徐華榮，郭 楊，趙志東，李 托，張智英，王 昕

（西北農(nóng)林科技大學動物科技學院陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學重點實驗室，陜西楊凌712100）

羊絨是由絨山羊次級毛囊產(chǎn)生的底層毛，其生長是一個周期性變化的過程，包括生長期、退行期和休止期［1］。羊絨品質(zhì)與角蛋白的組成相關(guān)，并受角蛋白基因表達的影響。角蛋白基因的表達差異導致不同品種絨山羊的羊絨品質(zhì)存在明顯差異［2］。在絨山羊中存在大量激活和抑制參與皮膚毛囊周期性生長的調(diào)控因子［3］，其中KAP基因家族角蛋白相關(guān)蛋白9.2（KAP9.2）基因在絨山羊皮膚組織中特異性表達，在奶山羊皮膚組織中不表達［4－5］。為進一步研究羊絨周期性生長過程中KAP9.2基因的功能，需構(gòu)建KAP9.2過表達載體。但是在真核細胞中通常直接轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的效率很低，達不到研究基因功能的目的。本研究以陜北白絨山羊為研究對象，旨在構(gòu)建KAP9.2基因的重組腺病毒載體，并包裝擴增KAP9.2重組腺病毒，為在細胞水平上研究KAP9.2基因功能提供材料和奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 質(zhì)粒與菌體 HEK293人胚腎細胞、NIH3T3細胞、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BJ5183、試驗用質(zhì)粒pAdTrack－CMV和pAdEasy－1均由西北農(nóng)林科技大學動物基因組學實驗室保存。

1.1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶和T4DNA ligase購自DNA ligaseDNA ligaseNEB公司；Taq DNA聚合酶和核酸共沉劑購自TaKaRa公司；質(zhì)粒DNA提取試劑盒購自O(shè)MEGA BIO－TEK公司；DNA凝膠回收試劑盒購自威格拉斯生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自Sigma公司；血清FBS購自Gibco公司；化學試劑為分析純，購自Sigma公司。

1.2 方 法

1.2.1 pAdTrack－KAP9.2腺病毒穿梭載體的構(gòu)建及鑒定 外科手術(shù)法采集陜北白絨山羊肩胛后緣1×2cm2皮膚組織，干冰保存帶回實驗室，－80℃冰箱保存。采用酚／氯仿法提取陜北白絨山羊皮膚組織DNA。根據(jù)GenBank中山羊KAP9.2基因（GenBank登錄號：AY510124）mRNA序列，利用Clone ManagerV7軟件，設(shè)計KAP9.2基因的特異性擴增引物，由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成，上游引物Primer F：5＇－GGAAGATCTTGAGAAAC TCAGCTCTGAGC－3＇下游引物Primer R5＇－ACGCGTCGACGTTCTATGACAGGAGGATCA－3＇。PCR擴增KAP9.2基因。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，通過DNA凝膠回收試劑盒進行純化回收。使用Sal I－HF、Bgl II雙酶切回收產(chǎn)物和pAdTrack－CMV載體。連接KAP9.2目的基因和pAdTrack－CMV骨架載體，T4DNA ligase 0.5μL，10×T4DNA ligase Buffer 1.0μL，ddH2O 3.5μL同時設(shè)一組空白對照，16℃連接過夜。取5μL連接產(chǎn)物加入至100μL感受態(tài)DH5α中，在含有卡那霉素的LB瓊脂平板上培養(yǎng)過夜。采用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，Sal I－HF和Bgl II雙酶切鑒定。選擇兩個酶切鑒定結(jié)果正確的質(zhì)粒送南京金斯瑞生物科技有限公司測序，測序結(jié)果與NCBI公布的KAP9.2序列進行比對。

1.2.2 pAdEasy－KAP9.2重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定 使用Pme I線性化測序結(jié)果正確的pAdTrack－KAP9.2。試驗組取5μL回收產(chǎn)物及1 μL pAdEasy－1共轉(zhuǎn)至100μL感受態(tài)BJ5183中，對照組只加5μL回收產(chǎn)物，在含有卡那霉素的LB瓊脂平板上培養(yǎng)過夜。挑取試驗組平板上5個克隆，提取質(zhì)粒。使用Pac I酶切鑒定pAdEasy－KAP9.2重組質(zhì)粒。稀釋酶切鑒定結(jié)果正確的質(zhì)粒為模板，PCR擴增KAP9.2基因，擴增鑒定正確的質(zhì)粒。

1.2.3 重組KAP9.2腺病毒載體線性化病毒包裝及擴增 Pac I線性化重組腺病毒載體pAdEasy－KAP9.2。設(shè)置5個反應體系，37℃充分反應5h。核酸共沉劑濃縮回收。將回收的線性化產(chǎn)物轉(zhuǎn)染狀態(tài)良好、融合度70%的HEK293細胞。轉(zhuǎn)染操作按梭華－SofastTM基因轉(zhuǎn)染試劑手冊進行。參考AdEsayTM系統(tǒng)［20］所示的方法擴增腺病毒，以達到后續(xù)試驗所需病毒量。

1.2.4 重組KAP9.2腺病毒滴度測定 采用LaSRT法［6－7］測定KAP9.2腺病毒滴度。

2 結(jié)果與分析

2.1 pAdTrack－KAP9.2穿梭載體的鑒定

以陜北絨山羊基因組為模板，PCR擴增獲得KAP9.2基因全長CDS，瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶為670bp左右（圖1），與預期結(jié)果一致；將該片段用Sal I－HF和Bgl II酶切后與同樣內(nèi)切酶切割的骨架載體pAdTrack進行連接，獲得穿梭載體pAdTrack－KAP9.2；Sal I－HF和Bgl II雙酶切檢測載體時，獲得了長度約為9100bp骨架載體和658bp的KAP9.2片段（圖2），與預期結(jié)果一致，說明pAdTrack－KAP9.2穿梭載體構(gòu)建成功。將pAdTrack－KAP9.2載體測序，發(fā)現(xiàn)與NCBI中的序列完全匹配，表明pAdTrack－KAP9.2穿梭載體可用于后續(xù)的試驗研究。

圖1 PCR擴增KAP9.2基因M.DL2000DNA Marker；1.回收KAP9.2PCR產(chǎn)物Fig.1 KAP9.2amplified by PCRM.DL2000DNA Marker；1.Gel purification of KAP9.2

2.2 pAdEasy－KAP9.2腺病毒載體的鑒定

使用Pac I酶切鑒定由線性化pAdTrack－KAP9.2與pAdEasy－1重組得到的pAdEasy－KAP9.2質(zhì)粒，可以得到36 701bp和2 897bp的兩個片段（圖3）。以pAdEasy－KAP9.2質(zhì)粒為模板，用擴增KAP9.2基因引物進行PCR檢測，獲得目的片段約為670bp（圖4），說明pAdEasy－KAP 9.2質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 pAdTrack－KAP9.2 Sal I－HF、Bgl II酶切鑒定M.DL2000DNA Marker；1－3.pAdTrack－KAP9.2酶切產(chǎn)物Fig.2 Identification of pAdTrack－KAP9.2vectorM.DL2000DNA Marker；1－3.pAdTrack－KAP9.2 double digested by Sal I－HF and Bgl II

2.3 重組KAP9.2腺病毒載體的線性化、病毒包裝、擴增及滴度測定

pAdEasy－KAP9.2腺病毒載體經(jīng)Pac I線性化后，轉(zhuǎn)染HEK 293細胞，轉(zhuǎn)染后第3d在熒光顯微鏡下可以觀察到有綠色熒光蛋白表達，培養(yǎng)到7d時，接近90%的細胞發(fā)出熒光，此時收集的病毒即為第1代病毒液，再反復感染3代后得到病毒滴度為1.34×108GFU／mL的病毒（圖5）。

圖3 pAdEasy－KAP9.2的酶切鑒定M.λ－HindⅢDNA Marker；1.pAdEasy－KAP9.2使用Pac I酶切線性化后產(chǎn)物Fig.3 Identification of pAdEasy－KAP9.2M.λ－HindⅢDNA Marker；1.pAdEasy－KAP9.2 digested with PacI

圖4 pAdEasy－KAP9.2的PCR鑒定M.DL2000DNA Marker；1.pAdEasy－KAP9.2為模板，PCR擴增KAP9.2基因產(chǎn)物Fig.4 Identification of pAdEasy－KAP9.2by PCRM.DL2000DNA Marker；1.Amplification KAP9.2 from pAdEasy－KAP9.2

圖5 腺病毒原液分別稀釋103（A）、104（B）、105（C）、106（D）倍后轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞48h后綠色熒光的表達Fig.5 Fluorescence microscopic image of NIH3T3transfected by virus diluted by 103（A），104（B），105（C），106（D）times respectively after 48hours

3 討 論

KAP9.2基因是超高硫（USH）KAPs基因家族中一員，USH角蛋白相關(guān)蛋白在毛囊角質(zhì)層和皮質(zhì)層均表達［8］。KAP基因家族通過KAP－KAP、KP－KAP、KP－KP相互作用或受其他基因的調(diào)控進而對絨毛品質(zhì)具有重要的影響［9－11］。對陜北白絨山羊和內(nèi)蒙古白絨山羊KAP6.2基因的研究中發(fā)現(xiàn)，該基因在陜北白絨山羊上存在24bp的缺失突變，但是在內(nèi)蒙古白絨山羊上卻沒有出現(xiàn)，提示該基因的缺失突變可能是導致陜北白絨山羊羊絨多型性的直接原因［11］。研究發(fā)現(xiàn)陜北白絨山羊中KAP9.2基因同樣出現(xiàn)了30bp的缺失［13］。有報道發(fā)現(xiàn)KAP7.1基因與KAP8.2基因在絨山羊心、肝、肺、脾、腎組織中不表達，僅在皮膚組織中表達［14］。我們發(fā)現(xiàn)KAP9.2基因同樣僅在絨山羊皮膚組織中表達，在奶山羊中則沒有檢測到其表達 說明KAP9.2基因的表達具有品種特異性。本課題組研究發(fā)現(xiàn)KAP9.2基因?qū)ρ蚪q的生長可能具有抑制作用［15］，同時報道了關(guān)于KAP9.2的多態(tài)性研究，發(fā)現(xiàn)在KAP9.2基因586位點存在C／T單核苷酸多態(tài)性，而CC基因型的KAP9.2基因相對表達量低于TT基因型，說明該位點C堿基可能成為潛在篩選培育高產(chǎn)絨的絨山羊的參考標準［5］。但是，目前關(guān)于KAP9.2基因如何調(diào)控毛囊細胞生長發(fā)育的機制尚未見報道。因此，為了進一步研究羊絨周期性生長過程中KAP9.2基因的功能，需要構(gòu)建KAP9.2過表達載體。

本試驗選擇腺病毒系統(tǒng)來構(gòu)建KAP9.2過表達載體，是考慮到相對于其它轉(zhuǎn)染媒介腺病毒具有高感染效率，既可以感染非分裂期細胞，也可以感染分裂期細胞，同時屬于瞬時感染，不存在基因整合風險，低細胞毒性，減少病毒蛋白表達引起的細胞自身免疫反應，相對于慢病毒其安全性更好，是一種理想的媒介［16］。Mizuguchi等［17］在1998年為優(yōu)化傳統(tǒng)腺病毒重組系統(tǒng)而構(gòu)建了AdEasyTM系統(tǒng)，采用該系統(tǒng)僅需兩步就可以獲得重組腺病毒［18－21］。本研究采用該系統(tǒng)順利完成了整個KAP9.2重組腺病毒包裝試驗。病毒滴度測定采用了由江千里等建立的“批量快速病毒滴度測定法（LaSRT）”［6－7］，該方法簡單實用，能夠?qū)崿F(xiàn)快速準確計算出病毒滴度。總之，為研究KAP9.2基因在羊絨周期性生長中的功能，我們以陜北白絨山羊為研究對象，提取皮膚基因組，設(shè)計引物擴增KAP9.2基因，構(gòu)建重組腺病毒載體并包裝擴增KAP9.2重組腺病毒，獲得了1.34× 108GFU／mL高滴度的病毒顆粒，為在細胞水平研究KAP9.2基因功能提供了支持材料。

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