盧 英，蔡光先*，譚 琥，鄧叔華，易 健，劉柏炎

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)2011級(jí)碩士研究生班，湖南 長沙 410208；

2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410007；

3.益陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，湖南 益陽 413000）

大腦中動(dòng)脈線栓法腦缺血模型制作的改進(jìn)及經(jīng)驗(yàn)探討

盧 英1，蔡光先2*，譚 琥2，鄧叔華1，易 健2，劉柏炎3

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)2011級(jí)碩士研究生班，湖南 長沙 410208；

2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410007；

3.益陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，湖南 益陽 413000）

目前局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ妥畛Ｓ玫姆椒ㄊ谴竽X中動(dòng)脈線栓法（MCAO），但該方法仍存在技術(shù)要求高、模型差異性大、動(dòng)物死亡率高等缺陷。因此，如何建立穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性高的MCAO動(dòng)物模型成為我們亟需解決的問題。從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、麻醉藥物、栓線的選擇，手術(shù)流程、術(shù)后護(hù)理等多個(gè)方面進(jìn)行探討，以期提高M(jìn)CAO腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷某晒β省?/p>

大腦中動(dòng)脈線栓法；腦缺血；模型大鼠

局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷闹谱鞣椒ū姸啵渲写竽X中動(dòng)脈線栓法 （Middle cerebral artery occlusion，MCAO）以其不開顱、易操作、損害小及對(duì)生理指標(biāo)影響小等優(yōu)點(diǎn)受到學(xué)者們的高度重視，廣泛應(yīng)用于藥效的評(píng)價(jià)及腦缺血-再灌注多方面的研究[1]。目前國內(nèi)所用MCAO操作流程均參照Longa等的方法，但該操作流程技術(shù)要求高，不同的人造出的模型差異性大，動(dòng)物死亡率高，大大降低了它的可比性和實(shí)用性。本實(shí)驗(yàn)室近10年來使用MCAO大鼠模型進(jìn)行腦缺血實(shí)驗(yàn)研究，完成了多個(gè)973，國家自然基金，省、廳級(jí)課題，手術(shù)成功率達(dá)80%以上。因此，本文結(jié)合文獻(xiàn)查閱的方法，將MCAO模型制備遇到的問題及解決方法做一介紹，供同仁參考。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（Experimental Animal）

MCAO動(dòng)物模型最初主要用大型動(dòng)物作為研究對(duì)象[2]，但大動(dòng)物購買費(fèi)用高，梗死灶變化較大，不利于實(shí)驗(yàn)研究。因此，目前MCAO模型所選動(dòng)物絕大部分是嚙齒類動(dòng)物[3]。在嚙齒類動(dòng)物中，大鼠的腦血管與人類的腦血管具有相似性，且其有較強(qiáng)的抗感染力、成本低、種系內(nèi)純合性好等特點(diǎn)，被廣泛用于腦缺血實(shí)驗(yàn)。國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室所用大鼠主要有SD和Wistar兩個(gè)品系。相比較而言，SD大鼠可見恒定的頂顳皮質(zhì)梗死灶，梗死體積大于Wistar大鼠，變異較小，缺血半暗帶所占體積明顯小于Wistar大鼠[4]，因此多首選SD大鼠。另外，由于不同體質(zhì)量大鼠大腦中動(dòng)脈（middle cerebral artery，MCA）的粗細(xì)及長短差距較大，這在很大程度上影響著模型的成功率。目前多數(shù)文獻(xiàn)認(rèn)為大鼠體質(zhì)量應(yīng)該控制在 250～ 350 g之間[5]，但本實(shí)驗(yàn)室認(rèn)為以控制在260～300 g之間為宜。理由有三:第一，大鼠手術(shù)前禁食12 h后，體質(zhì)量會(huì)減輕14～15 g；第二，禁食后體質(zhì)量小于250 g的大鼠，對(duì)麻醉藥耐受差，魚線難以插入，且術(shù)后大鼠易死亡；第三，禁食后體質(zhì)量大于290 g，甚至300 g以上的大鼠側(cè)支循環(huán)能在較短時(shí)間內(nèi)建立完善，神經(jīng)功能恢復(fù)快，不利于藥物效果的評(píng)價(jià)。

2 麻醉劑（Anesthetics）

腦缺血手術(shù)中大鼠需要在全身麻醉的情況下進(jìn)行，但全身麻醉對(duì)動(dòng)物的血液循環(huán)、呼吸、腦代謝等均具有較大的影響，甚至直接導(dǎo)致動(dòng)物死亡，因此需選擇合適的麻醉劑。實(shí)驗(yàn)所用麻醉劑分為氣體吸入麻醉和腹腔注射麻醉，但氣體麻醉設(shè)備要求高、作用時(shí)間短，故未被國內(nèi)大多數(shù)人采用。水合氯醛和戊巴比妥鈉均通過腹腔注射，操作簡(jiǎn)單，麻醉時(shí)間適中，是目前國內(nèi)主要的麻醉劑。有研究[6]認(rèn)為水合氯醛對(duì)胃腸道及呼吸道影響較大，動(dòng)物蘇醒后狀態(tài)不佳，而戊巴比妥鈉較少出現(xiàn)上述現(xiàn)象；但有學(xué)者[7]認(rèn)為巴比妥類對(duì)腦缺氧有保護(hù)作用，故不應(yīng)該用于腦缺血實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水合氯醛過量時(shí)大鼠會(huì)出現(xiàn)口、鼻分泌物增多等現(xiàn)象，只要掌握好劑量即可避免這種現(xiàn)象。因此，推薦使用10%的水合氯醛麻醉，但需注意以下幾點(diǎn):第一，配水合氯醛時(shí)稱量要嚴(yán)格；第二，現(xiàn)配現(xiàn)用；第三，嚴(yán)格按動(dòng)物體質(zhì)量計(jì)算藥量，體質(zhì)量在260～300 g的大鼠，麻醉量應(yīng)在0.35 mL/100 g的基礎(chǔ)上加0.1 mL效果最佳，這時(shí)的大鼠全身松軟，不能自主運(yùn)動(dòng)，生命體征平穩(wěn)，能耐受整個(gè)手術(shù)過程；第四，若大鼠未完全麻醉，可根據(jù)大鼠麻醉程度加量，即大鼠能夠綁于鼠板上，但分離筋膜時(shí)有掙扎，可加0.1～0.2 mL；備皮時(shí)掙扎加0.2～0.3 mL；能夠爬或不能綁在鼠板上，加0.5 mL。

3 栓線（Plug Line）

目前多數(shù)實(shí)驗(yàn)室用釣魚線做栓線，但魚線有直徑和硬度的區(qū)別。一般實(shí)驗(yàn)人員只考慮魚線大小是否合適，并未考慮魚線硬度與模型成功之間的關(guān)系。關(guān)云謙等[8]研究發(fā)現(xiàn)，相同直徑的魚線，隨著魚線硬度的增加，蛛網(wǎng)膜下腔出血的發(fā)生率呈明顯上升趨勢(shì)，模型成功率明顯下降。因此，相同直徑的魚線，以硬度稍軟的為佳，但需要注意的是魚線過軟不利于插入MCA中。在魚線直徑的選擇上，本實(shí)驗(yàn)室認(rèn)為禁食后體質(zhì)量在250～290 g的大鼠，魚線選擇直徑為0.25 mm的較為合適。

手術(shù)前魚線的處理相當(dāng)重要，Longa等的方法與栓線法創(chuàng)始者Koizumi等的方法，主要差別是栓線頭的處理不同:Koizumi等在栓線一端涂布硅膠，而Longa等則是將栓線一端在火焰上燒灼處一個(gè)鈍頭[9]。雖然二者的處理方法不同，但都是為了減少栓線頭對(duì)血管的損傷，而Shimamura[10]證實(shí)，處理過的栓線確實(shí)能夠提高大鼠的存活率、減少梗死體積變異以及產(chǎn)生一致性較高的神經(jīng)功能評(píng)分。目前國內(nèi)對(duì)魚線頭的處理上，主要有以下三種方法[3]:（1）直接將頭端用酒精燈或電烙鐵燙成光滑而膨大的球形；（2）在魚線表面涂以化學(xué)物質(zhì)，如硅膠、石蠟等；（3）將頭端燙圓后再涂上0.1%左旋多聚賴氨酸。本實(shí)驗(yàn)室則是將魚線頭直接在熾熱的白熾燈表面摩擦，使線頭光滑，不會(huì)劃傷血管即可。線頭處理好后的魚線需要用黑色油性記號(hào)筆做標(biāo)記，以便手術(shù)過程中節(jié)省時(shí)間。之后將魚線放入75%乙醇中浸泡至少1 h，再用生理鹽水沖洗干凈。這時(shí)直接將魚線放入干凈的培養(yǎng)皿中保存，但也有人會(huì)將魚線再用肝素浸泡，以防止魚線插入MCA后引起血栓形成。魚線是否有必要用肝素浸泡，目前尚無專門的文獻(xiàn)報(bào)道。但是需要指出的是，肝素浸泡后的魚線會(huì)變直，這不利于魚線插入MCA。

4 手術(shù)流程（Surgical Process）

Longa的操作方法有諸多不合理的地方，因此目前多采用改良的Longa方法。首先，切口位置的選擇，楊贊章等[11]認(rèn)為頸旁切口出血較正中切口少，視野暴露充分；先雄斌等[4]進(jìn)一步指出切口應(yīng)在頸前正中線外側(cè)約0.5 cm處，切口長約2.5 cm。其次，傳統(tǒng)方法是撕裂胸骨舌骨肌并暴露氣管，從氣管旁分離左側(cè)頸總動(dòng)脈 （common carotid artery，CCA）等，這種方法一方面會(huì)損傷氣管，影響大鼠呼吸，另一方面不利于術(shù)后傷口的恢復(fù)。因此，現(xiàn)在多采用鈍性分離胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌間的肌間隙，暴露CCA和迷走神經(jīng)，從而避免傷及氣管。另外楊贊章等[11]主張?jiān)诒┞兜那锌谔幍紊仙僭S利多卡因，以減輕對(duì)迷走神經(jīng)和氣管的刺激。再次，在頸外動(dòng)脈（External carotid artery，ECA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（Internal Carotid artery，ICA）分支的處理上也與Longa的方法有很大差異。如吳培要等[12]分離出ICA和枕動(dòng)脈，用燒灼法離斷枕動(dòng)脈，在ECA下穿線2根，線一離CCA分叉處3 mm結(jié)扎不剪斷，線二不結(jié)扎以供牽拉備用，動(dòng)脈夾夾閉CCA、ICA，于2根線之間的ECA剪一切口，將栓線由此口插入，進(jìn)入ICA；崔利德等[13]則在ECA的起始處穿線并結(jié)扎該動(dòng)脈，然后在CCA的近心端穿線并結(jié)扎該動(dòng)脈，并留一線備用，用動(dòng)脈夾夾閉CCA的末端，然后在CCA近動(dòng)脈夾處用眼科剪剪一小口將栓線插入，接著用備用線系住，防止出血，放開動(dòng)脈夾插線。本實(shí)驗(yàn)室認(rèn)為吳氏等的方法需要分離出一定長度的ECA，且要用燒灼法切斷ECA和枕動(dòng)脈，很容易傷及ICA及周圍神經(jīng)，且延長手術(shù)時(shí)間，增加手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)；而崔氏等的方法與本實(shí)驗(yàn)室的相似，但也有不同之處。本實(shí)驗(yàn)室在結(jié)扎ECA后，用1個(gè)動(dòng)脈夾夾住ICA，且盡可能遠(yuǎn)離三岔口處，1個(gè)動(dòng)脈夾夾住CCA，且盡可能遠(yuǎn)離三岔口處，用穿線貼著動(dòng)脈夾結(jié)扎CCA（勿剪斷，備用），松開動(dòng)脈夾。在CCA上稍遠(yuǎn)離三岔口的位置用眼科剪剪一小口將栓線插入ICA內(nèi)，此時(shí)松開ICA上的動(dòng)脈夾，同時(shí)用一手拉緊CCA上的結(jié)扎線，防止動(dòng)脈夾松開后ICA出血。最后，將栓線繼續(xù)插入，直到栓線標(biāo)記處達(dá)到三岔口處停止，此時(shí)會(huì)感到有輕微阻力，然后迅速用穿線將ICA結(jié)扎。在此過程中，需要特別注意的是ICA上的唯一分支——翼腭動(dòng)脈 （Pterygopalatine artery，PPA），若魚線只插進(jìn)10 mm就有明顯阻力，則提示魚線插入了PPA。對(duì)于新手來說這是經(jīng)常會(huì)碰到的情況，且多次調(diào)整方向后仍會(huì)插入其中，這是手術(shù)失敗的最常見原因。因此，Woitzik J等[14]提出可通過事先結(jié)扎PPA的方法來解決這個(gè)問題。但這種方法不可取，因?yàn)镻PA位置較深，結(jié)扎PPA需要繼續(xù)沿ICA分離肌肉，但該處有迷走神經(jīng)及其他小神經(jīng)和小血管經(jīng)過，分離該處肌肉將會(huì)增加出血風(fēng)險(xiǎn)和神經(jīng)損傷風(fēng)險(xiǎn)，且不利于大鼠術(shù)后的恢復(fù)。

本實(shí)驗(yàn)室操作流程:在大鼠兩前肢連線稍上方與前正中線旁開0.5～1 cm交叉處，用手術(shù)剪向大鼠嘴部方向剪一適當(dāng)口子 （長度根據(jù)操作者手術(shù)熟練度而定，一般在2.5 cm以內(nèi)）。然后用手術(shù)彎鑷鈍性分離胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌間的肌間隙，此時(shí)視野下可見由前斜角肌、中斜角肌、后斜角肌等頸深肌匯聚成的三角形區(qū)域，CCA就在該三角區(qū)下面靠?jī)?nèi)側(cè)部位，沿著這些肌間隙繼續(xù)鈍性分離，即可見一搏動(dòng)的紅色血管，此即CCA，在其外側(cè)緊靠著迷走神經(jīng) （有時(shí)迷走神經(jīng)也可貼在CCA上面），用鑷子將CCA和迷走神經(jīng)游離出來，并使迷走神經(jīng)置于CCA的外側(cè)，在CCA上穿一結(jié)扎線。沿著CCA繼續(xù)游離出ICA和ECA，并在ICA和ECA上各穿一結(jié)扎線。需要注意的是在CCA、ICA和ECA交叉處有一小血管即枕動(dòng)脈，在游離ECA和ICA時(shí)枕動(dòng)脈容易破裂出血，游離時(shí)需謹(jǐn)慎。將游離的ECA結(jié)扎，結(jié)扎處盡可能靠近三岔口處，以防止插魚線時(shí)魚線進(jìn)入ECA。之后用1動(dòng)脈夾夾閉ICA，再用另一動(dòng)脈夾夾閉CCA近心端，然后結(jié)扎CCA。在CCA上用眼科剪剪一小口，將魚線插入到ICA后松開ICA上的動(dòng)脈夾，繼續(xù)將魚線插入，直至達(dá)到MCA。結(jié)扎ICA，完成手術(shù)。

5 術(shù)后護(hù)理（Postoperative Care）

術(shù)后大鼠放于裝有干凈墊料的鼠籠，取側(cè)臥位，并用墊料蓋住大鼠身體及創(chuàng)口，有條件的也可在鼠籠中墊雙層干燥的棉布，再用干燥手術(shù)鋪巾蓋于大鼠上，在鼠籠內(nèi)放一些飼料，飲用水為1%蔗糖水，并使動(dòng)物房保持在26℃。待大鼠完全清醒后開始做神經(jīng)功能評(píng)分。另外，為了防止術(shù)后感染，檢測(cè)指標(biāo)與炎癥無關(guān)時(shí)可考慮術(shù)后前3 d每天腹腔注射青霉素，按4萬U/只大鼠。

6 模型評(píng)價(jià)（Model Evaluation）

模型評(píng)價(jià)方法有多種，如神經(jīng)功能損傷行為學(xué)評(píng)價(jià)、腦組織干濕重、腦組織TTC染色、HE染色和CT灌注掃描等。其中腦組織干濕重和腦組織TTC染色能較直觀地了解大鼠腦缺血情況，但需要一定的儀器設(shè)備和試劑，花費(fèi)大，且需要處死大鼠，增加實(shí)驗(yàn)大鼠數(shù)量；CT灌注掃描是近年來隨著影像學(xué)的發(fā)展而出現(xiàn)的，CT灌注掃描對(duì)梗死模型進(jìn)行篩選可進(jìn)一步降低由模型變異引起的實(shí)驗(yàn)誤差，為實(shí)驗(yàn)研究提供實(shí)時(shí)可靠信息[15-16]。但該方法實(shí)驗(yàn)儀器要求更高，花費(fèi)更大，不適合普通實(shí)驗(yàn)研究。神經(jīng)功能損傷行為學(xué)評(píng)價(jià)常用的方法有姿勢(shì)反射實(shí)驗(yàn)、走木條實(shí)驗(yàn)、肢體放置實(shí)驗(yàn)及抓握-牽拉實(shí)驗(yàn)[17]。其中姿勢(shì)反射實(shí)驗(yàn)最為常用[18]。姿勢(shì)反射實(shí)驗(yàn)主要用于評(píng)估永久性或暫時(shí)性MCAO模型中的皮質(zhì)梗死，評(píng)估對(duì)側(cè)肢體感覺運(yùn)動(dòng)及行為能力。目前多用Bederson方法或其改良方法。

本實(shí)驗(yàn)室在長期的實(shí)驗(yàn)觀察中發(fā)現(xiàn)，Bederson方法及其改良方法并不適用于長期的神經(jīng)功能損傷評(píng)估，尤其是在術(shù)后2周后很難判斷大鼠功能損傷分?jǐn)?shù)。因此，在使用神經(jīng)功能損傷評(píng)分時(shí)，在Bederson評(píng)分法的基礎(chǔ)上，加用了Ayelet Levy評(píng)分法[19]。術(shù)后大鼠清醒后將進(jìn)行Bederson評(píng)分，將分?jǐn)?shù)為0分和4分的大鼠剔除掉；Ayelet Levy評(píng)分則用于評(píng)估大鼠在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)功能恢復(fù)情況。

7 總結(jié)（Summary）

總之，MCAO腦缺血模型制作需注意以下幾點(diǎn):（1）大鼠體質(zhì)量應(yīng)在260～300 g之間；（2）麻醉藥物可選擇10%水合氯醛，現(xiàn)配現(xiàn)用，麻醉量應(yīng)在0.35 mL/100 g的基礎(chǔ)上加減0.1 mL效果最佳；（3）手術(shù)操作規(guī)范化，注意術(shù)中血管分離方法及魚線插入深度；（4）注意術(shù)后大鼠護(hù)理；（5）選擇合理的模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，尤其是神經(jīng)功能損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。這樣制作的模型更加穩(wěn)定、可靠和重復(fù)性高，使實(shí)驗(yàn)更具有可比性、可重復(fù)性。

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（本文編輯 匡靜之）

Experience and improvement of preparation of the cerebral ischemia model by string-fastenings method for middle cerebral artery occlusion

LU Ying1,CAI Guangχian2,TAN Hu2,DENG Shuhua1,YI Jian2,LIU Boyan3
(1.2011 Class of master degree candidate,Hunan University of CM, Changsha,Hunan 410208,China；
2.Key Laboratory of Ministry of Education,First Affiliated Hospital,Hunan University of CM, Changsha,Hunan 410007,China；
3.Yiyang Medical College,Yiyang,Hunan 413000,China)

The most common method for establishment of animal model of focal cerebral ischemia isthestring-fasteningsmethod formiddle cerebralartery occlusion,butthere are severaldefectsforthe method such asdemanding technics,marked differencesin model animals,high mortality.Therefore,establishing a stable,reliable,and reproducible animal model of focal cerebral ischemia has become an urgent problem.The choice of animal,anesthetic drugs and bolt lines,surgical procedures and postoperative care are discussed in this article in order to improve the success rate of focal cerebral ischemia model by the suture of middle cerebral artery.

the string-fastenings method for middle cerebral artery occlusion;cerebral ischemia;model rat

R743；Q95-33

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.01.002.006.04

2013－10－30

國家自然科學(xué)基金（81072939，81273989）；湖南省高校創(chuàng)新平臺(tái)開放基金（09K056，10K048，12K089）。

盧 英，女，在讀碩士研究生，主要從事中醫(yī)藥防治腦血管病研究。

*蔡光先，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail:lby1203@sina.com。