姜 玲，劉雅莉,婁 倩，焦淑珍，權(quán)永輝

(西北農(nóng)林科技大學(xué) a旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，b林學(xué)院，c園藝學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

葡萄風(fēng)信子(Muscaribotryoides)是天門冬科葡萄風(fēng)信子屬的一種多年生草本觀花地被植物，其因開(kāi)較為稀少的藍(lán)紫色花而深受人們喜愛(ài)。植物的花色是多種因子共同作用的結(jié)果,但絕大多數(shù)植物的花色是由細(xì)胞中的特定花色素而決定?；ㄉ氐暮铣芍饕?類基因的調(diào)控，一類是結(jié)構(gòu)基因，負(fù)責(zé)編碼花色素生物合成的催化酶；另一類是調(diào)節(jié)基因，其編碼的轉(zhuǎn)錄因子可應(yīng)答外界刺激，調(diào)控基因時(shí)空表達(dá)[1]。在調(diào)控色素合成的因子中，以對(duì)MYB轉(zhuǎn)錄因子的研究最為廣泛，目前報(bào)道的幾乎所有的花色素合成途徑都受到MYB轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[2]。

MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，它廣泛參與植物色素合成、細(xì)胞分化與發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及抗逆抗病等次生代謝過(guò)程的調(diào)控[3]。根據(jù)DNA結(jié)合功能域中不完全重復(fù)序列數(shù)目的不同，MYB轉(zhuǎn)錄因子可分為3個(gè)亞族(1R、2R和3R)[3-4]：有1個(gè)重復(fù)的MYB類似蛋白被稱為MYB1R，有2個(gè)重復(fù)的為R2R3-MYB，有3個(gè)重復(fù)的為MYB3R[2]。在MYB轉(zhuǎn)錄因子中，R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物的調(diào)控中起著重要的作用。自Paz-Ares等[5]從植物中分離到第1個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子以來(lái)，大量 MYB 類因子被分離和鑒定[6]。近年來(lái)，科研人員在蘋果[7-8]、龍膽[9]、百合[10]等植物中也克隆和鑒定出色素合成相關(guān)的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，而關(guān)于葡萄風(fēng)信子色素合成的調(diào)節(jié)基因及其功能的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究從葡萄風(fēng)信子中克隆出1個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)和表達(dá)模式分析，以期為明確該基因在葡萄風(fēng)信子花發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以開(kāi)藍(lán)色花的葡萄風(fēng)信子品種‘亞美尼亞’(Muscariarmeniacum)為試驗(yàn)材料，試驗(yàn)種球采自西安植物園，種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)人工氣候室。將葡萄風(fēng)信子花發(fā)育過(guò)程分為4個(gè)時(shí)期(S1.未著色，S2.開(kāi)始著色，S3.完全著色未開(kāi)放，S4.完全著色開(kāi)放)，并分別采集這4個(gè)時(shí)期的花及根、莖、葉組織，用液氮冷凍處理后，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

PrimeScript RT reagent kit 試劑盒、SMARTerTMRACE cDNA擴(kuò)增試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒SYBR Premix ExTaqTMⅡ和克隆載體pMD19-T vector均購(gòu)于大連TaKaRa公司；RNA快速提取試劑盒購(gòu)于北京百泰克公司；DNA回收試劑盒購(gòu)于TIANGEN公司；Matchmaker System 3酵母雜交試劑盒購(gòu)于Clontech公司。PCR擴(kuò)增引物的合成與擴(kuò)增產(chǎn)物序列測(cè)定由北京奧科生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方 法

1.2.1 植物各組織總RNA的提取 根據(jù)RNA快速提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取葡萄風(fēng)信子不同組織的RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量，于-80 ℃冰箱中保存，以備后期RACE擴(kuò)增和實(shí)時(shí)定量分析用。

1.2.2 葡萄風(fēng)信子MYB基因全長(zhǎng)序列的克隆 前期,本課題組對(duì)葡萄風(fēng)信子轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序，目的是通過(guò)篩選獲得與葡萄風(fēng)信子花發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，將篩選出的葡萄風(fēng)信子MYB基因暫命名為MaMYB1。為了獲得MaMYB1基因全長(zhǎng)，用該基因的已知序列(轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得)設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，參考SMARTerTMRACE cDNA擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明書(shū)，準(zhǔn)備3′-RACE-Ready cDNA和5′-RACE-Ready cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。3′RACE的反應(yīng)體系為25 μL，其中PCR-Grade water 17.25 μL,10×Advantage 2 PCR Buffer 2.5 μL,dNTP Mix 0.5 μL,50×Advantage 2 Polymerase Mix 0.5 μL,將其混合液渦旋混勻，瞬時(shí)離心；在混合液中加入3′-RACE-Ready cDNA 1.25 μL，GSP引物(MaMYB1-3′RACE) 0.5 μL以及UPM引物2.5 μL。5′ RACE末端的擴(kuò)增體系同3′ RACE端擴(kuò)增體系，模板為5′-RACE-Ready cDNA，GSP引物為MaMYB1-5′ RACE。5′ RACE和3′ RACE擴(kuò)增程序均為94 ℃變性30 s，67 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸2 min，25個(gè)循環(huán)。對(duì)3′ RACE和5′ RACE的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳后回收測(cè)序。用seqman軟件將得到的序列與已知的EST序列(轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得)進(jìn)行拼接，查找拼接后序列的開(kāi)放讀碼框，在開(kāi)放閱讀框兩端設(shè)計(jì)引物(MaMYB1-F-S和MaMYB1-F-A)，PCR擴(kuò)增MaMYB1基因cDNA的全長(zhǎng)。PCR反應(yīng)體系為：10×Buffer 2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L) 2 μL，MaMYB1-F-S 1 μL，MaMYB1-F-A 1 μL，Taq酶 0.25 μL，ddH2O 17.25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳后回收測(cè)序。

表1 MaMYB1基因克隆及表達(dá)分析所用引物

1.2.3MaMYB1基因序列分析 用ORFfinder在線分析MaMYB1基因的開(kāi)放閱讀框，并推測(cè)該基因所編碼的氨基酸序列，分析蛋白質(zhì)分子質(zhì)量大小及等電點(diǎn)；用Mega 5.0軟件對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析；利用DNAman軟件對(duì)MaMYB1蛋白序列與已知的部分MYB蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析。用Blastp(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)將推測(cè)的蛋白序列與NCBI上的同源序列進(jìn)行比對(duì)。

1.2.4MaMYB1基因的轉(zhuǎn)錄激活活性分析 用帶有酶切位點(diǎn)的引物pGBKT7-M-S和pGBKT7-M-A(表1)將MaMYB1克隆進(jìn)pGBKT7載體中，構(gòu)建pGBKT7-MaMYB1載體；同時(shí)擴(kuò)增GAL4基因，克隆到pGBKT7載體中作陽(yáng)性對(duì)照。將上述重組質(zhì)粒和空載體PGBKT7轉(zhuǎn)化酵母AH109感受態(tài)細(xì)胞，然后涂布于一缺培養(yǎng)基(SD/-Trp)上，30 ℃培養(yǎng)3 d。將于SD/-Trp培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子劃線接種于含有X-α-gal的三缺培養(yǎng)基(SD/-Trp-His-Ade)中，通過(guò)顯色情況檢測(cè)其轉(zhuǎn)錄激活活性。

1.2.5MaMYB1基因的表達(dá)特性分析 以葡萄風(fēng)信子Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，設(shè)計(jì)其特異引物Actin-S和Actin-A(表1)。根據(jù)MaMYB1序列設(shè)計(jì)定量引物MaMYB1-RT-S 和MaMYB1-RT-A(表1)。參照PrimeScript RT reagent kit操作說(shuō)明，將葡萄風(fēng)信子‘亞美尼亞’的根、莖、葉以及不同發(fā)育時(shí)期(S1，S2，S3，S4)花的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系為:5×PrimeScript Buffer 4 μL,PrimeScript RT Enzyme 1 μL,Oligo dT Prime 1 μL,Random 6 mers 1 μL,加入1 000 ng 的RNA，然后加入Rnase Free dH2O至總體積為20 μL。反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，參考SYBR Premix ExTaqTMⅡ操作說(shuō)明，在BIO-RAD Cycler IQ5熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。其反應(yīng)體系為：SYBR Premix ExTaq10 μL,上、下游引物各0.8 μL，模板cDNA 1 μL，加水至總體積為20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 30 s；94 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 MaMYB1全長(zhǎng)序列的獲得

3′ RACE結(jié)果在約 1 kb處有一條帶(圖1-A)，而5′ RACE在約2 kb和500 bp各有一條帶(圖1-B)，其中2 kb處的條帶為非特異擴(kuò)增產(chǎn)物。將1 kb和500 bp處的片段與原有的EST序列拼接在一起，獲得一條長(zhǎng)953 bp的序列，利用ORF finder軟析分析其開(kāi)放閱讀框，根據(jù)開(kāi)放閱讀框兩端序列設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得一條長(zhǎng)約750 bp的序列(圖1-C)。

2.2 MaMYB1基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

利用ORFfinder軟件對(duì)MaMYB1基因序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)750 bp，編碼249個(gè)氨基酸，其蛋白分子質(zhì)量約為27.7 ku，等電點(diǎn)為9.3。推測(cè)該基因編碼的部分氨基酸序列如圖2所示。MaMYB1與部分已知的R2R3-MYB蛋白氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果(圖2)表明，在該序列N端有2個(gè)典型的MYB結(jié)構(gòu)域(R2和R3)，該結(jié)構(gòu)域與部分已報(bào)道的MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域有很高的相似性，在R2結(jié)構(gòu)域中，從推測(cè)的第17個(gè)氨基酸開(kāi)始每隔19個(gè)氨基酸就有1個(gè)色氨酸殘基；在R3結(jié)構(gòu)域中，第1個(gè)色氨酸被苯丙氨酸取代，之后每隔18個(gè)氨基酸就有1個(gè)色氨酸殘基；在此R3結(jié)構(gòu)域內(nèi)，還存在1個(gè)與BHLH蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R，而在與原花青素和花青素合成相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子中該結(jié)構(gòu)域是一常見(jiàn)特征[11-15]。因此可以推斷克隆的轉(zhuǎn)錄因子為典型的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子。將序列提交NCBI Blastp 發(fā)現(xiàn)，其蛋白序列與可可樹(shù)(Theobromacacao)MYB蛋白的相似性為63%，與蘋果(Malusdomestica)和黃瓜(Cucumissativus)MYB蛋白的相似性均為64%。將MaMYB1與其他物種的MYB蛋白進(jìn)行進(jìn)化分析，結(jié)果(圖3)表明，MaMYB1與玉米的ZmP1 以及擬南芥的MYB12關(guān)系較近。

圖1 葡萄風(fēng)信子MYB基因的RACE-PCR以及CDNA全長(zhǎng)電泳結(jié)果

圖2 MaMYB1蛋白部分序列與其他已知MYB序列的比對(duì)

圖3 MaMYB1與 其他MYB蛋白的系統(tǒng)分析

2.3 MaMYB1的轉(zhuǎn)錄激活活性分析

將篩選的轉(zhuǎn)化子在一缺培養(yǎng)基和三缺培養(yǎng)基上培養(yǎng)，結(jié)果(圖4)顯示，陰性對(duì)照只能在一缺培養(yǎng)基(SD/-Trp)上生長(zhǎng)，不能在三缺培養(yǎng)基(SD/-Trp-His-Ade)上生長(zhǎng)，說(shuō)明其無(wú)轉(zhuǎn)錄激活活性； 而pGBKT7-MaMYB1轉(zhuǎn)化子同陽(yáng)性對(duì)照在一缺和三缺培養(yǎng)基上都能生長(zhǎng)，并能使轉(zhuǎn)化子在X-α-gal存在的情況下顯色變藍(lán)。此結(jié)果證明，MaMYB1轉(zhuǎn)錄因子具有轉(zhuǎn)錄激活活性。

2.4 MaMYB1在葡萄風(fēng)信子中的組織表達(dá)譜

利用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)MaMYB1在不同組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果(圖5)表明，在葡萄風(fēng)信子根、莖、葉以及花組織中都檢測(cè)到MaMYB1的表達(dá)，其中以花中的表達(dá)量較高。MaMYB1的表達(dá)量隨花發(fā)育過(guò)程的推進(jìn)呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，在剛開(kāi)始著色(S2)表達(dá)量最高；從S1到S2期，MaMYB1的表達(dá)量顯著增加，S2期表達(dá)量約是S1期表達(dá)量的9倍?？梢?jiàn)MaMYB1在花組織中高表達(dá)，且在花的不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)量差異顯著，推測(cè)該基因可能在花中起調(diào)控作用。

3 討 論

轉(zhuǎn)錄因子也稱反式作用因子，是能夠與基因啟動(dòng)子區(qū)域中的順式作用元件發(fā)生特異性作用的DNA結(jié)合蛋白，它們之間以及與其他相關(guān)蛋白之間的相互作用可激活或抑制某些基因的轉(zhuǎn)錄[16]。其中R2R3-MYB型轉(zhuǎn)錄因子作為MYB蛋白最大的一類，主要參與植物花青苷的代謝調(diào)節(jié)[17]。

圖4 MaMYB1的轉(zhuǎn)錄激活活性分析

本研究結(jié)果表明，MaMYB1基因與已知的R2R3-MYB有很高的同源性。此外，有報(bào)道指示，調(diào)節(jié)花色素生物合成的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子與BHLH轉(zhuǎn)錄因子密切相關(guān)[18-19]，如玉米的ZmC1和BHLH[20]，矮牽牛的AN2 MYB與AN1/JAF13 BHLHs[21]，以及金魚(yú)草的ROSEA1、 ROSEA2與VENOSA MYBs等[22]。這些MYB轉(zhuǎn)錄因子都需要與BHLH形成二聚體的形式來(lái)發(fā)揮其調(diào)節(jié)功能。而MaMYB1基因的R3結(jié)構(gòu)域內(nèi)也存在著1個(gè)與BHLH蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，由此可推斷，MaMYB1在起調(diào)控功能的時(shí)候，可能需要與BHLH蛋白結(jié)合，才能更好地起到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的作用，但該轉(zhuǎn)錄因子是否與花色素的合成調(diào)控有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。

此外，學(xué)者們?cè)趯?duì)R2R3-MYB結(jié)構(gòu)的研究中發(fā)現(xiàn)，在R2R3區(qū)域外存在1個(gè)與調(diào)節(jié)花色素相關(guān)的結(jié)構(gòu)域KPRPR[S/T][F/L][2，23]。但是從單子葉植物中克隆到的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，如文心蘭的OgMYB1[24]、蝴蝶蘭的PsUMYB6[25]以及玉米的ZmC1都未發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)域，表明在單子葉和雙子葉植物中，與色素調(diào)節(jié)相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子存在著一定的差異[26]。本研究結(jié)果顯示，在MaMYB1氨基酸序列中未發(fā)現(xiàn)KPRPR[S/T]結(jié)構(gòu)域。

調(diào)節(jié)類黃酮合成的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子有不同的亞族，如矮牽牛的AN2、擬南芥的PAP1、PAP2和TT2，它們?cè)诨?、果?shí)、種子和內(nèi)果皮的花色素和原花色素的生物合成中起著重要作用。玉米的ZmC1、P1以及擬南芥的MYB11、MYB12 和MYB111基因有著相似的功能，它們與幼苗和內(nèi)果皮的黃酮醇和鞣紅物質(zhì)的合成有關(guān)[9]。 本研究結(jié)果表明， MaMYB1與玉米P1 和擬南芥MYB12的關(guān)系較近，說(shuō)明MaMYB1對(duì)類黃酮的合成可能有調(diào)節(jié)作用。

實(shí)時(shí)定量PCR分析結(jié)果表明，MaMYB1基因在花中的表達(dá)量高于其他組織，且在花發(fā)育過(guò)程中表達(dá)量有顯著變化，因此可以推測(cè)，MaMYB1主要在花中發(fā)揮表達(dá)調(diào)控功能。

根據(jù)本研究結(jié)果，筆者推測(cè)MaMYB1基因可能在葡萄風(fēng)信子的花中發(fā)揮調(diào)控功能，且有可能與類黃酮的合成相關(guān)。下一步的研究是構(gòu)建該基因的表達(dá)載體，通過(guò)轉(zhuǎn)化模式植物，進(jìn)一步探究其在生物體中的調(diào)控功能。

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