李雨春，王善青，胡錫敏，王光澤，蒙 鋒，曾 文，陳春香，童重錦

間日瘧原蟲(chóng)裂殖子表面蛋白1(PvMSP-1)是廣泛表達(dá)于間日瘧瘧原蟲(chóng)裂殖子表面并參與免疫反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)抗原，也是檢測(cè)瘧原蟲(chóng)較為有價(jià)值的多態(tài)性標(biāo)記物之一[1]。該基因由10個(gè)保守區(qū)和可變區(qū)組成的，其中由兩側(cè)保守區(qū)域5(ICB-5)和6(ICB-6)組成第5區(qū)域(Block5)的顯示多態(tài)性特點(diǎn)，依據(jù)該區(qū)域的氨基酸組成類型分為Belem 類型(Ploy-Q)、Salvador-1型以及二者重組性[2]。這些基因類型對(duì)間日瘧進(jìn)行有效的分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)和分子生物學(xué)研究[3]。海南省曾是我國(guó)瘧疾高發(fā)區(qū)域，主要以惡性瘧和間日瘧為主，近年來(lái)海南瘧疾疫情大幅下降，本地瘧疾發(fā)病率逐年降低，但間日瘧發(fā)病數(shù)占報(bào)告病例比例呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)。海南于2010年7月正式開(kāi)展消除瘧疾工作，在海南省消除瘧疾前期，我們自2009年收集了對(duì)海南本地流行的間日瘧原蟲(chóng)株，并對(duì)這些蟲(chóng)株的MSP-1基因進(jìn)行序列分析，以便對(duì)消除瘧疾后期有效對(duì)輸入性瘧疾和本地瘧疾進(jìn)行更好的分子水平的監(jiān)測(cè)。

1 材料與方法

1.1調(diào)查區(qū)概況和樣本采集 收集全省2009-2012年網(wǎng)報(bào)間日瘧病例共36份，有效擴(kuò)增并完成測(cè)序共30份，其中本地病例27份，輸入性病例3份，分布于海南省瘧疾流行6個(gè)市縣。

1.2DNA 提取及MSP-1PCR擴(kuò)增 采用Qiagen Mini Blood DNA 提取試劑盒對(duì)血樣進(jìn)行DNA提取，80 μL全血，180 μL ATL緩沖液，20 μL蛋白酶K，56 ℃孵育1 h, 隨后按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行DNA提取，最后加入80 μL TE緩沖液-20 ℃保存。采用特異性引物MSP-1A(5′-GAGCCCTACTACTTGATGGTCC-3′) 和 MSP-1B (5′-CCTTCTGGTACAGCTCAATG-3′)對(duì)間日瘧MSP1基因進(jìn)行擴(kuò)增[4]，20 μL擴(kuò)增體系如下：DNA模板5 μL，1× reaction buffer，2.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L of each dNTP, 10 pmol引物和1 UpfuDNA polymerase(Tiangen, Beijing). 反應(yīng)條件：95 ℃變性5 min, 35 個(gè)循環(huán)95 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 90 s; 72 ℃延伸5 min, PCR 反應(yīng)產(chǎn)物1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)。

1.3序列分析及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 ExPASy Molecular Biology (http://us.expasy.org/) 用來(lái)將核酸序列翻譯成蛋白序列， WBioEdit version 7.0軟件(www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/BioEdit.html), CLUSTAL X and EditSeq 3.88(DNASTAR, Madison,WI)用來(lái)序列比對(duì)和分析. MEGA 3.1 用來(lái)進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建和遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1樣本分布情況 從全省網(wǎng)報(bào)瘧疾樣本分布情況來(lái)看，網(wǎng)報(bào)間日瘧病例主要集中在海南中南部地區(qū)，東部北部地區(qū)相對(duì)較少，見(jiàn)表1。

2.2PvMSP-1 基因分析 從27個(gè)間日瘧樣本分析來(lái)看，Sal-1型有24個(gè)，占全部樣本數(shù)的88.8%，9個(gè)Sal-1亞型，屬于優(yōu)勢(shì)型。Belem 型有2個(gè)，同屬于1個(gè)Belem型，占樣本數(shù)的7.4%，重組型的有1個(gè)，占全部樣本數(shù)的3.7%,表2。

表1 2009-2012年收集間日瘧病例分布情況

表2不同亞型的間日瘧裂殖子表面蛋白(MSP-1)數(shù)量及氨基酸替換序列

Tab.2Numbersofdifferentsubtypesofmerozoitesurfaceprotein-1ofPlasmodiumvivaxandsequencingofaminoacidwithsubstitutes

TypeNosCharacteristic sequencing of amino acidSal typeVIAAENTNSal-a7QATAAEDKKEYEKTNQNMYNSal-b1QATAAEDKKEYEKTNQNIDNSal-c3HVTAVQKNNSal-d1ATAVQKNSSal-f2PVTAVQNTNSal-g3VTAVQKNSSal-h1HVTAVQKNNSal-i5ATAVQKNSSal-j1QVTTVQKNSBelem typeBelem-12KKELLDQYKLNADEQNKINET(20 Ploy Q)Recombinant typeRecombinant type-11NTVADIAKSATGTGNVQAVTKEDQKQNKEN (19 PloyQ)

以Sal-1標(biāo)準(zhǔn)株(AAN86207)為參考序列，我們發(fā)現(xiàn)在不同亞型間主要發(fā)生8處氨基酸序列的替換，(V/A, I/T, A/T, A/V,E/Q,N/K,T/N,N/S)和1處由組氨酸或脯氨酸或谷氨酰胺氨基酸的插入。在a亞型和b亞型種還發(fā)現(xiàn)有DKKLLKEYELNADEKTKINQN連續(xù)的氨基酸替換，其中b亞型在連續(xù)替換的基礎(chǔ)上還有M/I, Y/D的2次連續(xù)替換。Belem型只有1個(gè)亞型，與參考序列相比(AAN86208)該亞型有一個(gè)連續(xù)氨基酸替換序列KKELLDQYKLNADEQNKINET，并含有20個(gè)多聚谷氨酰胺序列。重組型的各含有Sal型和Belem型的部分序列，有19個(gè)多聚谷氨酰胺序列,圖1。

圖1 不同亞型間日瘧裂殖子表面蛋白氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

2.3PvMSP-1 進(jìn)化樹(shù)分析 通過(guò)進(jìn)化樹(shù)分析可以看出，間日瘧Sal-1型與Belem型及重組型可以較好的區(qū)分開(kāi)，屬于不同進(jìn)化簇。經(jīng)進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，Belem亞型(Hainan B-1)的蟲(chóng)株與Belem 參考序列(AAN86208)和土耳其蟲(chóng)株(CAD38667)的同源相似性均為94%，且與土耳其蟲(chóng)株同源相似性高；在Sal株系中，Hainan a亞型和b亞型與參考序列(AAN86207)的同源相似性分別達(dá)到95%和94%，而Hainan c-i亞型與參考序列的同源相似性均為97%。另外，還發(fā)現(xiàn)Hainan a亞型和b亞型獨(dú)立成一簇，而其他Sal亞型與其他國(guó)家的株系親緣關(guān)系較近，同屬一個(gè)大簇，如Hainan S-c，Hainan S-e，Hainan S-f，Hainan S-g，Hainan S-i與巴西株(AAN86239)相近,同源相似性達(dá)到99%，Hainan S-d，Hainan S-h與伊朗株(AAM53559)相近，同源相似性達(dá)到100%。而重組型的海南株雖屬于同一重組型的大類，但海南株與其他重組株還有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，與福建株(AAS46772)和朝鮮株(AAG53740)相似性分別是98%和90%，見(jiàn)圖2。

3 討 論

海南省位于我國(guó)北緯25°以南地區(qū)，是我國(guó)高度瘧疾流行區(qū)域，主要流行惡性瘧和間日瘧。近年來(lái)，在我國(guó)政府和全球基金的支持下，我省瘧疾疫情得到有效遏制，流行程度大幅減低，流行范圍明顯縮小，2010年正式實(shí)施消除瘧疾策略。自2010年后，未有本地感染的惡性瘧報(bào)告病例，以間日瘧流行為主[5]。

間日瘧在海南省均有分布，但近年來(lái)隨著消除瘧疾工作推進(jìn)，我省間日瘧主要分布在海南南部地區(qū)，中北部地區(qū)病例較少。從表1中樣本分布可以看出，南部地區(qū)如保亭三亞報(bào)告病例占所有病例的50%以上。海南省間日瘧的消除過(guò)程可能是從北部地區(qū)開(kāi)始，到中部，最后是集中南部區(qū)域。對(duì)這些間日瘧本地病例間日瘧裂殖子蛋白1基因分析得知，裂殖子表面蛋白1基因(MSP-1)具有較強(qiáng)的多態(tài)性，27份樣本中竟然有11個(gè)不同亞型的蟲(chóng)株，并且形成Salvador-1型仍是優(yōu)勢(shì)基因型，其次Belem 類型(Ploy-Q)，而重組性較少，這一結(jié)果與張山鷹[6-8]，江鋼鋒[9]報(bào)告一致。說(shuō)明海南省消除瘧疾階段，間日瘧流行株系的MSP1仍以Salvador-1為主。另外，本次調(diào)查還發(fā)現(xiàn)2種新型基因亞型的蟲(chóng)株(Sal-a和Sal-b)，該基因型不僅發(fā)生單個(gè)氨基酸之間的替換，更重要的該基因型是有連續(xù)的與Belem型相似的氨基酸替換。這一發(fā)現(xiàn)在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)類似的報(bào)道，但韓國(guó)的Sung-Ung Moon、緬甸曼德勒同樣也發(fā)現(xiàn)類似的氨基酸替換Salvador-1型[10]。Sal-c和Sal-i未發(fā)現(xiàn)連續(xù)的氨基酸替換，僅有個(gè)別氨基酸的零星點(diǎn)替換。從構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)結(jié)果也支持上述結(jié)論，本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的Salvador-1型中各亞型主要被劃分為3個(gè)大類，其中Sal-a和Sal-b與其他亞型差距較大，獨(dú)成一類，而其余亞型相對(duì)聚集性一類。Belem型本次調(diào)查中雖有2例但同屬于同一亞型，為常見(jiàn)20個(gè)谷氨酰胺的重復(fù)，從進(jìn)化樹(shù)得知，該型與其他亞型同屬于常見(jiàn)Belem型。重組型僅有一個(gè)亞型，屬于為II/Q/S型重組型，但該重組型在基因庫(kù)中未發(fā)現(xiàn)同源序列，可能屬于新型的重組亞型，有待于進(jìn)一步研究。本次調(diào)查中，尚未發(fā)現(xiàn)不同等位基因型的混合感染型和朝鮮型的蟲(chóng)株，可能與瘧疾疫情得到有效控制，傳播減少有關(guān)。

圖2海南不同亞型間日瘧氨基酸序列進(jìn)化樹(shù)

Fig.2PhylogenetictreeconstructedbyaminoacidindifferentsubtypesfromHainanIsland

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