有12種，碳水化合物類占6種，多聚物類和胺類各占2種，氨基酸類和羧酸類各占1種。對PC2貢獻(xiàn)大的碳源有11種，碳水化合物類占4種，多聚物類和芳香類各占2種，氨基酸類、 羧酸類和胺類各占1種。從中可以看出，對PC1和PC2起分異作用的主要碳源分別是碳水化合物類和多聚物類。

3 討論與結(jié)論

微生物利用有機(jī)物質(zhì)作為能源，其生命活動可以加速有機(jī)物的分解和營養(yǎng)元素在土壤生態(tài)系統(tǒng)中的循環(huán)[23]。有機(jī)物料作為外源有機(jī)碳源輸入土壤中，會對土壤有機(jī)碳庫的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生影響。前人曾利用不同的有機(jī)物料在不同的土壤和生態(tài)體系中，對植物殘?bào)w的分解、養(yǎng)分的釋放以及土壤生物的作用等方面作過不少的研究[24-25]。

表4 對PC1和PC2貢獻(xiàn)的特征向量絕對值≥0.20的碳源

作為外源有機(jī)物的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)廢棄物的枝條、 秸稈和雜草進(jìn)入土壤后都是較難分解的有機(jī)物，不利于微生物快速繁殖利用。有機(jī)物的組分不同，分解難易就不同，其腐殖化產(chǎn)物的質(zhì)量和性質(zhì)也不同[26-27]。李云樂等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在有機(jī)物分解初期，土壤微生物能比較快地遷移到秸稈表面，秸稈表面的生物數(shù)量最多的是細(xì)菌，隨著細(xì)菌的數(shù)量增加，有機(jī)物分解速度加快。而有機(jī)物分解后期，細(xì)菌的數(shù)量逐漸減少，有機(jī)物的分解速度逐漸減慢[29]。本研究結(jié)果表明，有機(jī)物料的種類對于微生物種群結(jié)構(gòu)的影響差異顯著，表現(xiàn)為在枝條處理中微生物的功能多樣性較強(qiáng)，雜草較枝條更易分解，秸稈處于枝條和雜草處理之間，但由于秸稈的含氮量相對更高，微生物的功能多樣性相對較強(qiáng)，等質(zhì)量的枝條、 秸稈和雜草處理后，枝條處理的微生物多樣性增加最顯著。

葡萄糖、 尿素作為微生物的碳源和氮源物質(zhì)，進(jìn)入土壤后迅速為微生物所利用，增加了微生物數(shù)量，快速增長的微生物群落，促進(jìn)了外源有機(jī)物料碳向土壤碳庫的轉(zhuǎn)化，微生物的功能多樣性也顯著增強(qiáng)[13-14,30]。于躍躍和趙炳梓[31]的研究表明，添加葡萄糖可顯著提升土壤微生物活性，其中在纖維素存在的基礎(chǔ)上以無機(jī)氮與葡萄糖共同添加的提升效果最為顯著。本試驗(yàn)中，加入葡萄糖小分子有機(jī)物，可為土壤微生物提供可迅速利用的碳源，微生物大量繁殖，加快了添加的外源枝條、 秸稈和雜草分解的速度； 而尿素的加入，為微生物的生長提供了氮源，但單獨(dú)添加尿素對微生物的功能活性影響不大。

蚯蚓作為陸地生態(tài)系統(tǒng)中重要的大型土壤動物，能明顯促使植物殘?bào)w進(jìn)入土壤，加快植物殘?bào)w在土壤中的分解與轉(zhuǎn)化[15]。土壤中接種蚯蚓對土壤微生物群落組成及活性產(chǎn)生深刻影響[32]。土壤微生物群落特性變化受蚯蚓作用和土壤類型及植物殘?bào)w間交互作用的影響[33-34]。本試驗(yàn)研究表明，蚯蚓活動對微生物功能多樣性的影響較葡萄糖的影響效果小，但蚯蚓取食有機(jī)物料，分泌各種水解酶，通過有機(jī)質(zhì)的再分布與加工過程直接或間接影響微生物的組成、 豐富度和活性，并通過蚯蚓糞內(nèi)微生物的富集并釋放到土壤中而增加特定類群土壤微生物數(shù)量，突出了優(yōu)勢作用微生物在土壤中的分配。

微生物功能多樣性能夠反映土壤質(zhì)量指標(biāo)信息，可看作是評價土壤質(zhì)量變化的敏感參數(shù)。植物源有機(jī)物及外源驅(qū)動因子的加入，一方面由于土壤環(huán)境的改變，本身會影響微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能，另一方面使土壤中養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化發(fā)生了明顯的改變，從而影響微生物的代謝活性。BIOLOG 測試系統(tǒng)是快速測定土壤微生物群落功能代謝多樣性的一種潛在有效手段，但由于果園土壤微生物具有獨(dú)特的生理類型，使得果園土壤具有獨(dú)特的微生物多樣性，因此，在應(yīng)用BIOLOG 測試系統(tǒng)鑒定微生物群落的潛在功能多樣性時, 應(yīng)進(jìn)一步研究產(chǎn)生其代謝的土壤剖面差異的微生物種類，將碳源利用速率與根際環(huán)境中實(shí)際存在的碳源有效性聯(lián)系起來，以完善該技術(shù)在果園土壤環(huán)境研究中的應(yīng)用。

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