劉茂柯，唐玉明，曹曉涵，任道群，姚萬(wàn)春，敖曉琳

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所生物中心，四川瀘州646100；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與理學(xué)院，四川雅安625014；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625014）

近年來(lái)，隨著微生態(tài)技術(shù)的發(fā)展，益生菌應(yīng)用于食品、藥物的成果日益增加，新產(chǎn)品層出不窮。然而，由于活菌數(shù)對(duì)益生菌產(chǎn)品功效具有基礎(chǔ)性作用，使得相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)主要致力于如何提高活菌數(shù)，而易忽視制造工藝對(duì)益生菌健康效應(yīng)存在的巨大影響[1]。還有研究顯示，制造過(guò)程中若盲目追求提高益生菌活菌數(shù)，可能會(huì)導(dǎo)致健康效應(yīng)的衰退，降低產(chǎn)品功效[2]。因此，除活菌數(shù)外，應(yīng)對(duì)產(chǎn)品制造過(guò)程中影響益生菌健康效應(yīng)的其他因素投入更多的關(guān)注，合理調(diào)整工藝，方能使益生菌在宿主體內(nèi)更高效地起到有益效果，推動(dòng)益生菌產(chǎn)品的功效朝所期待的方向發(fā)展。

1 制造工藝對(duì)益生菌健康效應(yīng)的影響

1.1 生長(zhǎng)培養(yǎng)基

益生菌健康效應(yīng)的體現(xiàn)高度依賴(lài)對(duì)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的選擇。不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的益生菌在拮抗病原菌[3]、免疫調(diào)節(jié)[4]和降解膽固醇[5]等方面的能力均有差異。例如，M17培養(yǎng)的L.lactis G50誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生干擾素IL-12的能力顯著強(qiáng)于MRS培養(yǎng)[4]，而在MRS中生長(zhǎng)的L.johnsonii NCC 533對(duì)沙門(mén)氏菌的拮抗作用明顯高于MLM+培養(yǎng)[6]。

培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的不同可改變益生菌代謝途徑，造成細(xì)胞表面與生理功能相關(guān)的糖蛋白、脂肪酸等分子種類(lèi)、構(gòu)象發(fā)生變化進(jìn)而造成健康效應(yīng)的差異。如在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中添加不同的碳源、氮源以及無(wú)機(jī)鹽可影響抗菌素的生成，使菌株顯示出不同的拮抗能力[3，7]。而添加不同脂肪酸可能導(dǎo)致菌株細(xì)胞表面非飽和與飽和脂肪酸的比率發(fā)生變化，改變細(xì)胞膜疏水性，影響腸道黏附性和拮抗能力[6]。

1.2 pH

培養(yǎng)pH對(duì)益生菌健康效應(yīng)有很大影響。一方面，培養(yǎng)pH的變化可影響相關(guān)代謝產(chǎn)物的合成與分泌。例如，抗菌素的產(chǎn)生對(duì)pH具有高度易感性，使得不同pH條件下培養(yǎng)的菌株拮抗能力有所不同[3，7]。還有研究證實(shí)，與益生菌耐膽鹽和降解膽固醇能力相關(guān)的膽酸鹽水解酶的活性[8]以及具有腫瘤生長(zhǎng)抑制作用的精氨酸脫亞胺酶的分泌[9]也高度依賴(lài)pH的調(diào)控。另一方面，Sashihara等[10]認(rèn)為培養(yǎng)環(huán)境中的H+對(duì)肽聚糖的構(gòu)象可能起到修飾作用，從而影響菌株免疫調(diào)節(jié)功能。在他們的研究中，不同pH培養(yǎng)的L.gasseriOLL2809誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞白介素IL-12（P70）的分泌量分別約為：500 pg/mL（pH6）、1000pg/mL（pH5）、1800pg/mL（pH4）。

1.3 生長(zhǎng)期

益生菌在不同生長(zhǎng)期健康效應(yīng)的作用機(jī)理不同[11-13]。如Maassen等[11]分別向小鼠飼喂對(duì)數(shù)期和生長(zhǎng)期的乳酸菌后接種疫苗，兩個(gè)處理間血清IgG1/IgG2a比率呈現(xiàn)顯著差異，表明不同生長(zhǎng)期乳酸菌可能決定疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答是偏向于Th1還是Th2型，進(jìn)而造成免疫應(yīng)答類(lèi)型的不同。目前的研究顯示，益生菌在穩(wěn)定期時(shí)，其黏附[13]、拮抗[3]與免疫調(diào)節(jié)能力[10]相對(duì)較強(qiáng)，原因是細(xì)胞表面物質(zhì)如疏水性蛋白、聚糖類(lèi)物質(zhì)等均在此時(shí)分化成熟。此外，穩(wěn)定期不同時(shí)間點(diǎn)收獲的菌株各方面表現(xiàn)也不同。例如L.rhamnosus GG對(duì)Caco-2黏附性以穩(wěn)定期前期最強(qiáng)[13]。而L.gasseri OLL2809誘導(dǎo)鼠脾細(xì)胞白介素IL-12（P70）的分泌量在穩(wěn)定期后期達(dá)到最高[10]。

1.4 培養(yǎng)溫度

已有研究顯示，培養(yǎng)溫度對(duì)益生菌抗菌能力有較大影響。如在20、30、40℃條件下培養(yǎng)的L.rhamnosus GP1對(duì)哈氏弧菌的抗菌效價(jià)分別為420、1 200 AU/mL與200 AU/mL[7]。而有關(guān)培養(yǎng)溫度對(duì)其他健康效應(yīng)有何影響的報(bào)道較少。現(xiàn)已證實(shí)培養(yǎng)溫度對(duì)胞外多糖（EPS）的富集有顯著影響[14]，而胞外多糖在益生菌黏附、免疫調(diào)節(jié)與消除細(xì)胞病變中起重要作用[15-17]，但尚缺乏直接的證據(jù)將兩者聯(lián)系起來(lái)。

1.5 載體

研究顯示，與不同載體配伍，益生菌在治療關(guān)節(jié)炎[18]、抑制幽門(mén)螺桿菌[19]以及抗腫瘤[20]等方面的表現(xiàn)不同。說(shuō)明了載體對(duì)健康效應(yīng)存在影響，但相關(guān)作用機(jī)理尚不清楚?？赡艿臋C(jī)理之一是載體可降低不利環(huán)境因素的脅迫作用對(duì)益生菌生理功能造成的傷害，使活菌數(shù)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)得以保持。Saxelin等[21]將復(fù)合益生菌制成膠囊、酸奶酪與干酪3種形式，讓成年人以1010cfu/d的劑量服用四周，停用后各處理糞便中B.lactis Bb12活菌數(shù)呈現(xiàn)出極顯著的差異，揭示了載體對(duì)定植力的影響。還有研究顯示將益生菌與脫脂乳配伍，脫脂乳中的蛋白質(zhì)可分散高壓勻漿過(guò)程中的壓力，降低其對(duì)細(xì)胞膜疏水性造成的影響，使黏附性得到保持[22]。

另一可能的機(jī)理是載體所含的生物活性物質(zhì)與益生菌之間存在協(xié)同作用。Larsen等[23]在體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Ca2+可促進(jìn)益生菌黏附性和拮抗能力增強(qiáng)。Sachdeva等[19]在研究中指出，以富含Ca2+的乳制品為載體可使益生菌在人體內(nèi)對(duì)幽門(mén)螺桿菌的抑制作用較其他載體提升5%到10%。這可能也是目前益生菌食品主要以乳制品為載體的原因之一。

1.6 其他

Vinderola等[24]發(fā)現(xiàn)不同香型發(fā)酵乳制品中L.casei的胃腸道耐受性有較大差異。因此，他推測(cè)食品添加劑對(duì)健康效應(yīng)有一定影響，但他檢測(cè)的樣品來(lái)源于不同廠(chǎng)商，這種差異是否僅由香味劑所引起尚有待證實(shí)。此外，對(duì)于復(fù)合益生菌產(chǎn)品，菌株配伍方式也存在較大影響。例如，將B.lactis Bb12與L.rhamnosusGG進(jìn)行配伍，可使L.rhamnosus GG的腸道黏附性顯著提高，免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)得到加強(qiáng)[25]。但若將L.rhamnosus LC705或B.breve Bb99與其進(jìn)行組合，則可能導(dǎo)致完全相反的結(jié)果[26]。

2 益生菌產(chǎn)品研發(fā)應(yīng)注意的問(wèn)題

益生菌產(chǎn)品功效主要取決于活菌數(shù)基礎(chǔ)上菌株健康效應(yīng)的展現(xiàn)。然而制造工藝對(duì)健康效應(yīng)存在的巨大影響，可能產(chǎn)生某一工藝措施在提高活菌數(shù)的同時(shí)卻導(dǎo)致健康效應(yīng)的衰退，這是易被忽視的問(wèn)題。

研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)數(shù)期的L.rhamnosus GG抗逆性顯著強(qiáng)于穩(wěn)定期[27]，但此時(shí)其腸道黏附性相對(duì)于穩(wěn)定期時(shí)卻顯著下降[13]。若將對(duì)數(shù)期的培養(yǎng)物用于產(chǎn)品研發(fā)，雖利于活菌數(shù)的提高，但也可能減弱其免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。Burns等[2]的研究印證了這一觀點(diǎn)。他們發(fā)現(xiàn)，對(duì)L.lactis 200進(jìn)行耐膽鹽馴化雖可提高其腸道存活率，但會(huì)造成細(xì)胞膜完整性的缺失，使疏水性和凝集作用下降，導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)受損。因此，對(duì)工藝的調(diào)整應(yīng)考慮到對(duì)活菌數(shù)和健康效應(yīng)的兼顧，做到全局優(yōu)化。例如，酸馴化可促進(jìn)細(xì)胞膜飽和脂肪酸的富集提高菌株抗逆性[28]，但脂肪酸結(jié)構(gòu)的改變將導(dǎo)致細(xì)胞膜疏水性變化，影響到腸道黏附性[6]。生長(zhǎng)培養(yǎng)基中添加甘露糖可提高菌株凍干和存儲(chǔ)期的活菌數(shù)[29]，同時(shí)這對(duì)抗菌素的產(chǎn)生[3，7]、EPS[30]的形成將帶來(lái)何種影響都是須注意的問(wèn)題。

因此，若能在深入解析益生菌生理功能的基礎(chǔ)上，將相關(guān)作用機(jī)制靈活應(yīng)用于對(duì)制造工藝的優(yōu)化中，目的和手段有效結(jié)合，有所兼顧，有的放矢，方能使益生菌產(chǎn)品的功效得到增強(qiáng)。

3 如何提高益生菌產(chǎn)品的功效

3.1 利用健康效應(yīng)的作用機(jī)制

益生菌健康效應(yīng)的展現(xiàn)主要與細(xì)胞表面物質(zhì)、代謝產(chǎn)物以及特殊DNA序列有關(guān)[31]。調(diào)整工藝使相關(guān)作用機(jī)理得以保持是提升產(chǎn)品功效的有效措施。例如，Sashihara等[10]指出雖然在pH 5.5～6.5環(huán)境下培養(yǎng)有利于獲得益生菌細(xì)胞產(chǎn)量和初級(jí)代謝產(chǎn)物，但在此基礎(chǔ)上適當(dāng)降低pH并將益生菌培養(yǎng)至穩(wěn)定期更有利于肽聚糖的成熟，使免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)得到提升。類(lèi)似的結(jié)論在隨后的研究中得到[3，13，32]。而 Roy 等[33]通過(guò)基因重組對(duì)益生菌細(xì)胞表面受體進(jìn)行設(shè)計(jì)來(lái)阻斷病原菌對(duì)腸道細(xì)胞的結(jié)合也取得了較好的效果。另外，對(duì)相關(guān)作用機(jī)理的研究應(yīng)注重對(duì)共性的把握。其中，黏附性被認(rèn)為是益生菌在體內(nèi)發(fā)揮健康效應(yīng)的關(guān)鍵，與之相關(guān)的細(xì)胞表面物質(zhì)如EPS[15]、S-layer[34]以及菌毛蛋白[35]等是值得重點(diǎn)研究的對(duì)象。

3.2 利用抗逆性的生理機(jī)制

F1F0 ATPase是益生菌在逆境中維持自身內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵酶，研究顯示通過(guò)耐酸[36]、耐膽鹽[37]馴化均可促進(jìn)此酶的表達(dá)與活性的提高進(jìn)而提升菌株抗逆性。Ongol等[38]則采用新霉素誘變的方式來(lái)減弱L.bulgaricus中該酶的活性，降低乳制品后酸化作用，使B.breve的活菌數(shù)在存儲(chǔ)期顯著提高。這提示，深入研究益生菌抗逆性的生理機(jī)制，可為提升活菌數(shù)帶來(lái)更多的工藝措施，使對(duì)工藝的選擇更靈活、更具針對(duì)性。例如，L.rhamnosus是運(yùn)用較廣的益生菌，但由于其缺乏過(guò)氧化氫酶，使得相關(guān)產(chǎn)品的活菌數(shù)難以維持。An等[39]將該菌與L.sakei YSI8中表達(dá)過(guò)氧化氫酶的KatA進(jìn)行重組，使其在有氧培養(yǎng)條件下活菌數(shù)提高100倍左右，同時(shí)健康效應(yīng)也得到保持。

3.3 利用生理功能的相關(guān)性

利用益生菌生理功能的相關(guān)性，從側(cè)面對(duì)菌株進(jìn)行改造可為工藝調(diào)整提供更多的切入點(diǎn)。如前所述，適應(yīng)性馴化提高菌株抗逆性的機(jī)制之一是其有利于F1F0 ATPase的表達(dá)與活性的提高。F1F0 ATPase的活性需消耗大量ATP來(lái)維持。因此，抗逆性較強(qiáng)的菌株往往伴隨著相對(duì)旺盛的糖酵解能力[27]。所以，在適應(yīng)性馴化可能損傷菌株健康效應(yīng)時(shí)，借鑒Fu等[40]的方法通過(guò)代謝工程手段針對(duì)糖酵解途徑進(jìn)行調(diào)控來(lái)提高其抗逆性也是值得嘗試的。同時(shí)，這也提示，優(yōu)化培養(yǎng)條件提升益生菌抗逆性時(shí)，為其提供更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可能會(huì)取得更好的效果。

3.4 加強(qiáng)產(chǎn)品臨床效果研究

對(duì)大多數(shù)消費(fèi)者而言，對(duì)益生菌產(chǎn)品的使用方式是影響其功效的主要因素。Tsai等[41]向小鼠飼喂L.paracasei NTU 101（108cfu/d），其拮抗與免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)在連續(xù)飼喂6周后才有所體現(xiàn)，連續(xù)飼喂9周后方能使健康效應(yīng)在停飼后維持一段時(shí)間。這說(shuō)明健康效應(yīng)的展現(xiàn)具有時(shí)間依賴(lài)性，而使用時(shí)間長(zhǎng)短還可能造成相關(guān)的作用機(jī)制發(fā)生轉(zhuǎn)變[42]。然而目前臨床研究的試驗(yàn)期普遍較短，尤其缺乏對(duì)益生菌健康效應(yīng)隨使用時(shí)間變化的動(dòng)態(tài)結(jié)果，造成相關(guān)產(chǎn)品具體功效的標(biāo)識(shí)不明確，間接導(dǎo)致了消費(fèi)者對(duì)產(chǎn)品的使用方式具有隨意性的特點(diǎn)，造成功效的不確定性。

3.5 完善產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)體系

除活菌數(shù)外，應(yīng)將腸道黏附性、拮抗、免疫調(diào)節(jié)等納入質(zhì)量評(píng)價(jià)體系當(dāng)中，針對(duì)產(chǎn)品所標(biāo)示的具體健康功效進(jìn)行鑒定。此外，為避免因材料方法的不同導(dǎo)致對(duì)菌株功能評(píng)價(jià)結(jié)果出現(xiàn)差異，對(duì)鑒定方法的選擇應(yīng)具有多元化。

4 結(jié)語(yǔ)

目前，益生菌產(chǎn)品研發(fā)需要解決的問(wèn)題是在深入解析益生菌生理功能的同時(shí)加大對(duì)制造工藝學(xué)的研究力度。在此基礎(chǔ)上，合理兼顧益生菌活菌數(shù)與健康效應(yīng)之間的關(guān)系，全局優(yōu)化，這對(duì)提升益生菌產(chǎn)品的功效、推動(dòng)益生菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。隨著相關(guān)研究的深入，益生菌產(chǎn)品將進(jìn)一步發(fā)揮對(duì)人類(lèi)健康的促進(jìn)作用。

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