曹海鵬溫樂夫楊移斌石婷婷何 珊

(1. 上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心, 上海高校知識服務(wù)平臺上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動物遺傳育種中心(ZF1206), 上海 201306; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所, 武漢 430000)

克氏原螯蝦源致病性豚鼠氣單胞菌的分離及其生物學(xué)特性

曹海鵬1溫樂夫1楊移斌2石婷婷1何 珊1

(1. 上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心, 上海高校知識服務(wù)平臺上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動物遺傳育種中心(ZF1206), 上海 201306; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所, 武漢 430000)

從患病的克氏原螯蝦體內(nèi)分離到一株致病菌L2M-A, 經(jīng)生理生化鑒定和16S rDNA序列分析, 證實(shí)菌株L2M-A為豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae) (GenBank登錄號: KF446251), 其16S rDNA序列與基因庫中氣單胞菌屬菌株的16S rDNA序列有99%—100%的同源性, 而且與豚鼠氣單胞菌JXZ-3株(GenBank登錄號: JF496552)的親緣關(guān)系最近。此外, 菌株L2M-A在pH5—9內(nèi)均能夠生長良好, 最適生長溫度為30 , ℃ 最適生長轉(zhuǎn)速為200 r/min, 但濃度≥6.25 μg/mL的雙氟沙星對其生長具有顯著的抑制作用, 可作為防治用藥的依據(jù)。

豚鼠氣單胞菌; 鑒定; 生物學(xué)特性; 克氏原螯蝦

克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值, 是我國重要的水產(chǎn)資源, 在全國各地, 尤其是長三角地區(qū)備受廣大消費(fèi)者青睞。據(jù)統(tǒng)計(jì), 全國對克氏原螯蝦的年消費(fèi)量高達(dá)幾萬噸, 具有十分廣闊的養(yǎng)殖前景。自20世紀(jì)90年代克氏原螯蝦人工養(yǎng)殖在江蘇等地首次獲得成功后, 安徽、江蘇、湖北、江西、河南、浙江、湖南、天津、山東、四川、廣東、福建、貴州、重慶、廣西、陜西等省市均不同程度地開展了克氏原螯蝦的養(yǎng)殖[1]。與此同時(shí), 病害的暴發(fā)也給克氏原螯蝦的養(yǎng)殖造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。其中, 嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌是克氏原螯蝦的重要病原菌[2—4], 曾引起克氏原螯蝦發(fā)生大規(guī)模死亡, 但從現(xiàn)有資料來看, 未見豚鼠氣單胞菌引起克氏原螯蝦發(fā)病的報(bào)道。2008年5月初,上海天億克氏原螯蝦養(yǎng)殖基地養(yǎng)殖克氏原螯蝦出現(xiàn)暴發(fā)性死亡, 十幾天克氏原螯蝦的死亡量高達(dá)近2000 kg。其主要病癥為: 患病克氏原螯蝦全身發(fā)紅,嚴(yán)重者頭胸部充滿積液, 肝胰腺腐爛。本實(shí)驗(yàn)從自然發(fā)病的克氏原螯蝦體內(nèi)分離到一株致病菌L2M-A,經(jīng)生理生化鑒定和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析, 證實(shí)菌株L2M-A為豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae), 并進(jìn)一步對其生長特性進(jìn)行了研究, 以期為克氏原螯蝦源豚鼠氣單胞菌的病原學(xué)研究提供理論資料。

1 材料與方法

1.1 病蝦來源

患病克氏原螯蝦, 體長約為(5—7) cm, 取自上海天億克氏原螯蝦養(yǎng)殖基地。

1.2 致病菌的分離

用 75%酒精對具有典型發(fā)病癥狀的瀕死克氏原螯蝦進(jìn)行體表消毒, 然后在無菌條件下取其肝胰腺、肌肉等組織以及頭胸部的積液, 分別在TCBS和普通營養(yǎng)瓊脂平板上進(jìn)行致病菌株的分離, 并將平板在30℃恒溫培養(yǎng)18—24h后進(jìn)行菌株的純化, 在斜面瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 人工回歸感染實(shí)驗(yàn)

選取健康的克氏原螯蝦進(jìn)行人工回歸感染實(shí)驗(yàn)。先將培養(yǎng)基瓊脂斜面上的各菌株的菌苔分別用無菌生理鹽水洗下, 經(jīng)稀釋涂布平板法測定濃度后再用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)各菌懸液濃度為1.0×107cfu/mL。分別在健康克氏原螯蝦第二、三腹節(jié)的基部注射各菌懸液, 每尾克氏原螯蝦注射 0.1 mL, 對照克氏原螯蝦注射等體積的無菌生理鹽水。連續(xù)6d計(jì)算實(shí)驗(yàn)蝦的死亡數(shù)量, 觀察實(shí)驗(yàn)蝦的發(fā)病癥狀, 在及時(shí)撈出死蝦的同時(shí)解剖檢查其病變情況, 同時(shí)對發(fā)病瀕死的實(shí)驗(yàn)蝦進(jìn)行致病菌再分離。每組實(shí)驗(yàn)克氏原螯蝦各10尾, 水溫為(22—25)℃。

1.4 致病菌的鑒定

生理生化鑒定 參照王會聰?shù)萚5]采用的 API ID32GN細(xì)菌鑒定系統(tǒng)進(jìn)行。

分子鑒定 以致病菌株的基因組 DNA為模板, 選用正向引物 27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3′)和反向引物 1492R(5′-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3′)對其16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR的擴(kuò)增條件為: 94℃ 3min; 94℃ 1min, 60℃ 1min, 72℃1min, 共35個(gè)循環(huán); 72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物的純化與測序委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。通過美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站中的BLASTn軟件, 將致病菌株的16S rDNA序列與GenBank基因庫中已知細(xì)菌的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較后, 進(jìn)一步通過軟件Mega 4.0對同源性較高的 16S rDNA序列進(jìn)行多重比較, 并利用鄰接法構(gòu)建致病菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 致病菌生長特性的測定

致病菌株液體菌種的制備 將致病菌株接種到斜面培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)18h后接種到pH7的100 mL無菌營養(yǎng)肉湯中, 于30℃、200 r/min條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)18h后即為液體菌種。

生長因子對致病菌生長的影響 取液體菌種1 mL接種到100 mL無菌營養(yǎng)肉湯中, 分別于不同pH (3、5、7、9、11)、溫度(20℃、25℃、30℃、35℃、40 )℃、轉(zhuǎn)速(100、150、200、250、300 r/min)條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng) 18h后取樣, 測定各條件下致病菌株的A560值[6]。以各生長因子為橫坐標(biāo)、A560值為縱坐標(biāo)繪制曲線。

雙氟沙星對致病菌生長的影響 取液體菌種1 mL分別接種到含雙氟沙星0、6.5、12.5、25、50、100 μg/mL的 100 mL pH5的無菌營養(yǎng)肉湯中, 于30℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)18h后取樣, 測定各雙氟沙星濃度下致病菌株的 A560值[6]。以雙氟沙星濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)、A560值為縱坐標(biāo)繪制曲線。

致病菌生長曲線的測定 將液體菌種 1 mL接種到100 mL pH5的無菌營養(yǎng)肉湯中, 于30℃、200 r/min條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng), 分別在0、0.5h、1.5h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h、48h分別取樣測定致病菌株的A560值[6]。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、A560值為縱坐標(biāo), 繪制致病菌株的生長曲線。

2 結(jié)果

表1 分離菌株對克氏原螯蝦人工回歸感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab. 1 Results of artificial infection test of the isolated bacteria

2.1 致病菌的分離

從自然發(fā)病克氏原螯蝦的肝胰腺、肌肉、積液中分別分離純化到2株、3株、1株優(yōu)勢細(xì)菌, 分別暫名為L1L-A、L3L-T、L2M-A、L3M-A、L3M-T、L2A-A。其中菌株 L1L-A、L2M-A、L3M-A、L2A-A在普通營養(yǎng)瓊脂平板上均形成以淡黃色、圓形、中央隆起、邊緣整齊、表面光滑濕潤為特征的的菌落;菌株L3L-T、L3M-T在TCBS平板上均形成以黃色、圓形、中央隆起、邊緣整齊、表面光滑濕潤為特征的菌落。人工回歸感染試驗(yàn)結(jié)果表明(表 1), 菌株L2M-A對克氏原螯蝦有致病作用, 實(shí)驗(yàn)克氏原螯蝦的發(fā)病與死亡癥狀與自然病癥基本相同, 而且從人工感染的克氏原螯蝦的體內(nèi)又可分離到與原菌株形態(tài)特征、理化性質(zhì)一致的菌株, 表明菌株L2M-A是引起該病的致病菌。

2.2 致病菌的鑒定

菌株 L2M-A的生理生化鑒定結(jié)果表明(表 2),菌株L2M-A為豚鼠氣單胞菌, 鑒定率為99.9%。此外,通過PCR擴(kuò)增, 獲得了菌株L2M-A長度為1400 bp的16S rDNA 序列, 其在 GenBank上的登錄號為: KF446251。通過BLASTn軟件對菌株L2M-A的16S rDNA序列的同源性分析結(jié)果表明, 菌株L2M-A的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中氣單胞菌屬菌株的16S rDNA序列有99%—100%的同源性, 菌株L2M-A的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果(圖1)進(jìn)一步表明, 菌株L2M-A與豚鼠氣單胞菌JXZ-3株(GenBank登錄號: JF496552)的親緣關(guān)系最近。結(jié)合生理生化及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果, 菌株L2M-A為豚鼠氣單胞菌。

表2 API ID32GN細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定的菌株L2M-A的生理生化特征Tab. 2 Physiological and biological characteristics of strain L2M-A by API ID32GN bacterial identification

圖1 通過鄰接法構(gòu)建的基于菌株L2M-A及相關(guān)菌株 16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 The constructed phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of strain L2M-A and other related strains by neighborjoining method

2.3 致病菌的生長特性

pH對致病菌生長的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖 2), 豚鼠氣單胞菌 L2M-A在 pH5—9范圍內(nèi)均能夠生長良好, 其中豚鼠氣單胞菌 L2M-A的最適生長pH5。當(dāng)培養(yǎng)基在初始pH3時(shí), 豚鼠氣單胞菌L2M-A培養(yǎng)液的A560值最低, 豚鼠氣單胞菌L2M-A基本不生長; 隨著培養(yǎng)基pH的升高, 豚鼠氣單胞菌L2M-A培養(yǎng)液的A560值急劇增加, 當(dāng)培養(yǎng)基在初始pH5時(shí)達(dá)到最大值; 當(dāng)培養(yǎng)基在初始pH大于5時(shí), 豚鼠氣單胞菌L2M-A培養(yǎng)液的A560值逐漸緩慢降低, 當(dāng)培養(yǎng)基在初始pH大于9時(shí), 豚鼠氣單胞菌L2M-A培養(yǎng)液的 A560值急劇下降, 當(dāng)培養(yǎng)基在初始 pH11時(shí),豚鼠氣單胞菌L2M-A培養(yǎng)液的A560值僅為pH5時(shí)的40.84%。

溫度對致病菌生長的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖3), 豚鼠氣單胞菌L2M-A在溫度(20—40)℃范圍內(nèi)均能生長, 其中豚鼠氣單胞菌L2M-A的最適生長溫度為 30℃。在(20—30)℃范圍內(nèi), 隨著溫度的升高, 豚鼠氣單胞菌L2M-A培養(yǎng)液的A560值逐漸增大,當(dāng)培養(yǎng)溫度大于30℃時(shí), 豚鼠氣單胞菌L2M-A培養(yǎng)液的A560值逐漸降低, 豚鼠氣單胞菌L2M-A在培養(yǎng)溫度為 40℃時(shí)的培養(yǎng)液 A560值僅為 30℃時(shí)的65.02%。

圖2 pH對菌株L2M-A生長的影響Fig. 2 Effect of pH on the growth of strain L2M-A

圖3 溫度對菌株L2M-A生長的影響Fig. 3 Effect of temperature on the growth of strain L2M-A

轉(zhuǎn)速對致病菌生長的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖4),豚鼠氣單胞菌L2M-A的最適生長轉(zhuǎn)速為200 r/min。在(100—200) r/min范圍內(nèi), 隨著轉(zhuǎn)速的升高, 豚鼠氣單胞菌 L2M-A 培養(yǎng)液的 A560值急劇增大, 在200 r/min時(shí)達(dá)到最大值; 當(dāng)轉(zhuǎn)速大于200 r/min時(shí),豚鼠氣單胞菌L2M-A培養(yǎng)液的A560值急劇下降, 當(dāng)轉(zhuǎn)速為300 r/min時(shí), 豚鼠氣單胞菌L2M-A培養(yǎng)液的A560值僅為200 r/min時(shí)的27.05%。

雙氟沙星對致病菌生長的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖 5), 豚鼠氣單胞菌 L2M-A在雙氟沙星濃度(0—100) μg/mL范圍內(nèi)均能夠生長, 但隨著雙氟沙星濃度的增加, 其培養(yǎng)液的 A560值逐漸降低。當(dāng)培養(yǎng)基中雙氟沙星濃度范圍為(0—6.25) μg/mL時(shí), 豚鼠氣單胞菌L2M-A培養(yǎng)液的A560值隨著雙氟沙星濃度的增加急劇下降; 而當(dāng)培養(yǎng)基中雙氟沙星濃度范圍為(6.25—100) μg/mL時(shí), 豚鼠氣單胞菌L2M-A生長速度趨于平緩, 雙氟沙星濃度為100 μg/mL時(shí)豚鼠氣單胞菌L2M-A培養(yǎng)液的A560值相當(dāng)于雙氟沙星濃度為6.25 μg/mL時(shí)的32.13%。

致病菌的生長曲線 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖 6), 0—1.5h為生長延遲期, 1.5—24h為對數(shù)生長期, 24—36h為穩(wěn)定期, 36h以后為衰亡期。

圖4 轉(zhuǎn)速對菌株L2M-A生長的影響Fig. 4 Effect of rotate speed on the growth of strain L2M-A

圖5 雙氟沙星對菌株L2M-A生長的影響Fig. 5 Effect of difloxacin on the growth of strain L2M-A

圖6 菌株L2M-A的生長曲線Fig. 6 The growth curve of strain L2M-A

3 討論

豚鼠氣單胞菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖動物常見致病菌, 可危害中華鱉(Triongx sinensis)、豐產(chǎn)鯽［Carassius auratus of Penze (♀) ×Cyprinus acutidorsalis (♂)］、鯉(Cyprinus carpio L.)、日本鰻鱺(Anguilla japonica)、南方鲇(Silurus meriordinalis Chen)、胡子鯰(Clarias fuscus)、雜交鱘(［Huso huso (♀)× Acipenser ruthenus (♂)］、中國對蝦(Penaeus chinensis)、中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)等多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物[6—14]。因此, 豚鼠氣單胞菌引起的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病應(yīng)予以重視。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)豚鼠氣單胞菌對克氏原螯蝦具有致病性, 并分析了克氏原螯蝦源豚鼠氣單胞菌的生長特性, 不僅進(jìn)一步證實(shí)了豚鼠氣單胞菌危害的廣泛性, 而且也豐富了豚鼠氣單胞菌的病原學(xué)研究資料。

豚鼠氣單胞菌的生化特性具有菌株差異性。本實(shí)驗(yàn)分離的豚鼠氣單胞菌L2M-A與李小波等報(bào)道的鯽源豚鼠氣單胞菌CSS-4-2對肌醇和麥芽糖的生化反應(yīng)結(jié)果不同[8], 與徐海圣等報(bào)道的蟹源豚鼠氣單胞菌816X1和816X2對水楊素的生化反應(yīng)結(jié)果也不同[14]。出現(xiàn)這些差異, 可能與菌株在地區(qū)、氣候、水質(zhì)條件及實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件等方面的差異有關(guān)[8]。

豚鼠氣單胞菌不同菌株的生長特性不盡相同。安利國等研究表明, 鯉源豚鼠氣單胞菌RXY-1的最適生長溫度為(25—30) , ℃ 最適生長 pH6—8[9]; 曹海鵬等研究表明, 鱘細(xì)菌性敗血綜合征致病性豚鼠氣單胞菌 XL2-T的最適生長溫度為(25—30) , ℃ 最適生長 pH7[6]。本實(shí)驗(yàn)分離的豚鼠氣單胞菌 L2M-A的最適生長溫度和pH分別為30℃和5, 其最適生長溫度與豚鼠氣單胞菌 RXY-1、XL2-T基本一致, 但最適生長pH與豚鼠氣單胞菌RXY-1、XL2-T有所不同, 這可能與菌株差異有關(guān)。

近年來, 病原菌對水產(chǎn)養(yǎng)殖中允許使用的抗菌藥物產(chǎn)生的耐藥性日益增強(qiáng)[15], 因而迫切需要尋找更多在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有潛在應(yīng)用價(jià)值的新型抗菌藥物。雙氟沙星為第三代氟喹諾酮類抗菌藥物, 因其具有良好的抗菌效果且與其他抗菌藥物無交叉耐藥性而有望被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物細(xì)菌性疾病的防治[16]。目前, 我國已經(jīng)開展了雙氟沙星在異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)、中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究[17,18], 為雙氟沙星在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的安全應(yīng)用技術(shù)開發(fā)提供了科學(xué)的理論依據(jù)。然而, 國內(nèi)學(xué)者關(guān)于雙氟沙星對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病原菌抑菌效果研究卻鮮有報(bào)道, 因而本實(shí)驗(yàn)觀察了不同濃度的雙氟沙星對克氏原螯蝦源豚鼠氣單胞菌L2M-A的生長抑制作用, 以彌補(bǔ)雙氟沙星應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害防治基礎(chǔ)理論研究的不足。目前, Cao等測定了雙氟沙星對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病原性嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度, 發(fā)現(xiàn)雙氟沙星對5株嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度范圍為0.83—4.0 μg/mL[19]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也表明, 濃度≥6.25 μg/mL的雙氟沙星對克氏原螯蝦源豚鼠氣單胞菌L2M-A的生長也具有顯著的抑制效果。這些研究均為雙氟沙星在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害防治應(yīng)用中的開發(fā)奠定了科學(xué)依據(jù)。

[1] Huang Y, Dai Y G, Hu C Y, et al. Current state and development strategy of Procambarus clarkii industry [J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2011, 1: 274—277 [黃羽, 戴銀根, 胡成鈺, 等. 克氏原螯蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及可持續(xù)發(fā)展對策. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 1: 274—277]

[2] Ma X R, Xue H, Tang J Q. Isolation, identification and drug susceptibility of pathogenic Aeromonas hydrophila from Procambarus clarkii [J]. Journal of Aquaculture, 2012, 8: 45—47 [馬小榮, 薛暉, 唐建清. 克氏原螯蝦致病性嗜水氣單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn). 水產(chǎn)養(yǎng)殖, 2012, 8: 45—47]

[3] Zhou D R, Zhang W M, Li J Y, et al. Isolation and identification of bacterial pathogen from Procambarus clarkii [J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2011, 27(26): 102—105 [周冬仁, 章文敏, 李健應(yīng), 等. 克氏原螯蝦細(xì)菌性病原的分離與鑒定. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2011, 27(26): 102—105]

[4] Chen C F, Liu Y G, He G W, et al. The bacterial pathogen of outbreak disease in Procambarus clarkii [J]. Journal of Huazhong Agricultural University, 2009, 28(2): 193—198 [陳昌福, 劉遠(yuǎn)高, 何廣文, 等. 克氏原螯蝦暴發(fā)病細(xì)菌性病原的研究. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 28(2): 193—198]

[5] Wang H C, Cao H P, He S, et al. Identification and removal condition of a nitrite removing bacterium from aquaculture sediment [J]. Microbiology China, 2012, 39(2): 154—161 [王會聰, 曹海鵬, 何珊, 等. 一株養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽去除菌的鑒定及其去除條件. 微生物學(xué)通報(bào), 2012, 39(2): 154—161]

[6] Cao H P, Yang X L, Wang Y J, et al. Isolation and growth characteristics of pathogenic Aeromonas punctata caviae from sturgeons [J]. Chinese Journal of Zoology, 2007, 42(6): 1—6 [曹海鵬, 楊先樂, 王玉潔, 等. 鱘源致病性豚鼠氣單胞菌的分離及其生長特性. 動物學(xué)雜志, 2007, 42(6): 1—6]

[7] Yu X P, Ma Y Z. Study on the pathogen of a chronic infectious disease in cultured Triongx sinensis [J]. Chinese Journal of Veterinary Science, 1997, 17(5): 460—462 [余旭平, 馬有智. 甲魚病原性豚鼠氣單胞菌的分離鑒定. 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào), 1997, 17(5): 460—462]

[8] Li X B, Huang W F. Study on the bacterial septicemia of Carassius auratus of Penze (♀) ×Cyprinus acutidorsalis (♂)Ⅰ— Isolation and identification of the pathogen [J]. Microbiology China, 2003, 30(5): 56—60 [李小波, 黃文芳.豐產(chǎn)鯽細(xì)菌性敗血病的研究Ⅰ—病原分離與鑒定. 微生物學(xué)通報(bào), 2003, 30(5): 56—60]

[9] An L G, Fu R S, Xing W X, et al. Studies on pathogen and vaccine of carp dropsy [J]. Journal of Fisheries of China, 1998, 22(2): 136—142 [安立國, 傅榮恕, 邢維賢, 等. 鯉豎鱗病病原及其疫苗的研究. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 1998, 22(2): 136—142]

[10] Fan H P, Wu B, Zeng Z Z, et al. Isolation and identification of bacteriosis pathogen from Anguilla japonica ulceration of skin and preparation of its monoclonal antibody [J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2009, 16(2): 295—302 [樊海平, 吳斌, 曾占壯, 等. 日本鰻鱺體表潰瘍病病原菌的分離、鑒定及單克隆抗體制備. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2009, 16(2): 295—302]

[11] Ji L L, Wang K Y, Xiao D, et al. Isolation and identification of pathogenic bacteria causing ulcer disease of Silurus meriordinalis Chen [J]. Freshwater Fisheries, 2008, 38(3): 68—72 [吉莉莉, 汪開毓, 肖丹, 等. 南方鲇潰瘍綜合癥病原菌的分離與鑒定. 淡水漁業(yè), 2008, 38(3): 68—72]

[12] Huang W J, Huang J, Qin A Z, et al. Isolation and identification of the pathogen from ascitesosis-infected wild Clarias fuscus [J]. Chinese Journal of Veterinary Science and Technology, 2000, 30(4): 30—33 [黃偉堅(jiān), 黃均, 秦愛珍, 等. 野生胡子鯰“腹水病”病原分離和鑒定. 中國獸醫(yī)科技, 2000, 30(4): 30—33]

[13] Fan H P, Meng Q X, Yu K K. The pathogenicities and biologic characteristics of the pathogens (Aeromonas spp.) caused the septicemia of Penaeus chinensis [J]. Journal of Fisheries of China, 1994, 18(1): 32—38 [樊海平, 孟慶顯,俞開康. 中國對蝦敗血病病原菌(氣單胞菌)的致病性與生物學(xué)性狀. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 1994, 18(1): 32—38]

[14] Xu H S, Huang L F, Wang S X. Isolation and identification of Aeromonas caviae from Eriocheir sinensis [J]. Journal of Zhejiang University (Agriculture & Life Sciences), 2001, 27(6): 677—681 [徐海圣, 黃立峰, 王淑霞. 中華絨螯蟹豚鼠氣單胞菌的分離和鑒定. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版), 2001, 27(6): 677—681]

[15] Li A H. Antibacterial drugs used in aquaculture and drug resistance of fish bacterial pathogens [J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2002, 9(1): 87—91 [李愛華. 水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用的抗菌藥物及細(xì)菌耐藥性. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2002, 9(1): 87—91]

[16] Zhang H X, Cao H P, Ruan J M, et al. Pharmacokinetics of difloxacin in the Aeromonas hydrophila-infected Carassius auratus gibelio [J]. Chinese Journal of Zoology, 2012, 47(6): 72—77 [章海鑫, 曹海鵬, 阮記明, 等. 雙氟沙星在人工感染嗜水氣單胞菌的異育銀鯽體內(nèi)的藥代動力學(xué). 動物學(xué)雜志, 2012, 47(6): 72—77]

[17] Zhang H X, Hu K, Ruan J M, et al. Researches of plasma protein binding rate of difloxacin and its pharmacokinetic in Carassius auratus gibelio [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2013, 37(1): 62—69 [章海鑫, 胡鯤, 阮記明, 等. 異育銀鯽體內(nèi)鹽酸雙氟沙星血漿蛋白結(jié)合率的變化與其藥代動力學(xué)研究. 水生生物學(xué)報(bào), 2013, 37(1): 62—69]

[18] Li H D, Yang X L, Hu K, et al. Pharmacokinetics and the elimination regularity of difloxacin and its metabolite sarafloxacin in Eriocheir sinensis [J]. Chinese Journal of Zoology, 2009, 44(2): 12—20 [李海迪, 楊先樂, 胡鯤, 等.鹽酸雙氟沙星及其代謝產(chǎn)物在中華絨螯蟹體內(nèi)藥物代謝及殘留消除規(guī)律. 動物學(xué)雜志, 2009, 44(2): 12—20]

[19] Cao H, Zhang H, He S, et al. Pharmacokinetics of difloxacin in healthy and aeromonasis-infected gibel carp Carassius auratus gibelio [J]. Israeli Journal of Aquaculture-Bamidgeh, DOI: IJA_65.2013.896

ISOLATION AND BIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF AN AEROMONAS CAVIAE PATHOGEN FROM PROCAMBARUS CLARKII

CAO Hai-Peng1, WEN Le-Fu1, YANG Yi-Bin2, SHI Ting-Ting1and HE Shan1
(1. Key Laboratory of Freshwater Fishery Germplasm Resources, Ministry of Agriculture of China, Shanghai Engineering Research Center of Aquaculture, Shanghai University Knowledge Service Platform, Shanghai Ocean University Aquatic Animal Breeding Center (ZF1206), National Pathogen Collection Center for Aquatic Animals, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Yangtze River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuhan 430000, China)

A pathogenic strain L2M-A was isolated from diseased Procambarus clarkii, and was identified as an Aeromonas caviae strain (GenBank accession No. KF446251) with biochemical and molecular approaches. The 16S rDNA sequence of this strain showed a homology of 99% to 100% with those of Aeromonas strains, and was closest related to that of A. caviae strain JXZ-3 (GenBank accession No: JF496552). We also found that the optimal growth conditions of strain L2M-A were pH5-9, temperature at 30℃, and spinning speed at 200 r/min. The growth of L2M-A could be significantly inhibited by difloxacin at the concentration of ≥6.25 μg/mL. This finding could provide scientific guidance for the disease control.

Aeromonas caviae; Identification; Biological characteristics; Procambarus clarkii

S945.1

A

1000-3207(2014)06-1047-07

10.7541/2014.154

2013-10-06;

2014-03-25

江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(No. BE2013366); 山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(No. 20120311025-4); 上海高校實(shí)驗(yàn)技術(shù)隊(duì)伍建設(shè)計(jì)劃(個(gè)人)項(xiàng)目; 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)類人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)實(shí)訓(xùn)基地(泗洪)項(xiàng)目; 國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目資助

曹海鵬(1981—), 男, 山東招遠(yuǎn)人; 博士, 工程師; 主要從事水產(chǎn)動物病害防治與微生態(tài)制劑的開發(fā)研究。E-mail: hpcao@shou.edu.cn

何珊(1986—), E-mail: s_he@shou.edu.cn