曲百友 王劍

獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室ELISA檢測(cè)中應(yīng)注意的問題

曲百友 王劍

（山東省鄒平縣畜牧獸醫(yī)局 256200）

由于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定ELISA具有樣品前處理簡(jiǎn)便快速準(zhǔn)確所需儀器廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)已廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)檢驗(yàn)的各領(lǐng)域中，也是獸醫(yī)免疫學(xué)檢驗(yàn)中最為常用的方法，基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室免疫學(xué)檢驗(yàn)的主要檢測(cè)內(nèi)容包含豬瘟抗體、藍(lán)耳病抗體、口蹄疫(O型，A型，亞洲I型)抗體。其中口蹄疫三種亞型液相阻斷ELISA抗體檢測(cè)的量最大，檢測(cè)程序最復(fù)雜。筆者在工作中體會(huì)到ELISA法檢測(cè)的質(zhì)量控制很重要，正確的操作方法是保證ELISA檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的必要條件。現(xiàn)將操作中常出現(xiàn)的問題報(bào)告如下：

1 動(dòng)物采血和樣本處理

一般在醫(yī)學(xué)免疫檢驗(yàn)中均以血清作為檢測(cè)標(biāo)本。牛羊一般采用頸靜脈采血，豬一般采用耳靜脈采血。采集中應(yīng)注意動(dòng)作輕柔，避免溶血，因紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)影響，檢測(cè)結(jié)果。標(biāo)本儲(chǔ)存時(shí)間過長(zhǎng)，IgG可能會(huì)聚合成多聚體，在間接ELISA測(cè)定中導(dǎo)致本底過深，甚至造成假陽(yáng)性。一般在5d內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于4℃箱中，超過1周測(cè)定的需低溫冰存。

2 回溫

常用的試劑盒說明書中都提到低溫儲(chǔ)存使用前恢復(fù)到室溫但對(duì)室溫并沒有明確規(guī)定。經(jīng)驗(yàn)證明日常的20~ 25℃的室溫并不十分適合，因?yàn)檩^高的溫度對(duì)于操作者尤其是生手會(huì)使孔與孔之間產(chǎn)生很大的差別，影響結(jié)果。因此采用盡量低的溫度。具體溫度以洗滌液中的結(jié)晶通過充分的振搖能夠完全溶解為準(zhǔn)。

3 加樣

在ELISA中操作最多的是加樣，涉及每一步驟。目前加樣一般都使用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。加樣時(shí)首先注意應(yīng)將所加物加在板孔底部，避免加在孔壁上部，不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。在加入不同物質(zhì)時(shí)應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染。另外，在顯色時(shí)，最好使用多道微量加樣器，使加液過程迅速完成，因?yàn)轱@色對(duì)時(shí)間的要求較高，最好是同一時(shí)間顯色，加樣時(shí)間越統(tǒng)一，結(jié)果誤差越小。特別是在口蹄疫液相阻斷ELISA試劑盒使用中。加樣及倍比稀釋的時(shí)間越長(zhǎng)結(jié)果偏差越大。

4 孵育

抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間。ELISA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會(huì)，只有最貼近孔壁的一層溶液中抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育。ELISA法一般采用37℃恒溫，可將ELISA板置于恒溫箱中。為避免蒸發(fā)，一定要用封板條封住反應(yīng)孔。反應(yīng)板均不疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。

5 洗滌

洗滌在ELISA過程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELSIA就是靠洗滌來達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來可以說在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技，應(yīng)引起操作者的高度重視。

5.1 血液凝固不全引起的假陽(yáng)性 血液凝固不全時(shí)有纖維吸附現(xiàn)象，致使洗板不凈，殘留的非固相酶產(chǎn)生的非特異性顯色影響結(jié)果，而且這種顯色很深易誤認(rèn)為強(qiáng)陽(yáng)性。

5.2 洗液 洗液要臨用前新鮮配制，放置時(shí)間過長(zhǎng)易產(chǎn)生絮狀物或混濁，造成賭孔或花板。使用洗板機(jī)時(shí)候要注意設(shè)置好洗板液量和間隔時(shí)間。

5.3 拍板 有些ELISA過程中需要拍掉殘余的水分，應(yīng)在吸水紙上輕輕拍打，次數(shù)不宜過多。如果手重容易拍掉包被的抗原或抗體。造成結(jié)果不準(zhǔn)。

6 比色與結(jié)果判定應(yīng)注意的問題

顯色后一定要在規(guī)定時(shí)間內(nèi)用酶標(biāo)儀進(jìn)行讀取。

7 保護(hù)

ELISA法檢測(cè)在傳染性疾病的診斷中應(yīng)用很廣泛，特別是基層實(shí)驗(yàn)室，同時(shí)OPD及TMB也均有致癌性。所以加強(qiáng)ELISA法的全程質(zhì)量控制和重視操作中的一些安全問題對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和檢測(cè)人員安全性非常重要。應(yīng)針對(duì)每項(xiàng)操作建立完善的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，加強(qiáng)對(duì)檢驗(yàn)人員的統(tǒng)一管理，嚴(yán)格按操作規(guī)程進(jìn)行操作，確保檢測(cè)人員安全性。

（2014–04–14）

S851.2+1

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1007-1733(2014)05-0066-01