程丹丹，高德民

(山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,山東 濟(jì)南 250355)

有柄石韋[Pyrrosiapetiolosa(Christ) Ching]為水龍骨科(Polypodiaceae)石韋屬(Pyrrosia)植物。具有利尿、通淋、清濕熱之功效。臨床上用于熱淋、血淋、石淋、小便不通，主治肺炎水腫、膀胱炎、泌尿系結(jié)石、尿血、崩漏、肺熱喘咳[1]。石韋的主要活性成分為槲皮素、山奈酚、異槲皮苷、芒果苷等[2]黃酮類物質(zhì)，以及多糖類，萜類等[3]。多糖類是現(xiàn)今研究的熱點(diǎn)，已發(fā)現(xiàn)的100多種具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤[4]、抗病毒、抗感染、降血糖[5]等多種生理活性的中藥多糖，部分已在臨床用于腫瘤、肝炎、心血管等疾病的輔助治療和康復(fù)[6]，其中最重要的藥理作用當(dāng)推免疫促進(jìn)作用，因此多糖的提取備受關(guān)注。但對石韋中多糖的研究，尤其是對石韋多糖的提取，分離、純化及含量測定等方面的研究較少。為此，本研究對有柄石韋中總多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，篩選出最佳的提取條件，提高多糖得率，為有柄石韋的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料、儀器和試劑

1.1 材料

有柄石韋經(jīng)過粉碎用石油醚浸泡過夜，料液比1∶20，加80%乙醇，回流加熱提取4 h,過濾后晾干，儲存?zhèn)溆肹7]。

1.2 儀器與試劑

754PC紫外-可見光分光光度計,上海菁華科技儀器有限公司；RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,菏澤鑫源儀器儀表有限公司；FXB101-1加熱鼓風(fēng)干燥箱、KO-250E醫(yī)用超聲波清洗器,上海樹立儀器代表有限公司；HH-S水浴鍋,濟(jì)南啟科儀器有限公司；HZT-A100電子天平,福建華志科學(xué)儀器有限公司。濃硫酸(98.08%)，95%乙醇，苯酚，葡萄糖，氫氧化鈉，氯仿，正丁醇等，實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，購自天津富宇試劑公司。

2 方 法

2.1 石韋多糖的提取

石韋經(jīng)過粉碎，并用石油醚浸泡過夜，料液比1∶20，加80%乙醇，回流加熱提取4 h,過濾后晾干，稱取50 g石韋粉末，溶入5 g/mL NaOH中，充分?jǐn)嚢?。按不同料液比，超聲時間，超聲溫度，水浴溫度，進(jìn)行浸提 (表1)[7-8]。溶液經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至體積約50 mL,邊攪拌邊加入3倍體積的95%乙醇，于4 ℃下靜置12 h醇沉。醇沉后的樣品溶液抽濾得到有效成分，溶于100 mL蒸餾水中調(diào)節(jié)pH為8～9。并取1/4體積的按照4∶1的比例取的氯仿和正丁醇，充分混合后在5 000 r/min條件下離心10 min，保留上層多糖溶液，進(jìn)行2次醇沉。

表1 因素水平表

2.2 樣品總多糖的測定

采用苯酚硫酸法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線[9-10]，測定樣品中總多糖含量。用紫外可見光分光光度計在490 nm處測量吸光度。以濃度對吸光度值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸曲線方程為y=28.458x-0.074 3,r=0.999 6精密稱取0.026 4 g的多糖粗品，分別用蒸餾水溶解定容至100 mL，搖勻。照以上方法測定吸光度。

3 結(jié) 果

3.1 結(jié)果分析

結(jié)果顯示同一批石韋不同的提取方法，多糖的得率有很大差異(表2)，其中實(shí)驗(yàn)號1條件下提取率最高，且明顯高于其它條件下的提取率。實(shí)驗(yàn)號3,5,6的得率最低，試驗(yàn)號2,4,7,8,9的提取率相差不大。綜合分析結(jié)果可知，超聲時間、超聲溫度、料液比、水浴溫度在多糖提取中影響因素的大小順序?yàn)椋禾崛r間>超聲時間>溫度>料液比。有柄石韋中多糖提取最佳工藝參數(shù)組合為：超聲溫度40 ℃，提取時間60 min，料水比1∶8 g/mL，水浴時間130 min。即A1B1C1D1。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果分析

3.2 試驗(yàn)驗(yàn)證

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果對A1B1C1D1條件進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證該工藝的合理性和穩(wěn)定性，結(jié)果無顯著差異。最后確定的最佳提取工藝為料液比1∶8、超聲時間60 min、超聲溫度40 ℃、水浴溫度130 ℃。

4 討 論

多糖類化合物是有柄石韋中有效成分之一[1]，研究表明其具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗感染、降血糖等多種生理活性[11]。本研究以中藥有柄石韋為研究對象，采用水提醇沉法提取其中的多糖，并運(yùn)用紫外分光光度法在波長490 nm處測定了多糖的含量。通過正交試驗(yàn)法對提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示最佳提取工藝為料液比1∶8、超聲時間60 min、超聲溫度40 ℃、水浴溫度130 ℃。

隨著超聲時間的延長，多糖得率逐漸增大，但60 min后，多糖得率增加不明顯。分析認(rèn)為，當(dāng)擴(kuò)散達(dá)到平衡時，時間延長會使雜質(zhì)的浸出增加，擴(kuò)散出的多糖還會不斷分解，所以60 min是比較適宜的提取時間?？梢悦黠@看出隨著超聲溫度的增長，多糖的得率也明顯上升。溶劑的溫度增加分子的溶解速度也明顯加快，這有利于多糖克服阻力。但是當(dāng)溫度過高時，多糖結(jié)構(gòu)也有可能遭到破壞而受到抑制。

隨著水浴溫度的增長，多糖的得率也明顯上升。但是當(dāng)溫度過高時，多糖結(jié)構(gòu)也有可能遭到破壞而受到抑制。因此，控制合適的提取條件對多糖的提取效率及石韋的充分利用是至關(guān)重要的。石韋作為一種常用中藥材，近年來被廣泛用于各種復(fù)方制劑中[10]。多糖在有柄石韋中有著較高的含量。通過對有柄石韋中多糖提取工藝的優(yōu)化，提高了石韋的利用率，為進(jìn)一步分離純化多糖類成分提供有利的條件。

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