劉忞博，陸豪杰

基于生物質(zhì)譜的蛋白質(zhì)C末端研究進(jìn)展

劉忞博1,2，陸豪杰1,2

1 復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系，上海 200433
2 復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 200032

蛋白質(zhì)的C末端在蛋白質(zhì)進(jìn)行各項(xiàng)生命活動過程中都起著極其重要的作用。它不僅標(biāo)志著DNA轉(zhuǎn)錄翻譯成蛋白質(zhì)過程的初步完成，更是參與和調(diào)控了蛋白質(zhì)的各種生理功能。研究蛋白質(zhì)的C末端不僅有利于完整蛋白質(zhì)的鑒定，對于在分子水平理解蛋白質(zhì)的信號傳導(dǎo)和生化功能是十分必要的。文中結(jié)合我們的研究工作，綜述了近年來基于生物質(zhì)譜的蛋白質(zhì)C末端研究的相關(guān)進(jìn)展，包括了C末端的識別、鑒定以及蛋白質(zhì)C末端肽段富集的新方法和新技術(shù)。

蛋白質(zhì)組學(xué)，蛋白質(zhì)C末端，生物質(zhì)譜，富集

DNA中的基因通過轉(zhuǎn)錄和翻譯合成蛋白質(zhì)，隨后通過進(jìn)一步的加工和翻譯后修飾形成具有各種構(gòu)象和生物功能的蛋白質(zhì)。當(dāng)mRNA由基因轉(zhuǎn)錄得到后，在核糖體上被用作蛋白質(zhì)合成的模板，從而進(jìn)行蛋白質(zhì)的翻譯合成。在生物體中的蛋白質(zhì)合成總是從N端到C端。前者意味著合成的開始，而后者意味著合成的終止。所以一個(gè)成熟蛋白質(zhì)的C端在蛋白質(zhì)的合成中處于相當(dāng)重要的地位，并且在該蛋白質(zhì)參與生物體各項(xiàng)生理活動中更是起了積極的作用。由于蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象決定了蛋白質(zhì)的生物功能，而其天然構(gòu)象又是由該蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定的。所以如果要了解一個(gè)蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)及其重要的蛋白質(zhì)功能，那必須首先要明確其一級結(jié)構(gòu)，即蛋白質(zhì)的氨基酸序列。而C末端作為蛋白質(zhì)合成的終止端，它序列的確定則顯得尤為重要。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的不斷發(fā)展，人們在蛋白質(zhì)水平對于蛋白質(zhì)C端的研究越來越深入，蛋白質(zhì)C端測序工作也逐漸發(fā)展起來，隨著一些新蛋白質(zhì)C末端測序方法的建立，測序的靈敏度和分析通量都得到提高，而且可以實(shí)現(xiàn)De novo測序。特別是生物質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于C端測序后，使得大規(guī)模高通量的C端測序成為可能，并能夠在蛋白質(zhì)組水平應(yīng)用。本文旨在闡述研究蛋白質(zhì)C末端的重要意義，并系統(tǒng)地綜述了以質(zhì)譜測序法為主的蛋白質(zhì)C末端的鑒定策略以及與質(zhì)譜測序法相關(guān)的C末端肽段的特異性富集方法。

1 蛋白質(zhì)C末端的研究意義

蛋白質(zhì)的C末端在蛋白質(zhì)參與生命體各項(xiàng)生理活動中起著非常重要的作用。首先，蛋白質(zhì)的C末端包含了豐富的與生物功能相關(guān)的信息，對于蛋白質(zhì)定位、蛋白質(zhì)識別和信號傳導(dǎo)等方面發(fā)揮重要的作用[1-3]。與蛋白質(zhì)降解密切相關(guān)的泛素化途徑中，泛素就是與非特異性泛素激活酶E1的半胱氨酸殘基共價(jià)結(jié)合，形成E1-泛素復(fù)合體，并經(jīng)過一系列的生化反應(yīng)，最后將泛素C末端甘氨酸上的羧基連接到靶蛋白賴氨酸殘基的ε-氨基基團(tuán)上；又例如人源的β-淀粉樣蛋白 (Amyloid β-protein) C末端發(fā)生調(diào)節(jié)紊亂是導(dǎo)致Alzheimer病的主要元兇之一[3]；螢火蟲熒光素酶C端的3個(gè)氨基酸不僅構(gòu)成了序列進(jìn)化保守的C末端，同時(shí)也作為過氧化物酶的信號靶標(biāo)[4]。第二，蛋白質(zhì)C末端涉及到的翻譯后修飾也對蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能產(chǎn)生重要的影響[5-6]。類似于蛋白質(zhì)N端乙?；墓δ埽贑端羧基發(fā)生的酰胺化可以改變羧基所帶的電荷性質(zhì)，將原先帶有負(fù)電荷的羧基轉(zhuǎn)變?yōu)榻咏行缘孽０坊鶊F(tuán)，從而在某種程度上提高了蛋白質(zhì)或者肽段的穩(wěn)定性[7]。在一些分子量相對較小的多肽激素中，經(jīng)過酰胺化修飾的肽段比例非常高。又比如通過在C端附近的半胱氨酸異戊烯化修飾可以將蛋白質(zhì)錨定在脂質(zhì)膜上[8]，以及C末端的糖基磷脂酰肌醇修飾也可以用于錨定蛋白質(zhì)于細(xì)胞質(zhì)膜上[9-10]。第三，蛋白質(zhì)的C末端涉及多方面的生物體酶解作用。有些蛋白質(zhì)在某些酶的作用下會發(fā)生降解，如趨化因子的調(diào)控[11]、多肽激素的成熟以及纖維蛋白溶解[12]等。此外，還有一些酶在平時(shí)并不發(fā)揮功能，但只要從某一位置將保護(hù)的基團(tuán)切除之后，便可以具有相應(yīng)的生物活性。比如某些分泌蛋白通過一段信號肽可以從細(xì)胞內(nèi)傳輸?shù)郊?xì)胞外，隨后這一段信號肽被移除后，該蛋白便被激活[13]。這些降解過程都會產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)C末端 (neo-C-termini)，而研究這些新產(chǎn)生的蛋白質(zhì)C端能夠更好地對酶解過程進(jìn)行功能化的注釋，這其中包括酶和底物的識別，酶的作用位點(diǎn)，底物的酶解位點(diǎn)等[14]。

鑒定蛋白質(zhì)C末端的氨基酸序列對于蛋白質(zhì)的定性分析同樣發(fā)揮著重要的作用。蛋白質(zhì)的末端氨基酸序列具有很高的特異性，僅僅對末端少數(shù)幾個(gè)氨基酸的序列測定就可以實(shí)現(xiàn)絕大多數(shù)蛋白質(zhì)的可靠的分析鑒定[15]。Wilkins研究小組通過對理論數(shù)據(jù)庫中各物種的理論末端肽的特異性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，有43%–83%的蛋白質(zhì) (依物種而異) 可以通過分析N端的前4個(gè)氨基酸序列來確定。若測定蛋白質(zhì)N端的前5個(gè)氨基酸序列，則可以將鑒定成功率提高至78%–97%[16]。相對于N端鑒定，C端序列的測定對于整個(gè)完整蛋白質(zhì)的鑒定有著其獨(dú)特的優(yōu)勢：第一，作為N端鑒定的互補(bǔ)，C端鑒定有著更高的特異性，同樣是Wilkins小組對于理論數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)的C末端進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，顯示出僅僅檢測C末端的前4個(gè)氨基酸，有74%–97%的蛋白質(zhì)能夠被特異性地成功鑒定[15]；第二，在真核細(xì)胞中，有30%–80%的成熟蛋白的N端發(fā)生了翻譯后修飾 (如N-端乙?；揎梉17])，N端上的α-氨基由于這些修飾而被封閉，從而無法進(jìn)行有效的Edman降解，所以實(shí)際上能通過N端測序而確定具體蛋白質(zhì)的比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于上述理論計(jì)算得到的比例。相比之下，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)的C端是自由游離狀態(tài)的，僅僅可能發(fā)生為數(shù)不多的翻譯后修飾，比如在一些小分子肽激素中的酰胺化[18]。這使得蛋白質(zhì)C端的序列測定有著更廣泛的應(yīng)用范圍和前景。此外，對蛋白質(zhì)C末端的序列分析，在檢驗(yàn)重組表達(dá)蛋白的純度、確定具體的蛋白序列方面也是一個(gè)很好的補(bǔ)充[5]。

綜上所述，對蛋白質(zhì)C末端序列的研究不僅有利于蛋白質(zhì)的鑒定，更重要的是可以分析蛋白質(zhì)的高級構(gòu)象，揭示蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。由此看來，一套完善的蛋白質(zhì)C末端分析平臺和流程對于整個(gè)蛋白質(zhì)C末端的分離分析和功能研究顯得至關(guān)重要。

2 基于質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)C末端鑒定技術(shù)

早在1926年，Schlack和Kumpf便提出了(異) 硫氰酸法用于蛋白質(zhì)C端的測定。類似于在N端測序中被廣泛使用的Edman降解法，這是一種化學(xué)測序法。該類方法是指蛋白質(zhì)或者多肽樣品與化學(xué)試劑反應(yīng)后，從C末端逐步發(fā)生專一性裂解，對裂解得到的氨基酸進(jìn)行分析，最后還原C末端的氨基酸序列的方法。C端的化學(xué)測序法發(fā)展至今已有80余年，隨著機(jī)理的深入探究以及分析手段的不斷發(fā)展，目前比較具有代表性的方法主要有烷基化學(xué)法[19-20]和過氟酸酐法[21]。但是相比于Edman降解法，羧基端的碳原子與氨基端氮原子化學(xué)活潑性相差很大，使得化學(xué)法的偶聯(lián)產(chǎn)率很低，往往只能進(jìn)行3–5個(gè)重復(fù)單元，并且反應(yīng)起始量要求較高(20–100 pmol)。此外，這類化學(xué)法無法應(yīng)用于C末端被修飾封閉的蛋白質(zhì)或多肽，也無法作用于脯氨酸，所以并不能作為一種有效的C端測序方法[22-23]。

近30年隨著質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展，因?yàn)槠涑錾姆直媛室约俺叩撵`敏度而受到了廣泛地重視，特別是在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域中，結(jié)合色譜和串聯(lián)質(zhì)譜的聯(lián)用，更使其成為了一種常規(guī)的檢測分析手段。相比于氨基，羧基存在一定的化學(xué)反應(yīng)惰性，但是通過質(zhì)譜以及相關(guān)的衍生化手段，可以達(dá)到鑒定C末端的目的。對于序列已知的蛋白質(zhì)，可以根據(jù)序列和酶切位點(diǎn)計(jì)算出C末端肽段的理論分子量，進(jìn)而在質(zhì)譜分析中選擇相對應(yīng)分子量的肽段通過二級質(zhì)譜序列分析以確證C端的正確性。對于未知序列的蛋白質(zhì)，則可以通過一系列方法使C末端肽段產(chǎn)生特征峰，在質(zhì)譜中識別并進(jìn)行測序分析。主要有羧肽酶法、輕重同位素標(biāo)記法、Lys-C結(jié)合Lys-N酶解比較法等。這些方法都可以在一級質(zhì)譜中對C末端肽段進(jìn)行識別，從而能夠選取C端肽段母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜的序列分析。

2.1 羧肽酶測序法

羧肽酶 (Carboxypeptidase，CP) 是一類催化水解蛋白質(zhì)或者多肽鏈含羧基末端氨基酸的酶。它能夠特異性地識別和作用于末端為自由α-羧基的氨基酸，經(jīng)過一定時(shí)間的水解，C末端的氨基酸會逐個(gè)解離下來，通過不同的檢測方式，可以檢測逐個(gè)釋放得到的氨基酸，來還原得到蛋白質(zhì)的C末端序列。常用的氨基酸檢測方法有兩種：一種是色譜法，用于直接檢測水解得到的氨基酸；一種是質(zhì)譜法，通過分析比較丟失末端氨基酸的蛋白質(zhì)或多肽殘片與水解前的分子量差值，從而得到氨基酸分子量信息。

由于目前生物質(zhì)譜對于分子量較大的蛋白質(zhì)分析靈敏度和準(zhǔn)確度有限，所以最初結(jié)合質(zhì)譜的羧肽酶測序法僅僅局限于多肽[24-26]或是小蛋白水平的C端分析[27-28]。例如Patterson等優(yōu)化了羧肽酶的催化水解條件，通過改變羧肽酶的濃度，在不同的酶解時(shí)間點(diǎn)來采集數(shù)據(jù)，動態(tài)地得到多肽的C末端氨基酸序列?；诖朔椒ǎ还茶b定了22條多肽，最多測定了多肽(ACTH 7-38片段，質(zhì)荷比為3 695.15) 的C末端19個(gè)氨基酸的序列[25]。基于此，Beeumen研究小組發(fā)展了一種羧肽酶水解用于C末端測序的新方法[29]。該方法結(jié)合了溴化氰化學(xué)裂解蛋白質(zhì)以及羧肽酶對C末端特異性的降解。首先將分離純化得到的蛋白質(zhì)通過溴化氰裂解。該裂解方式作用于甲硫氨酸，最大的特點(diǎn)就是酶解產(chǎn)生的C末端都形成了高絲氨酸內(nèi)酯的衍生物。這樣使得除了自由C末端肽段外，其他由酶解產(chǎn)生的肽段都不再含有自由的α-羧基。羧肽酶并不能識別C末端為高絲氨酸內(nèi)酯的肽段，因此當(dāng)溴化氰裂解產(chǎn)物中加入羧肽酶之后，經(jīng)過一定時(shí)間酶切，C末端肽段的氨基酸會逐個(gè)解離下來，可以通過質(zhì)譜檢測不同時(shí)間酶切得到的肽段，便可以得到階梯式的序列信息，最后將所有結(jié)果還原成C末端肽段的序列。此方法的兼容性較好，也可以測定分子量較大的蛋白質(zhì)，最大測定到分子量為68 kDa的蛋白，并且最多測定到12個(gè)氨基酸殘基。但是該方法的不足在于只適用于簡單體系，面對復(fù)雜體系時(shí)，必須經(jīng)過蛋白質(zhì)的分離處理。此外，該方法依賴于最后一個(gè)甲硫氨酸在整個(gè)蛋白序列中的位置，因?yàn)橹挥忻盖泻筇幱诤线m分子量的C末端肽段才適合該方法。

2.2 輕重同位素標(biāo)記法

輕重同位素標(biāo)記法是指通過酶促手段或者化學(xué)方法，能夠?qū)⑤p重同位素分別標(biāo)記在肽段上。針對酶解后產(chǎn)生的肽段和自由的C末端肽在化學(xué)性質(zhì)上存在一定的差異，可以利用同位素的方法將它們區(qū)分，從而在質(zhì)譜圖中識別和鑒定。

其中較為典型的方法是Nakamura小組基于這樣的思路，發(fā)展了50%18O水解的方法用于C末端肽段的鑒定[30]。在酶解過程中，新產(chǎn)生肽段的C末端經(jīng)過50%16O 和50%18O的酶促標(biāo)記，會在質(zhì)譜圖上形成一對分子量相差2 Da的對峰，而原來蛋白質(zhì)的C末端，由于不參與酶解反應(yīng)之中，所以不會被18O標(biāo)記，在質(zhì)譜圖上只會以單峰的形式存在。由此能夠在一級質(zhì)譜圖中很容易地識別出C末端肽段，并選擇此肽段進(jìn)行二級質(zhì)譜分析得到C端序列?；诟道锶~變換離子回旋共振高分辨質(zhì)譜 (FT-ICR) 的檢測，可以將靈敏度提高至ppm級別，與二維凝膠電泳結(jié)合后可以進(jìn)行快速可靠性高的C端分析。此外，Young小組也發(fā)展了多種同位素標(biāo)記策略用于C端分析的新方法[31]。比如基于乙?；磻?yīng)的策略，蛋白質(zhì)經(jīng)過Lys-C酶解后，酶解混合物平均分為兩份分別與乙醛及氘代乙醛反應(yīng)，使得氨基發(fā)生了乙?；揎?，隨后再1∶1等比例混合后進(jìn)行質(zhì)譜分析。此時(shí)由酶解得到的肽段在首尾兩端分別帶有α-氨基和ε-氨基兩個(gè)乙?；奈稽c(diǎn)，所以輕標(biāo)的乙?；亩魏椭貥?biāo)的乙?；亩卧诜肿恿可嫌? Da的差別，在質(zhì)譜圖中呈現(xiàn)差6 Da的同位素對峰，而蛋白質(zhì)C末端的肽段往往只帶有一個(gè)α-氨基，所以在質(zhì)譜圖中以分子量差3 Da的對峰形式存在。類似的還有酯化反應(yīng)策略，蛋白質(zhì)經(jīng)過Glu-C酶解后，等分成兩份并分別與甲醇以及氘代甲醇發(fā)生酯化反應(yīng)，隨后再以11∶等比例混合。由酶解得到的肽段C末端為谷氨酸，含有一個(gè)α-羧基與一個(gè)側(cè)鏈羧基，所以可以和兩分子的甲醇反應(yīng)，同樣在質(zhì)譜圖上呈現(xiàn)分子量差6 Da的對峰，而蛋白質(zhì)C末端的肽段往往只帶有一個(gè)α-羧基，所以在質(zhì)譜圖中以分子量差3 Da的對峰形式存在。

通過上述的輕重同位素標(biāo)記的方法，可以很直觀地在一級質(zhì)譜圖中辨識出蛋白質(zhì)的C末端肽段，而且步驟簡單，可操作性高，非常適合用于單個(gè)蛋白質(zhì)的C端鑒定。但是該類輕重同位素標(biāo)記方法的不足之處在于通過輕重同位素標(biāo)記，譜圖的復(fù)雜程度提高了一倍，對于譜圖的解析會帶來許多困難。

本課題組在此基礎(chǔ)上，發(fā)展了一種基于惡唑酮化學(xué)的同位素標(biāo)記策略，實(shí)現(xiàn)在復(fù)雜的生物樣品中同時(shí)進(jìn)行蛋白質(zhì)C端的鑒定和相對定量[32]。該方法結(jié)合了惡唑酮化學(xué)法和雙標(biāo)的精氨酸同位素標(biāo)記。惡唑酮化學(xué)被認(rèn)為是為數(shù)不多的可以有效區(qū)分α-羧基與側(cè)鏈羧基的反應(yīng)[33]。該反應(yīng)首先通過α-羧基與甲酸和乙酸酐反應(yīng)脫水形成類似惡唑酮的中間產(chǎn)物，隨后又與氨基試劑反應(yīng)，得到含有酰胺鍵的產(chǎn)物?；趷哼蛲磻?yīng)，有一系列的功能化試劑被用于與蛋白質(zhì)C端進(jìn)行衍生反應(yīng)[33-36]。通過惡唑酮反應(yīng)，將精氨酸特異性地與蛋白質(zhì)的α-羧基結(jié)合；將蛋白質(zhì)酶解之后，帶有同位素標(biāo)簽的C端肽段在質(zhì)譜中呈現(xiàn)出對峰的峰形，從而與其他酶解肽段區(qū)分開來，通過進(jìn)一步的串聯(lián)質(zhì)譜分析，我們可以得到其序列信息。精氨酸作為衍生化試劑，可以增強(qiáng)C端肽段的堿性，從而大大提高了肽段在質(zhì)譜中的離子化效率。此外，雙標(biāo)的同位素標(biāo)記還可以用于蛋白質(zhì)C端肽段的相對定量。當(dāng)標(biāo)有輕重同位素標(biāo)記的樣品混合后進(jìn)行質(zhì)譜分析，同位素峰的信號強(qiáng)度之比即代表了來源于不同樣本之間C端肽段的量的比例。該方法有著良好的動態(tài)線性范圍，研究表明在2個(gè)數(shù)量級的范圍內(nèi)都保持一致的線性和很高的重現(xiàn)性。我們將此方法運(yùn)用于騰沖嗜熱菌的研究中，考察了在不同溫度條件培養(yǎng)下的騰沖嗜熱菌的蛋白質(zhì)C端的表達(dá)水平的差異。一共有68條C端肽段被成功鑒定到，其中有53條在兩個(gè)溫度下的騰沖嗜熱菌中都被鑒定到并有相對定量信息。在這些有表達(dá)差異的C端肽段中，大部分都?xì)w屬于各種酶蛋白、ATP功能相關(guān)蛋白以及核糖體蛋白，這些蛋白質(zhì)的變化都有可能和外界條件 (比如溫度) 有關(guān)。所以我們推想，溫度確實(shí)是一個(gè)影響騰沖嗜熱菌生物活性的重要因素。此外，還有24條非C端肽段作為可能是內(nèi)源性新產(chǎn)生的C端肽段被成功鑒定。在鑒定到的24個(gè)內(nèi)源性新C端肽段中，大部分都定位于完整蛋白質(zhì)的N端或者C端附近，說明了蛋白質(zhì)的N端和C端有著非常高的生物活性，在生命活動中起著非常重要的作用。

2.3 其他基于質(zhì)譜鑒定的C末端測序方法

此外，也有其他小組報(bào)道通過不同的酶解方式或者化學(xué)衍生手段對蛋白質(zhì)的C末端進(jìn)行序列分析。大多數(shù)的策略出發(fā)點(diǎn)仍然基于C末端肽段較之其他肽段在一級質(zhì)譜中呈現(xiàn)出各類差異性的特征，對C末端肽段進(jìn)行識別，進(jìn)而對其進(jìn)行序列的分析。比如Murphy小組結(jié)合了溴化氰化學(xué)裂解以及在酸性條件下的甲醇衍生化反應(yīng)，對于馬的Glutathlone S-Transferase蛋白進(jìn)行了C端的序列分析[37]。非C末端的酶解后得到的肽段末端都以高絲氨酸內(nèi)酯的形式存在，在酸性條件下和甲醇作用，發(fā)生開環(huán)加合反應(yīng)，使得此類肽段加上了32 Da的修飾；而唯獨(dú)酶解后的C末端肽段在C端以α-羧基的形式存在，與甲醇發(fā)生酯化反應(yīng)，有14 Da的分子量增加。通過比較反應(yīng)前后的質(zhì)譜圖，便能夠在一級質(zhì)譜圖中辨識得到蛋白質(zhì)的C末端肽段。

Tanaka小組結(jié)合了Lys-C和Lys-N的酶解特點(diǎn)，發(fā)展了Lys-C和Lys-N酶解比較的新方法用于蛋白質(zhì)C端的分析[38]。該方法使用Lys-C和Lys-N這兩種肽段內(nèi)切酶，對蛋白質(zhì)分別進(jìn)行酶解。Lys-C產(chǎn)生的都是C末端為賴氨酸的肽段，而Lys-N產(chǎn)生的則都是N末端以賴氨酸開始的肽段。將由兩種不同酶切得到的肽指紋譜圖進(jìn)行比較可以發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)N末端肽段在Lys-C酶解體系中比Lys-N的體系中多了一個(gè)賴氨酸，相反蛋白質(zhì)C末端肽段在Lys-C酶解體系中比Lys-N的體系中少了一個(gè)賴氨酸。而所有蛋白質(zhì)中間段產(chǎn)生的肽段在分子量上都沒有差別，只是序列上略有不同，Lys-C體系中的賴氨酸在C末端，而Lys-N體系中的賴氨酸在N末端。所以該方法在簡單體系中可以通過比較Lys-C與Lys-N酶解產(chǎn)物的質(zhì)譜圖，同時(shí)對蛋白質(zhì)的N端和C端進(jìn)行分析，也具有一定的適用性。但是該方法仍然受限于酶的酶切位點(diǎn)，此外也沒有自動化的平臺進(jìn)行高通量的蛋白末端鑒定分析。

3 蛋白質(zhì)C末端肽段的特異性富集策略

以上各種方法各有優(yōu)勢和適用的體系，針對于不同的蛋白質(zhì)可以選取合適的方法進(jìn)行C末端的序列分析。但是這些方法都有一個(gè)共同的不足，那就是沒有對蛋白質(zhì)C末端的肽段進(jìn)行特異性富集。這樣帶來的不利影響就是我們需要從海量的數(shù)據(jù)中首先尋找到C末端肽段，隨后才能對其進(jìn)行鑒定分析。當(dāng)C末端肽段淹沒于大量的非C末端肽段時(shí)，就必須耗費(fèi)大量的時(shí)間和精力去識別，并且有極大的可能受到非目標(biāo)肽段的干擾，而造成鑒定失敗或者信息丟失，所以此前的方法都只適用于一些簡單的體系，比如二維凝膠電泳分離后的蛋白質(zhì)或者是表達(dá)純化過的蛋白質(zhì)。理想的分析手段必須排除這些干擾，并且能應(yīng)用于高通量大規(guī)模的蛋白組學(xué)研究中，所以我們需要引進(jìn)蛋白質(zhì)C末端肽段的富集策略。

3.1 C端肽段反向富集法

相比與蛋白質(zhì)N端的富集策略，蛋白質(zhì)C端的富集辦法不是很多。這其中有兩個(gè)方面的原因：首先是因?yàn)榕c氨基相比，羧基的反應(yīng)活性相對較低，很少有方法能夠與羧基反應(yīng)達(dá)到較高的產(chǎn)率；其次，能夠特異性地區(qū)分C末端α-羧基與氨基酸殘基上羧基的反應(yīng)不多，不像N端的α-氨基有很多方法可以與賴氨酸殘基上的ε-氨基區(qū)分開來[39-40]，所以很難有效地進(jìn)行選擇性的反應(yīng)。目前，大部分的C末端富集都是基于反向富集的策略。簡單來說，就是將所有非C末端肽段通過富集手段去除，最后溶液中剩下的就是C末端肽段。本文選取幾個(gè)代表性的例子來了解目前C端肽段富集策略的研究狀況。

Chait研究小組利用脫水胰蛋白酶(Anhydro-trypsin) 首次實(shí)現(xiàn)了對C端肽段的富集[41]。脫水胰蛋白酶是一種失去催化活性的胰蛋白酶，它不具備水解蛋白質(zhì)的作用，但是仍然能夠識別C末端是賴氨酸或者精氨酸的肽段并與之結(jié)合。所以當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)首先通過Lys-C酶解后，產(chǎn)生的肽段C末端都是賴氨酸，這樣除了蛋白質(zhì)的自由C末端肽段外，其余的都能被連在固相磁珠上的脫水胰蛋白酶所捕獲。將磁珠與溶液分離后，溶液中殘留的就是蛋白質(zhì)的C末端肽段。Tsunasawa小組對該方法進(jìn)行的優(yōu)化[42]。他們針對于脫水胰蛋白酶磁球價(jià)格昂貴、反應(yīng)效率低的弊端，用DITC樹脂代替了脫水胰蛋白酶磁球與賴氨酸上的氨基反應(yīng)，同時(shí)對N端的氨基進(jìn)行了TMPP修飾，以提高肽段在質(zhì)譜中的響應(yīng)信號?；谶@樣的方法，作者測定了3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白以及PfuRPA 3個(gè)亞單元的C端序列并且將該方法用于De novo測序。

前兩種方法都是基于固相材料上的功能化基團(tuán)與肽段的氨基發(fā)生的修飾。Overall研究小組發(fā)展了針對于酸性氨基酸修飾的新方法[43]。蛋白樣品經(jīng)過還原烷基化后首先將所有的氨基通過甲基化保護(hù)起來，隨后通過EDC/NHS反應(yīng)，將所有羧基 (包括谷氨酸以天冬氨酸殘基上的羧基以及蛋白質(zhì)C端的α-羧基) 用乙醇胺封閉。經(jīng)過胰蛋白酶水解后，再一次將酶解生成的α-氨基通過甲基化封閉。此時(shí)只有酶解新產(chǎn)生的肽段有自由的α-羧基，而蛋白質(zhì)C末端的肽段已經(jīng)不含有自由的α-羧基。此時(shí)將含有豐富氨基的高分子材料與這些α-羧基進(jìn)行EDC/NHS偶聯(lián)反應(yīng)，通過超濾后，溶液中保留的便是衍生化后的蛋白質(zhì)C末端肽段。研究小組將該方法用于E. coli的分析鑒定中，這是首次將C末端反向富集的方法真正應(yīng)用于復(fù)雜生物體系中。結(jié)果顯示在富集之前，所有鑒定結(jié)果中只有2.2%歸屬于C末端肽段，而富集之后，C末端肽段的比例達(dá)到了72.3%?；诖祟惙聪蚋患牟呗裕撗芯啃〗M引入同位素標(biāo)簽，發(fā)展了“底物C端氨基同位素標(biāo)記法 (C-terminal amine-based isotope labeling of substrates，C-TAILS)”的方法，用于研究由酶作用降解后產(chǎn)生的新的C端。通過同位素標(biāo)記分別在對照樣品與酶促作用后的蛋白質(zhì)標(biāo)上輕標(biāo)同位素以及重標(biāo)同位素，等比例混合后經(jīng)過酶解和C末端肽段反向富集。在質(zhì)譜圖中，蛋白質(zhì)正常的C端由于在兩組樣品中都存在，所以以強(qiáng)度相同的對峰形式存在，而經(jīng)過酶解作用降解得到的新的蛋白質(zhì)C端，則只產(chǎn)生帶有重同位素標(biāo)記的質(zhì)譜峰。通過這樣的方法可以尋找內(nèi)源性降解產(chǎn)生的新蛋白質(zhì)C端，從而對酶作用的底物的位點(diǎn)進(jìn)行研究分析。

但是相對于正向富集策略，反向富集的實(shí)現(xiàn)取決于捕獲反應(yīng)的效率和完全性。一般來說這樣的富集策略效率偏低，所以目前大部分的研究工作還主要集中在簡單體系中。

3.2 C端肽段正向富集法

目前基于正向富集策略的C端富集方法極其有限，Jaffrey小組利用酶促法將蛋白質(zhì)的C末端特異性地標(biāo)上帶有生物素的標(biāo)簽(Profiling protein C-terminal by enzymatic labeling，ProC-TEL)，用于C末端肽段的正向富集[44]。這是第一篇有關(guān)C末端正向富集策略的研究。羧肽酶Y不僅具有催化C末端氨基酸水解的活性，同時(shí)也具有轉(zhuǎn)肽酶的活性，可以用帶有標(biāo)簽的氨基酸置換C末端原有的氨基酸。特別是當(dāng)C末端羧基形成酯的時(shí)候，轉(zhuǎn)肽酶的活性可以大大提高[45-47]。基于此，研究者首先在蛋白水平上將蛋白質(zhì)所有的羧基進(jìn)行酯化反應(yīng)，通過羧肽酶Y的轉(zhuǎn)肽酶作用，使蛋白質(zhì)的C末端帶上含有生物素的標(biāo)簽，而側(cè)鏈上被封閉的羧基在進(jìn)一步的酯水解作用下還原得到游離的羧基。經(jīng)過胰蛋白酶酶解后，只有C末端肽段帶上了生物素的標(biāo)簽，通過其與親和素的親和作用，最后達(dá)到C末端肽段的富集目的。該方法用于E. coli的研究中，一共有70條C末端肽段被鑒定得到。

4 展望

蛋白質(zhì)C末端的研究越來越受到人們的關(guān)注。它不僅是作為蛋白質(zhì)N末端研究的補(bǔ)充，為我們提供了更全面的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)信息，同時(shí)它也為我們開拓了一個(gè)嶄新的領(lǐng)域，幫助我們?nèi)チ私夂脱芯康鞍踪|(zhì)C末端在各項(xiàng)生命活動中發(fā)揮的重要生物學(xué)功能。例如蛋白質(zhì)C末端的序列，翻譯后修飾，表達(dá)水平以及內(nèi)源性降解產(chǎn)生的新的蛋白質(zhì)C末端等都值得我們?nèi)ド钊氲靥剿骱退伎??；谏镔|(zhì)譜的蛋白質(zhì)C末端研究正是提供了這樣的研究分析平臺，盡管目前的方法各有利弊，都不是十分成熟，但是仍然可以看到其在研究蛋白質(zhì)C末端中潛在的巨大應(yīng)用前景。因此，發(fā)展能夠應(yīng)用于復(fù)雜生物體系的蛋白質(zhì)C末端富集、鑒定和定量方法，對于進(jìn)一步深入理解蛋白質(zhì)的C末端生物學(xué)功能具有重大意義。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

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C-terminal proteomics: strategies for characterization of protein C-terminus using MS-based techniques

Minbo Liu1,2, and Haojie Lu1,2
1 Department of Chemistry, Fudan University, Shanghai 200433, China 2 Institutes of Biomedical Sciences, Fudan University, Shanghai 200032, China

C-termini of proteins often play an important role in various biological processes, such as the transcription and translation from DNA to protein and also participating in various biological regulations. The determination of protein C-terminus is so crucial because it provides not only distinct functional annotation, but also a way to monitor the proteolysis-modified proteins. Based on the biological mass spectrometry, a series of novel methods and technologies were developed both for qualitative and quantitative analyses of protein C-terminus. These methods or technologies can be applied to accurate and effective protein C-terminus profiling, including the sequences and quantitative information of C-termini, which reveals the biological function of C-termini in life’s activities and provides a better understanding of thedegradation of mature proteins. Combined with our research, this review highlights the improvements in C-terminal proteomics study in the past decades, including the methodologies for recognition and identification of C-terminus, as well as the enrichment strategies for protein C-terminus.

proteomics, protein C-terminus, biological mass spectrometry, enrichment

January 17, 2014; Accepted: April 9, 2014

Haojie Lu. Tel: +86-21-54237416; Fax: +86-21-54237486; E-mail: luhaojie@fudan.edu.cn

劉忞博, 陸豪杰. 基于生物質(zhì)譜的蛋白質(zhì)C末端研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(7): 1083–1093.

Liu MB, Lu HJ. C-terminal proteomics: strategies for characterization of protein C-terminus using MS-based techniques. Chin J Biotech, 2014, 30(7): 1083–1093.

Supported by: National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2012CB910602), National Science Foundation of China (No. 21025519).

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2012CB910602)，國家自然科學(xué)基金 (No. 21025519) 資助。