劉旭強(qiáng)，李 軍，劉維娟，張艷林，鄭甜田，王亞明

[1.昆明理工大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，云南 昆明650500；2.云南瑞升煙草技術(shù)(集團(tuán))有限公司，云南 昆明 650106]

煙草(草煙)是一種多年生草本植物，它具有悠久的種植歷史，生長在世界各地的多處地域，其主要用于商業(yè)生產(chǎn)香煙和相關(guān)的煙草產(chǎn)品。由于吸煙有害健康和其它禁煙法規(guī)的出現(xiàn)，導(dǎo)致煙草的使用前景受到影響，并且對煙農(nóng)的收入也產(chǎn)生了負(fù)面影響。然而，煙草除了制煙吸食，還具有許多其它未開發(fā)的價(jià)值，尤其是從生化科技方面來看，煙草其實(shí)是一種極其豐富的生化資源。

蛋白質(zhì)是煙草眾多成分中含量最多的一種，其在白肋煙中的含量高達(dá)20.48%[1]。隨著人們對蛋白質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，植物蛋白是利用價(jià)值極高的一種蛋白資源，因此漸漸開始關(guān)注植物蛋白。植物蛋白可以在醫(yī)藥、食用等方面產(chǎn)生巨大的效益，對飲食不足和醫(yī)用蛋白昂貴等問題提供了嶄新的解決思路。煙草是提取植物蛋白的良好原料之一，煙草中含有大量的蛋白質(zhì)，煙草蛋白中各種氨基酸含量極其豐富、均衡，經(jīng)過精密的高新技術(shù)加工后，可以得到生物活性肽和氨基酸等的高附加值產(chǎn)品[2]。而且，煙草作為提取蛋白質(zhì)的原材料，成本低廉。近年來，相關(guān)工作者對從煙草中提取蛋白質(zhì)也做了大量的研究，使提取工藝合理化。作者綜述了煙草蛋白的提取和利用，旨在為相關(guān)研究工作者提供幫助。

1 煙草蛋白質(zhì)的測定與提取

煙草中含有豐富的蛋白質(zhì)(煙草蛋白可分為可溶性蛋白質(zhì)和不可溶性蛋白質(zhì)，其中可溶性蛋白包括葉綠體蛋白質(zhì)FⅠ蛋白和蛋白質(zhì)復(fù)合物FⅡ蛋白)，其對煙草的生長具有重要的生物學(xué)意義。然而，蛋白質(zhì)對提高卷煙的質(zhì)量不會(huì)起很大的作用，并且，它是卷煙吸食過程中產(chǎn)生很多對人體有害物質(zhì)的前體。王瑞新等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，如果蛋白質(zhì)的含量過低，就會(huì)影響吸味，使卷煙吸食時(shí)淡而無味，從而影響到卷煙的質(zhì)量；如果蛋白質(zhì)的含量過高，也會(huì)影響卷煙的吸味，會(huì)產(chǎn)生燒焦羽毛的刺鼻氣味。相反，蛋白質(zhì)在醫(yī)學(xué)、化工、生物學(xué)等領(lǐng)域卻具有極大的作用。因此，蛋白質(zhì)的測定與提取具有極其重要的意義。

1.1 煙草蛋白質(zhì)的測定

1.1.1 凱氏定氮法

煙草蛋白質(zhì)中含有氮，樣品中的蛋白質(zhì)會(huì)在酸和催化劑加熱的共同作用下分解，產(chǎn)生的氨會(huì)與硫酸生成硫酸銨，再堿化，使氨游離。用硼酸吸收，再用硫酸或鹽酸滴定，根據(jù)酸的消耗量來確定蛋白質(zhì)含量。具體操作步驟：取樣品→置于干燥的凱式燒瓶→加入硫酸銅、硫酸鉀、硫酸→炭化，加熱至液體呈藍(lán)綠色且澄清定容→定氮蒸餾→堿化蒸餾→計(jì)算蛋白質(zhì)含量[4]。

1.1.2 雙縮脲(Biuret)法

煙草蛋白質(zhì)含有肽鍵(—CO—NH—)，可以發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，堿性溶液中，與二價(jià)銅離子作用形成紫紅色的絡(luò)合物。而且，其反應(yīng)呈現(xiàn)的顏色會(huì)隨肽鍵含量(即蛋白質(zhì)含量)不同而不同，因此，可以通過比色法，來檢測蛋白質(zhì)的含量。雙縮脲法測定蛋白質(zhì)速度快，但準(zhǔn)確度不是很高。具體操作步驟：做標(biāo)樣7個(gè)→分光光度計(jì)540 nm處檢測→繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(吸光度為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)體積分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo))→通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求蛋白質(zhì)含量。

1.1.3 紫外光譜法

煙草蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸以及色氨酸殘基的苯環(huán)等含有共軛雙鍵，其蛋白質(zhì)具有了吸收紫外光譜的性質(zhì)。其吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，吸收峰為280 nm，溶液在238 nm處的光吸收值與肽鍵含量也成正比。由于干擾物的存在(如核酸，雖有校正，但誤差仍然是存在的)，紫外光譜法對蛋白質(zhì)含量的測定不夠精確，但是，其操作簡單、方便、樣品消耗量特別少。具體操作步驟：配置濃度依次遞增的8個(gè)樣品→混勻→分別測定在280 nm處的吸光度→繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線→根據(jù)蛋白質(zhì)樣品溶液在280 nm處的吸光度得到其體積分?jǐn)?shù)。

1.2 煙草蛋白質(zhì)的提取

1.2.1 酸堿提取法

酸堿提取法[5]可以從煙草漿料中提取煙草蛋白質(zhì)，可以大規(guī)模量產(chǎn)。具體步驟為：首先，74 μm濾布過濾，再用濾紙抽濾除雜，用KOH堿溶一次→74 μm濾布過濾，濾渣堿溶2次；使用精密pH計(jì)測定pH值→取濾液離心除雜→取上清液，使用H3PO4酸沉→在4 ℃冰箱靜置沉淀蛋白2 h。離心，即可得到蛋白質(zhì)沉淀。

1.2.2 回收無尼古丁的蛋白質(zhì)

從煙草中回收不含尼古丁的蛋白質(zhì)，對煙農(nóng)提高收益和煙草的應(yīng)用來說是至關(guān)重要的。這個(gè)工藝過程是可以實(shí)現(xiàn)的。H Fu等[6]得出，通過用(Na2HPO4-KH2PO4)緩沖溶液處理煙草，可得到不含尼古丁的蛋白質(zhì)，同時(shí)，煙草蛋白的分離率也相應(yīng)得到增加。最佳工藝條件為m(緩沖液)∶m(煙草)=4.75，緩沖液pH=7.85，c(緩沖液)=0.085 mol/L，此時(shí)，可溶性蛋白質(zhì)達(dá)到最大產(chǎn)量為12.85 mg/g新鮮煙草。所有研究的方法中最有效的是用丙酮在20 ℃下除去蛋白質(zhì)中的尼古丁，但是，它也大幅度降低了蛋白質(zhì)的回收率。超濾也可以去除所含尼古丁，而且蛋白質(zhì)的回收率高達(dá)94.5%。但是，超濾只能除去50%的殘留尼古丁。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的磷酸在pH=3.5的條件下清洗3次，可以除去殘余在蛋白質(zhì)中的尼古丁，蛋白質(zhì)的回收率為94.5%。H Fu等通過用(Na2HPO4-KH2PO4)緩沖溶液處理煙草的規(guī)模化進(jìn)行，將為進(jìn)一步工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)不含尼古丁的煙草蛋白提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

2 煙草蛋白質(zhì)的綜合利用

“禁止吸煙”會(huì)對煙草行業(yè)造成巨大沖擊，會(huì)讓煙農(nóng)擔(dān)心煙草的銷量問題，煙草的合理利用將直接關(guān)系到煙農(nóng)的利益。高濃度煙草蛋白質(zhì)的提取和利用，給了解決這一問題的新思路。

2.1 應(yīng)用于飼料

通過Ames的實(shí)驗(yàn)[7](污染物致突變性檢測)證明，不含尼古丁的蛋白質(zhì)不會(huì)誘發(fā)動(dòng)物變異。研究發(fā)現(xiàn)[8]，煙草蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值極高，在各種植物蛋白營養(yǎng)價(jià)值比較中非常突出，其營養(yǎng)價(jià)值和牛奶相近，高于大多數(shù)的植物蛋白質(zhì)。從煙草中提取出來的蛋白質(zhì)含有豐富的氨基酸，其中蘇氨酸和色氨酸等遠(yuǎn)高于魚骨粉做的動(dòng)物飼料，是良好的天然營養(yǎng)動(dòng)物飼料和飼料添加劑。

2.2 應(yīng)用于食品

人口增多，可利用資源減少，充足的飲食依然是世界性問題。煙草蛋白質(zhì)營養(yǎng)豐富，在植物蛋白質(zhì)營養(yǎng)排序中，煙草蛋白居于榜首。郭培國等[9]相關(guān)工作者研究發(fā)現(xiàn)，從煙草中提取的煙草蛋白營養(yǎng)高于奶酪和雞蛋，可以用來制作奶酪和作為雞蛋替代品。早在20世紀(jì)70年代，美國生物學(xué)教授塞繆爾·威爾海曼發(fā)現(xiàn)了一種從煙草植物中提取的蛋白，其營養(yǎng)價(jià)值超過了牛奶中的酪蛋白。提取得到煙草蛋白可以如制作豆腐一樣，制成煙草蛋白豆腐，這種豆腐嫩滑，口感極好。目前，很多食品添加劑都存在安全隱患，用煙草蛋白可以制成無毒、天然、營養(yǎng)食品添加劑，煙草蛋白還可通過加工制成各種營養(yǎng)食品，供給食用。

通過使用內(nèi)外切蛋白復(fù)合酶，將蛋白質(zhì)進(jìn)行可控的分解，由于分解程度的不同，可以得到多種的氨基酸和活性肽。通過多級膜分離、吸附分離和離子交換等技術(shù)處理可得到目標(biāo)產(chǎn)物，再經(jīng)過一系列的后續(xù)加工，就可得到具有特殊功能的食品[10]。

2.3 應(yīng)用于醫(yī)藥

煙草蛋白質(zhì)具有高純度、低鹽分、眾多氨基酸組成且平衡等特性，可以供給腎臟病人、忌鹽患者和燒傷病人等使用。郭俊成等[11]國內(nèi)科學(xué)工作者近年來證實(shí)，組分-Ⅰ蛋白具有抗氧化性，含有硒的組分-Ⅰ蛋白抗氧化性會(huì)更強(qiáng)。硒是人體必需微量的元素之一，而且，硒在防治克山病、大骨節(jié)病、癌癥及腫瘤等方面具有重要的作用。硒蛋白在脂質(zhì)過氧化方面明顯要好于不含硒的蛋白質(zhì)，硒的抗氧化作用可以清除細(xì)胞體系的活性氧化基和化學(xué)反應(yīng)生成的自由基，可以阻止它們對肝臟的傷害，防止肝病向癌癥的轉(zhuǎn)化。煙葉硒具有低毒、高效等特點(diǎn)，其具有很大的開發(fā)前景，而且，我國衛(wèi)生部已經(jīng)批準(zhǔn)煙葉硒蛋白作為添加劑制作食品和醫(yī)藥保健品。

美國佛羅里達(dá)生物技術(shù)研究所[12]已經(jīng)成功的建立了一條煙草蛋白生產(chǎn)線，來從煙草中提取蛋白質(zhì)供給藥用。加利福尼亞州的一家生物遺傳公司于1990年將煙草植物花葉病毒引入藥草植株內(nèi)，生產(chǎn)出病毒編碼蛋白。煙草蛋白質(zhì)具有很高的藥用價(jià)值，等待相關(guān)科研工作者的開發(fā)利用。

2.4 轉(zhuǎn)基因作用于植被

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)[13]，有種特殊的cDNAs存在于煙草花的蜜腺中，它能產(chǎn)生出特殊的蛋白酶，這種蛋白酶可以抵抗微生物，保護(hù)植被不受微生物的損害?，F(xiàn)今正在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的研究，研究如何將這種cDNAs轉(zhuǎn)移到其它植被中去。如轉(zhuǎn)移到農(nóng)作物中，用來抵抗微生物的侵害，就會(huì)減少農(nóng)藥的使用，既降低了農(nóng)作物的種植成本，還減少了農(nóng)作物的藥物殘留，又有利于環(huán)境保護(hù)。

其它植被的cDNAs也可以通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)移到煙草中，通過煙草來生產(chǎn)其它植被的蛋白質(zhì)。如將大豆球蛋白的cDNAs轉(zhuǎn)移到煙草的基因組中，在煙草種子中以一種特殊的方式產(chǎn)生出大豆球蛋白，并且，其產(chǎn)出的蛋白質(zhì)的質(zhì)量、特性、功能等與大豆球蛋白并無多大區(qū)別[14-15]。

2.5 制備生物活性肽

通過酶的水解作用，煙草蛋白質(zhì)可以分解為許多種生物活性肽，其中，有簡單的二肽，也有經(jīng)過糖苷化、磷酸化的復(fù)雜長鏈或環(huán)狀多肽。目前，生物科技研究發(fā)現(xiàn)[16]，生物活性肽具有調(diào)節(jié)免疫力、激素、調(diào)節(jié)神經(jīng)、抵抗病毒、抵御癌癥和高血壓、抗氧化衰老等許多種生理功能，這對人類健康起著不可忽視的重大影響。如，將生物活性肽添加到食物當(dāng)中，可以加工成抗癌、抗高血壓、提高免疫力等特定功能的食品或藥物。目前，對于從煙草蛋白中提取活性肽的報(bào)道并不多見，煙草蛋白質(zhì)作為提取生物活性肽的重要潛在資源之一，有待相關(guān)研究人員的開發(fā)利用。

2.6 通過Maillard反應(yīng)制備香辛香料

通過酶的可控水解作用，煙草蛋白質(zhì)會(huì)分解為多種氨基酸和生物活性肽，其中，低次煙草的酶解液可以與還原糖、醇等發(fā)生Maillard反應(yīng)，生成醬香、果香、煙草香、中藥香等各種濃郁香味的無毒香料。這些香料可以制成煙草香辛香料或食用香料。美拉德反應(yīng)(Maillard Reaction)亦稱非酶褐變反應(yīng)(Non-enzymatic Browning Reaction)，是在1912年，由L C Maillard提出的，主要研究還原糖和氨基酸、蛋白質(zhì)之間的復(fù)雜反應(yīng)[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)[19]，卷煙中焦油含量的增加會(huì)使相關(guān)疾病的發(fā)病率提高，而降低焦油的含量，則會(huì)使卷煙的香味降低、吸味減弱、影響卷煙的質(zhì)量，這一直困擾著卷煙的制造者。美拉德反應(yīng)制取的香料則會(huì)掩蓋低焦油卷煙的雜氣、降低刺激性氣味、提高香氣，在改善卷煙的質(zhì)量和吸味上會(huì)具有很明顯的作用。因此，國內(nèi)外對通過Maillard反應(yīng)制備香辛香料提高卷煙吸味的研究廣泛關(guān)注。

3 結(jié)束語

現(xiàn)今，生化技術(shù)迅猛發(fā)展，分子技術(shù)特別是基因改造技術(shù)進(jìn)展巨大，對煙草蛋白質(zhì)進(jìn)行特定的基因改造，生產(chǎn)特定功能的蛋白質(zhì)已經(jīng)不是難題。并且，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)基因均可導(dǎo)入煙草中進(jìn)行表達(dá)，得到改造后的特定煙草蛋白質(zhì)，進(jìn)而用來生產(chǎn)特定功能的蛋白質(zhì)，如具有抗菌、抗癌等功能的蛋白[20]。煙草蛋白質(zhì)可以通過提取、后續(xù)加工，直接生產(chǎn)成無毒營養(yǎng)食品添加劑和各種豐富的營養(yǎng)食品、動(dòng)物營養(yǎng)飼料和飼料添加劑，還可以用來生產(chǎn)藥用蛋白。煙草蛋白在醫(yī)藥、飲食、生化等方面有著顯著的開發(fā)前景?，F(xiàn)在“禁止吸煙”的標(biāo)志越來越常見，煙草的消耗會(huì)隨之減少，這給煙農(nóng)帶來了巨大的壓力，而煙草蛋白的提取、利用將會(huì)使煙草的消耗量增加，會(huì)直接給煙農(nóng)帶來經(jīng)濟(jì)利益?？梢灶A(yù)見煙草蛋白質(zhì)的廣闊發(fā)展前景，其很可能將成為人類未來蛋白質(zhì)的主要來源之一。煙草蛋白的巨大潛在價(jià)值及應(yīng)用仍然有待相關(guān)科研工作者的研究開發(fā)。

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