閆飛，鄭文艷，張專(zhuān)才，曲芬

·專(zhuān)題綜述·

布魯氏菌種/型鑒別的研究現(xiàn)狀

閆飛，鄭文艷，張專(zhuān)才，曲芬

布魯菌病是由布魯氏菌引起的一種人畜共患病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為重要傳染病，近些年發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行布魯氏菌種/型分類(lèi)的研究具有重要意義。本文通過(guò)總結(jié)近年來(lái)布魯氏菌種/型鑒定的研究進(jìn)展，為今后判斷預(yù)測(cè)疫情動(dòng)態(tài)、研究流行特點(diǎn)以及制定合理有效的防治對(duì)策提供重要的理論依據(jù)。

布魯桿菌??；布魯桿菌屬；分子生物學(xué)；總結(jié)性報(bào)告專(zhuān)題

布魯菌?。ú疾。?，又稱(chēng)波浪熱、地中海弛張熱、馬耳他熱或波狀熱，是由布魯氏菌引起的一種人畜共患病[1]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為重要傳染病，我國(guó)將其列為乙類(lèi)傳染病，也被列為《家畜家禽防疫條例實(shí)施細(xì)則》中第二類(lèi)傳染病，屬自然疫源性疾病[2]。染病家畜是人感染的主要傳染源。該病呈點(diǎn)狀分散分布。該病起源于公元前1600年的埃及第5次瘟疫時(shí)期[3]。在20世紀(jì)50年代，美軍成功研發(fā)的第一個(gè)細(xì)菌武器菌種即為布魯氏菌[4]。在全世界200多個(gè)國(guó)家和地區(qū)有170多個(gè)國(guó)家和地區(qū)有人畜布病存在和流行，全球1/6～1/5的人受該病威脅[5-7]。人和牲畜發(fā)病率較高的國(guó)家和地區(qū)為希臘、西班牙、馬耳他、意大利和蘇格蘭等。在亞洲，蒙古人民共和國(guó)人畜布病比較嚴(yán)重[8-11]。在我國(guó)，布病主要流行在內(nèi)蒙古自治區(qū)、新疆維吾爾自治區(qū)、西藏自治區(qū)、黑龍江等9個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)），其人間和畜間報(bào)告病例數(shù)占全國(guó)報(bào)告病例數(shù)的98%以上[12]。布病主要感染人群是從事宰殺、飼養(yǎng)牲畜、皮毛加工、收購(gòu)皮毛或牲畜的人員以及獸醫(yī)。布魯氏菌在皮毛中可生存1.5～4個(gè)月，特別是羊布魯氏菌對(duì)人類(lèi)健康的威脅最大[13-14]。近些年我國(guó)布病流行呈上升趨勢(shì)。

1 布魯氏菌的生物種/型分類(lèi)

1970年聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織及WHO布病專(zhuān)家委員會(huì)把布魯氏菌分為6個(gè)生物種，即羊布魯氏菌（Br.melitensis）、牛布魯氏菌（Br.abortus）、豬布魯氏菌（Br.suis）、沙林鼠（木鼠）布魯氏菌（Br.neotomae）、綿羊附睪布魯氏菌（Br.ovis）及犬布魯氏菌（Br.canis）[14]。國(guó)內(nèi)布魯氏菌的研究者根據(jù)布魯氏菌生化反應(yīng)特點(diǎn)及菌體表面的不同結(jié)構(gòu)，將其分為9個(gè)不同的種，其中7種感染陸生哺乳動(dòng)物，為羊布魯氏菌、牛布魯氏菌、豬布魯氏菌、綿羊附睪布魯氏菌、沙林鼠（木鼠）布魯氏菌、犬布魯氏菌和田鼠布魯氏菌（Br. microti）；2種感染海洋哺乳動(dòng)物，為海豚布魯氏菌（Br. ceti）和鯨布魯氏菌（Br.pinnipedialis）[15]。幾種主要布魯氏菌的發(fā)現(xiàn)及流行概況[16-18]詳見(jiàn)表1。

上述6個(gè)生物種又分為19個(gè)生物亞型。除沙林鼠（木鼠）布魯氏菌、犬布魯氏菌、綿羊附睪布魯氏菌各占1種亞型外，其余根據(jù)牛布魯氏菌T6噬菌體裂解試驗(yàn)和氧化代謝試驗(yàn)把羊、牛、豬3個(gè)生物種區(qū)分為若干個(gè)生物型，包括牛布魯氏菌的8個(gè)生物型，即牛1、2、3、4、5、6、7、9型；羊布魯氏菌的3個(gè)生物型，即羊1、2、3型；豬布魯氏菌的5個(gè)生物型，即豬1、2、3、4、5型[19]。

2 布魯氏菌種/型的生物學(xué)特性

布魯氏菌種的基因組大小和組成十分相似，基因組的平均長(zhǎng)度約為3.39Mb，并由2個(gè)環(huán)形的染色體組成，染色體Ⅰ長(zhǎng)度約為2.11Mb，G┼C含量為57.2%；染色體Ⅱ長(zhǎng)度約為1.18Mb，G┼C含量為57.3%。所有菌種及它們的生物型變種染色體DNA的同源性在90%以上。在布魯氏菌染色體上，有一個(gè)長(zhǎng)度為14 Kb的DNA片段，該片段含有7個(gè)高度保守的基因參與了O鏈的生物學(xué)合成，而且這7個(gè)基因在R型布魯氏菌中也呈現(xiàn)高度保守狀態(tài)，它們分別是WbKA、gmd、per、wzm、wzt、wbkB和wbkC，分別編碼相應(yīng)的酶和蛋白甘露糖轉(zhuǎn)移酶、GDP2甘露糖4,6脫水酶、perosamine合成酶、ABC運(yùn)載體Ⅰ（所有膜蛋白）、ABC運(yùn)載體Ⅱ（ATP酶）、一個(gè)假設(shè)的功能未知的蛋白和一個(gè)假定的甲?；D(zhuǎn)移酶，其中wzm和wzt與菌體表面O鏈的缺失有關(guān)[20-21]。目前發(fā)現(xiàn)的O鏈表面有7個(gè)不同的抗原位點(diǎn)，它們分別是A、M、C（M=A）、C（M＞A）、C/Y（M＞A）、C/Y（M=A）、C/Y（A＞M）等，菌體A、M、C、C/Y抗原的比例與種/型有關(guān)。O鏈表面的7種抗原決定基在所有的S型布魯氏菌中分布具有不均一性。在同一種內(nèi)，不同菌株之間A抗原和M抗原的分布及分布的數(shù)量都不相同。M抗原和A抗原除了2種R型布魯氏菌（綿羊附睪布魯氏菌和犬布魯氏菌）外，在其他4種布魯氏菌（羊布魯氏菌、牛布魯氏菌、豬布魯氏菌、沙林鼠布魯氏菌）及它們的生物型變種中均有不同程度的分布[3]。

最早發(fā)表的羊布魯氏菌M16基因組顯示，其基因組包括2條分別為2.1 Kb（Ⅰ）和1.2 Kb（Ⅱ）的染色體。Ⅰ號(hào)染色體編碼2059個(gè)開(kāi)放閱讀框（1653+，1006-），其中已知的編碼蛋白134個(gè)（77+，57-），占6.5%；Ⅱ號(hào)染色體編碼1138個(gè)開(kāi)放閱讀框（549+，590-），其中已知的編碼蛋白53個(gè)（25+，28+），占4.7%。同2002年隨后發(fā)表的豬布魯氏菌基因組相比，二者表現(xiàn)出難以置信的保守性，全基因組僅有7301個(gè)單個(gè)堿基對(duì)變異，所編碼的超過(guò)約3000個(gè)基因中，僅有77個(gè)不同，其中羊布魯氏菌特有的基因有32個(gè)集中位于Ⅰ號(hào)染色體11區(qū)，豬布魯氏菌特有的基因中有42個(gè)集中位于染色體22區(qū)。在羊布魯氏菌的77個(gè)與豬布魯氏菌不同的基因中，有28個(gè)存在于牛布魯氏菌基因組中[4]。

3 布魯氏菌生物種/型的鑒定

3.1 PCR技術(shù)對(duì)布魯氏菌種/型的鑒定布魯氏菌分子生物學(xué)診斷技術(shù)以PCR為主，是目前主要的研究技術(shù)。Bricker和Halling[22]通過(guò)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites,CAPs）技術(shù)將牛布魯氏菌、綿羊附睪布魯氏菌與其他菌種區(qū)分開(kāi)。Vizcaíno等[23]利用CAPs技術(shù)將豬布魯氏菌與犬布魯氏菌區(qū)別開(kāi)。Fernández-Lago等[24]用布魯氏菌16Sr-RNA序列制備熒光核酸探針進(jìn)行全菌雜交試驗(yàn)，選用3種熒光探針對(duì)所有布魯氏菌屬和變種以及9株不同的臨床分離的布魯氏菌進(jìn)行雜交檢測(cè)，結(jié)果用B9探針可將豬布魯氏菌2、3、4、5型和幾乎全部其他布魯氏菌種區(qū)分開(kāi)。Cloeckaert等[25]可以將海洋種與其他布魯氏菌種區(qū)分開(kāi)。Redkar等[26]應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒別了布魯氏菌的牛、羊、豬3個(gè)種。Fayazi等[27]用一個(gè)長(zhǎng)度為25 bp的引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增后將豬種和牛種布魯氏菌鑒別開(kāi)。Bricker等[28]建立了Bass PCR，篩選牛布魯氏菌。Hinic等[29]建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒別6個(gè)種的布魯氏菌。López-Go?i等[30]建立了一種多重PCR實(shí)驗(yàn)（階梯法），可鑒別古典布魯氏菌種，包括海洋種及疫苗株S19、RB51和Rev.1。

3.2 其他技術(shù)對(duì)布魯氏菌各種/型的鑒定20世紀(jì)70年代，Carlsson等[31]提出用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷羊、豬、綿羊附睪布魯氏菌，此后至今所做的工作有：Ocampo Sosa等[32]設(shè)計(jì)以AMOS-ERY和IS711為探針的Southern blot雜交試驗(yàn)鑒別出牛3b、牛5、牛6和牛9型；Le Flèche等[33]應(yīng)用多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析方法代替了傳統(tǒng)分型方法進(jìn)行種/型鑒定；Whatmore等[34]用依據(jù)21個(gè)數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列（variable number of tandem repeats, VNTR）基因座建立的分子亞類(lèi)鑒定方法——VNTR方法，對(duì)布魯氏菌進(jìn)行了流行病學(xué)追蹤和菌株親緣關(guān)系的確定；王遠(yuǎn)志等[35]利用高變8聚核苷酸DNA指紋技術(shù)鑒定綿羊附睪種布魯氏菌菌株。

4 布魯氏菌預(yù)防的研究現(xiàn)狀

對(duì)于布魯氏菌種/型的研究，有利于更好預(yù)防布病的流行，尤其對(duì)于布魯氏菌疫情暴發(fā)具有深遠(yuǎn)意義。布魯氏菌各種/型的疫苗研究對(duì)今后布病的防控具有非常重要的價(jià)值。針對(duì)布魯氏菌暴發(fā)時(shí)的各種/型的疫苗研究是目前防控的重點(diǎn)及攻破難點(diǎn)。

4.1 牛種布魯氏菌19（Br.abortus strain19,S19）疫苗該疫苗制造用菌株是1923年從牛奶中分離獲得的，菌株中含有O鏈的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）能持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，對(duì)牛有一定的保護(hù)力，歷史上曾將S19株廣泛應(yīng)用于牛的免疫接種。但該菌株能傳染人，并會(huì)引起懷孕母畜的流產(chǎn)，在公畜中也被限制使用[36]。

4.2 羊種布魯氏菌Rev.1（Br.melitensis Rev.1,Rev. 1）疫苗Rev.1被認(rèn)為是一種毒力減弱株，屬于光滑型，對(duì)牛、羊布魯氏菌均具有免疫保護(hù)力。此菌株作為疫苗仍具有一定的毒力，并且在適當(dāng)?shù)臈l件下，毒力可以完全恢復(fù)[37-38]。

4.3 豬種布魯氏菌S2疫苗（Br.suis strain 2,S2）該疫苗是用中國(guó)分離株制造的，毒力比S19和Rev.1弱，對(duì)豬、牛和羊均能產(chǎn)生良好的免疫。由于其毒力較弱，可以通過(guò)口服或肌內(nèi)注射的方式進(jìn)行免疫，并且不會(huì)導(dǎo)致懷孕母畜的流產(chǎn)，因此在我國(guó)被廣泛使用。雖然有研究認(rèn)為，S2的保護(hù)率較S19和Rev.1低10%～20%，但大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，S2能夠提供令人滿(mǎn)意的保護(hù)率，對(duì)超強(qiáng)毒的馬爾他型布魯氏菌的攻擊能提供40%～60%的保護(hù)[39-40]。

4.4 牛種布魯氏菌45/20（Br.abortus strain 45/20, 45/20）疫苗該疫苗制造用菌株1922年從病牛體中分離，后經(jīng)豚鼠20次傳代后獲得粗糙型的減毒株。其優(yōu)點(diǎn)是LPS結(jié)構(gòu)中無(wú)O鏈，因此免疫動(dòng)物以后，在其體內(nèi)檢測(cè)不到O鏈的抗體，從而可以避免干擾診斷。該菌株作為疫苗的免疫機(jī)制仍不清楚，有研究推斷LPS中殘留的少量O鏈在起作用，也有研究認(rèn)為菌體的一些其他有效蛋白刺激了機(jī)體的細(xì)胞免疫，但這些猜測(cè)都缺乏直接有效的證據(jù)。粗糙型的45/20疫苗株最嚴(yán)重的問(wèn)題是該菌株極不穩(wěn)定，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)從R型到S型的變異，使其毒力恢復(fù)為強(qiáng)毒，因此其作為疫苗的安全性仍有爭(zhēng)議[41]。

4.5 粗糙型牛種布魯氏菌株51（rough strain Br. Abortus 5l,RB51）疫苗該疫苗株最初由光滑型牛布魯氏菌2308株經(jīng)體外反復(fù)傳代，并經(jīng)利福平和青霉素的篩選獲得。具有利福平抗性的RB51是當(dāng)前應(yīng)用最為廣泛的疫苗。多年的實(shí)踐證明其免疫力和保護(hù)力均優(yōu)于S19，并克服了以往疫苗的一些弱點(diǎn)。動(dòng)物模型表明RB5l所引起的主要是B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫，所產(chǎn)生的抗體雖不能直接殺死病菌，但機(jī)體產(chǎn)生的各種細(xì)胞因子卻具有殺死病菌的功能，良好的抗體水平能有效地抵制野毒株的感染。研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于光滑型牛布魯氏菌2308株，RB5l在其基因組wboA基因（編碼糖基轉(zhuǎn)移酶）中插入了一段Is711成分（大小為842 bp的插入序列）。該序列比較保守，經(jīng)常出現(xiàn)在布魯氏菌基因組中，確切功能未知。然而在2308株wboA基因中插入其他轉(zhuǎn)座基因獲得的突變株，能提供比RB51更好的免疫保護(hù)效果，但毒力比RB51強(qiáng)[42]。

4.6 新型布魯氏菌DNA疫苗對(duì)于布魯氏菌DNA疫苗的研究方興未艾，呈現(xiàn)較好的發(fā)展勢(shì)頭。特別是伴隨布魯氏菌的全基因組測(cè)序完成，開(kāi)展了保護(hù)性抗原分子的DNA疫苗的研究。所選用的抗原分子有外膜蛋白、細(xì)菌表面蛋白及核蛋白等。而DNA疫苗的候選分子主要集中在刺激T細(xì)胞引起細(xì)胞免疫的以下幾個(gè)分子。

4.6.1 L7/L12 L7/L12是重要的布魯氏菌免疫優(yōu)勢(shì)抗原，在布魯氏菌的幾種保護(hù)性抗原基因中，以它為基礎(chǔ)構(gòu)建的疫苗對(duì)感染具有最顯著的抵抗作用。早在1997年，有學(xué)者將L7/L12用pcDNA3做載體制成DNA疫苗，該疫苗能夠誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，并產(chǎn)生特異性抗體，有一定的保護(hù)力。但此種DNA疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)維持時(shí)間較短，可能與注射劑量及注射方式有關(guān)[43]。

4.6.2 GroEL熱休克蛋白在分枝桿菌感染免疫中研究最為廣泛，Steller等[44]利用pCMV真核表達(dá)載體構(gòu)建了GroEL，然而經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，此DNA疫苗對(duì)布魯氏菌的攻擊無(wú)任何保護(hù)作用。另外，研究較多的T細(xì)胞抗原還有SOD，B細(xì)胞抗原中研究最多的有Omp31、BCSP31等。

4.6.3 Opm31 Opm31為一種B細(xì)胞抗原，用質(zhì)粒pNv3123與之構(gòu)建一重組體，注入Balb/c小鼠體內(nèi)，實(shí)驗(yàn)證明小鼠體內(nèi)可產(chǎn)生大量的IgG，且在攻毒時(shí)有一定的保護(hù)力[45]。

5 展望

布魯氏菌種/型的分類(lèi)研究是今后研究的重點(diǎn)，尤其是應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行布魯氏菌種/型分類(lèi)的研究對(duì)預(yù)防具有積極意義，因其較好的敏感性、特異性及快速性等特點(diǎn)，可作為布病的一個(gè)重要診斷方法，具有很廣闊的前景。鑒別布魯氏菌各種/型的技術(shù)方法種類(lèi)繁多，其中應(yīng)用免疫酶組化法和PCR技術(shù)檢測(cè)臨床標(biāo)本中的布魯氏菌DNA將成為今后早期、快速診斷布病的發(fā)展方向[46]。而VNTR指紋圖譜的分子生物學(xué)方法能高度區(qū)分不同布魯氏菌生物種/型，因此它可以用于流行病學(xué)調(diào)查，追蹤暴發(fā)疫情中病例的來(lái)源，從而就能有效地控制傳染源及切斷傳染途徑[47]，因此該項(xiàng)技術(shù)具有不可忽視的作用，也將是今后研究的重點(diǎn)。利用免疫酶組化法、PCR技術(shù)和VNTR指紋圖譜進(jìn)行布魯氏菌生物種/型的鑒定，將成為今后布病研究領(lǐng)域的一個(gè)主要研究方向。布魯氏菌種/型的鑒定研究對(duì)于判斷預(yù)測(cè)疫情動(dòng)態(tài)、研究流行特點(diǎn)、探索掌握流行規(guī)律以及制定合理有效的防治對(duì)策具有重要意義，同時(shí)對(duì)布魯氏菌疫苗的研制和布魯氏菌新藥的開(kāi)發(fā)均有深遠(yuǎn)的影響作用，尤其在以畜牧業(yè)為主的地區(qū)，布魯氏菌的分型對(duì)于該區(qū)域布病的防控及疫苗的發(fā)放具有深遠(yuǎn)影響。

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（2013-07-25收稿 2013-10-03修回）

（責(zé)任編委 李軍 本文編輯 張?jiān)戚x）

Research status of identification of Brucella species/types

YAN Fei,ZHENGWen-yan*,ZHANG Zhuan-cai,QU Fen
Class 5 Internal Medicine Graduate 2012,Inner Mongolia Medical University, Hohhot,the Inner Mongolia Autonomous Region 010010,China
*Corresponding author,E-mail:fyyjbwangyi@sina.com

Brucellosis is a kind of zoonosis which is caused by members of the genus Brucella.World Organization for Animal Health lists it as an important infectious disease.In recent years,the morbidity of brucellosis has been rising.Application of molecular biology techniques to the research of Brucella species/types is of important significance.This article summarizes the research progress of identification of Brucella species/types,which provides evidence for judging and predicting epidemic dynamics, studing epidemic characteristics and making reasonable and effective prevention and control counter-measures.

brucellosis;Brucella;molecular biology;consensus development conferences as topic

R516.7

A

1007-8134(2014)01-0055-05

內(nèi)蒙古科技廳基金項(xiàng)目（20120404）；內(nèi)蒙古衛(wèi)生廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（2010045）

010010呼和浩特，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)2012級(jí)內(nèi)科學(xué)研究生臨床五班（閆飛）；010000呼和浩特，解放軍第二五三醫(yī)院傳染科（閆飛、鄭文艷、張專(zhuān)才）；100039北京，解放軍第三○二醫(yī)院臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心（曲芬）

鄭文艷，E-mail:fyyjbwangyi@sina.com