王晨霞，來(lái)航線，韓 剛，李凱榮，韋小敏

(西北農(nóng)林科技大學(xué) a 資源環(huán)境學(xué)院,b 林學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

近年來(lái)，隨著石油勘探開(kāi)發(fā)和區(qū)域經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，受石油污染的土壤面積不斷擴(kuò)大，污染程度也日益增加[1]。有數(shù)據(jù)顯示，全世界每年約有800萬(wàn)t石油進(jìn)入環(huán)境，我國(guó)每年有近60萬(wàn)t石油進(jìn)入環(huán)境形成污染[2]。在遼河油田、勝利油田和冀東油田等新老重污染區(qū)，土壤中的原油含量已經(jīng)達(dá)到或超過(guò)1.0×104mg/kg，甚至達(dá)1.0×105mg/kg[3]。由于石油中含有多種復(fù)雜的芳香烴，這些物質(zhì)毒性大，并且進(jìn)入土壤后難以去除，從而引起嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題[4-5]，因此石油污染土壤的修復(fù)已引起人們的高度關(guān)注。目前，國(guó)內(nèi)外研究人員對(duì)石油污染土壤的生物修復(fù)進(jìn)行了大量研究，業(yè)已篩選了許多石油降解菌，但對(duì)于石油污染脅迫下土壤微生物的群落組成和動(dòng)態(tài)變化了解甚少[6-7]。Sanjeet等[8]研究表明，石油污染物的降解是微生物群落共同作用的結(jié)果。因此，研究石油污染脅迫對(duì)土壤微生物多樣性的影響至關(guān)重要。

用于測(cè)定土壤微生物多樣性的方法很多，傳統(tǒng)的研究方法主要包括微生物平板培養(yǎng)法、電鏡法、染色法等[9]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PLFA、Biolog微平板法、RFLP、T-RFLP等技術(shù)受到越來(lái)越多的關(guān)注[10]。目前，這些方法在石油污染土壤微生物多樣性的研究中均有所應(yīng)用。不可否認(rèn)的是，傳統(tǒng)的微生物平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法仍是一個(gè)評(píng)價(jià)污染脅迫效應(yīng)的有效方法[11-12]，但這種方法過(guò)于粗放，因此只有將傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法與現(xiàn)代生物技術(shù)結(jié)合，才能更加客觀全面地反映微生物群落結(jié)構(gòu)的真實(shí)信息。Biolog微平板法是通過(guò)微生物對(duì)多種碳源底物的利用能力來(lái)反映微生物群落的功能多樣性，可比較全面地表征土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、總體代謝活性與功能信息，是目前已知的研究微生物代謝功能多樣性的有力方法[13-14]。

本研究將微生物平板培養(yǎng)法與Biolog微平板法相結(jié)合，輔以土壤微生物呼吸強(qiáng)度的測(cè)定，從多個(gè)角度探討石油污染脅迫下刺槐、油松、紫穗槐和沙棘4種耐性植株根區(qū)的土壤微生物多樣性，旨在了解石油污染脅迫土壤生物降解過(guò)程中起重要作用的微生物類(lèi)群，以及從微生物角度為石油污染土壤生物修復(fù)時(shí)的植株選擇、評(píng)價(jià)等提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試土壤 供試土壤 (黃綿土) 來(lái)自陜北安塞縣人為活動(dòng)稀少的無(wú)污染荒草地，采樣深度0～20 cm。

1.1.2 供試原油 采自陜北安塞縣化子坪油區(qū)井口。

1.1.3 供試植株 依據(jù)陜西延安氣候和土壤條件，選取刺槐、油松、紫穗槐和沙棘4種耐性植株。

1.1.4 供試培養(yǎng)基 參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》，放線菌分離用高氏一號(hào)培養(yǎng)基，細(xì)菌分離用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，真菌分離用PDA培養(yǎng)基[15]。

1.2 供試土壤預(yù)處理

采用常規(guī)分析方法[16]，測(cè)定供試土壤的全氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、速效磷、速效鉀、pH值和有機(jī)質(zhì)等基本理化性質(zhì)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

供試土壤去掉植物殘?bào)w和其他雜質(zhì)，風(fēng)干并過(guò)4 mm篩，測(cè)定土壤含水量后，裝入31 cm×23 cm×27 cm (上口直徑×底部直徑×高) 的塑料桶中，每桶裝土12.94 kg (以土壤干質(zhì)量計(jì))，按設(shè)計(jì)的石油污染脅迫水平采用完全混合的方式分別添加供試原油，使盆栽土壤的石油污染脅迫水平為0，5，10，15和20 g/kg。供試土壤與供試原油混合時(shí)不使用任何有機(jī)溶劑，混勻后靜置15 d。

表1 供試安塞黃綿土的理化性質(zhì)

于2012年3月初，選取苗高、地徑相對(duì)一致，根系完整的供試植株幼苗統(tǒng)一截干后，植入前期所制備的不同石油污染脅迫水平的盆栽土壤中。每盆重復(fù)栽植3株供試植株幼苗，每種供試植株對(duì)各石油污染脅迫水平的處理設(shè)置6個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置無(wú)盆栽植株的空白對(duì)照 (CK)。為防止天然降水，定植后將盆栽放置于可移動(dòng)式防雨棚內(nèi)，晴天正常光照并充分供水，保證各處理幼苗成活和正常生長(zhǎng)。試驗(yàn)中各盆栽土壤的水分含量控制在初始土壤田間持水量的75%。

1.3 試驗(yàn)土樣的采集與處理

2012年8月末以混合采樣法采取試驗(yàn)盆栽植株根區(qū)的土壤。所采集土樣去除根系和其他雜質(zhì)后裝于自封袋內(nèi)并編號(hào)，4 ℃低溫保存，用于后續(xù)試驗(yàn)分析。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 土壤微生物區(qū)系分析 試驗(yàn)土樣用牛肉膏蛋白胨瓊脂、PDA及高氏一號(hào)培養(yǎng)基按梯度稀釋法培養(yǎng)，其中PDA培養(yǎng)基加體積分?jǐn)?shù) 0.3% 乳酸調(diào)pH，高氏一號(hào)培養(yǎng)基加入80 mg/L K2Cr2O4抑制劑。培養(yǎng)周期結(jié)束后以四分法按每克干土質(zhì)量菌落數(shù)(CFU/g) 計(jì)數(shù)。之后依據(jù)菌落培養(yǎng)特征觀察記錄不同微生物種類(lèi)，并對(duì)培養(yǎng)特征相似的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢觀察，初步確定細(xì)菌種類(lèi)。

1.4.2 土壤微生物群落呼吸強(qiáng)度的測(cè)定[17-18]微生物呼吸強(qiáng)度的測(cè)定采用酸堿滴定法。試驗(yàn)中以每消耗1 mL 0.1 mol/L NaOH 相當(dāng)于2.2 mg CO2量為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算各處理土壤呼吸作用的CO2釋放量，以土壤呼吸釋放CO2的毫克數(shù) (CO2mg/g干土) 表征微生物群落的呼吸強(qiáng)度。

1.4.3 土壤微生物功能多樣性分析[19-20]將試驗(yàn)土樣制備為土壤懸液，活化后按梯度稀釋法稀釋至10-3，接種于ECO生態(tài)測(cè)試板上。將接種好的測(cè)試板加蓋，于(25±1) ℃培養(yǎng)240 h，其間每隔24 h用Biolog自動(dòng)讀數(shù)裝置于590 nm波長(zhǎng)下讀取吸光度值。

(1) 土壤微生物對(duì)碳源利用的整體特征。采用ECO生態(tài)測(cè)試板上每孔顏色平均變化率，即590 nm波長(zhǎng)下土壤微生物群落的平均吸光度值 (Average well-color development，AWCD) 來(lái)描述微生物對(duì)碳源利用的整體情況及利用活性。

(2) 土壤微生物多樣性指數(shù)(H′)。以ECO生態(tài)測(cè)試板培養(yǎng)96 h后測(cè)定的吸光度值為基礎(chǔ)，計(jì)算Shannon指數(shù)H′[21]來(lái)反映微生物群落代謝功能的多樣性。AWCD、Shannon指數(shù)H′按下式計(jì)算：

AWCD=∑(Ci-C0)/n，H′=-∑pilnpi。

式中：Ci為每個(gè)孔的吸光度值，C0為對(duì)照孔的吸光度值，n為碳源孔數(shù)；pi為第i孔相對(duì)吸光度值與整個(gè)平板相對(duì)吸光度值總和的比值[22]。

(3) 土壤微生物對(duì)6大類(lèi)型碳源的利用特征。將ECO生態(tài)測(cè)試板上的31種碳源分成6大類(lèi)型，分別為羧酸類(lèi)7種、碳水化合物類(lèi)10種、氨基酸類(lèi)6種、多聚物類(lèi)4種、胺類(lèi)2種和酚酸類(lèi)2種。土樣中微生物群落對(duì)6大類(lèi)型碳源的利用特征以相對(duì)吸光度值ΔC(ΔC=C-C0，其中C表示各碳源類(lèi)型吸光度值的平均值)來(lái)表征。

(4) 主成分分析。通過(guò)主成分分析 (Principal component analysis,PCA) 將ECO生態(tài)測(cè)試板中的31種碳源形成的描述群落代謝特征的多元向量變換為互不相關(guān)的主元向量 (PC1和PC2)，在降維后的主元向量空間中用點(diǎn)的位置直觀地反映不同微生物群落的代謝特征。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)Excel及SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤微生物區(qū)系分析

土壤中可培養(yǎng)微生物 (細(xì)菌、真菌、放線菌) 的種類(lèi)和數(shù)量是衡量土壤微生物區(qū)系狀況的重要指標(biāo)[23]。本試驗(yàn)使用3種固體培養(yǎng)基，用稀釋平板涂布法對(duì)土樣中可培養(yǎng)的微生物進(jìn)行分離計(jì)數(shù)，以此表征可培養(yǎng)微生物群落組成的多樣性，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同石油污染脅迫水平下4種植株根區(qū)土壤中可培養(yǎng)微生物的種類(lèi)及數(shù)量

由表2可以看出，在無(wú)石油污染脅迫時(shí)，栽有植株的根區(qū)土樣中，可培養(yǎng)微生物的種類(lèi)與數(shù)量總和均高于無(wú)植株土樣，說(shuō)明所栽植的4種植株均能夠增加土壤微生物多樣性；當(dāng)石油污染脅迫水平逐漸提高時(shí)，不同植株根區(qū)土壤微生物多樣性的變化不同，說(shuō)明4種植株對(duì)石油污染脅迫的抗性存在差異。如當(dāng)石油污染脅迫水平為10 g/kg時(shí)，各植株根區(qū)土樣可培養(yǎng)微生物種類(lèi)的多少排序?yàn)椋捍袒?油松>沙棘>紫穗槐。總體來(lái)看，在石油污染脅迫水平提高時(shí)，刺槐植株對(duì)根區(qū)土壤中微生物多樣性的促進(jìn)作用最強(qiáng)。

進(jìn)一步分析表2數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)石油污染脅迫水平在5～10 g/kg時(shí)，油松、沙棘、刺槐植株根區(qū)土壤微生物種類(lèi)隨污染水平的提高而增加；當(dāng)石油污染脅迫水平高于10 g/kg時(shí)，油松、沙棘、刺槐植株根區(qū)土壤微生物種類(lèi)隨石油污染脅迫水平的提高而減少；說(shuō)明5～10 g/kg石油污染脅迫水平能有效刺激油松、沙棘、刺槐植株根區(qū)土壤微生物的生長(zhǎng)，但高水平石油污染脅迫會(huì)對(duì)部分土壤微生物產(chǎn)生毒害作用，抑制其生長(zhǎng)，使得油松、沙棘、刺槐植株根區(qū)土壤微生物的種類(lèi)減少。此外，由表2還可以看出，紫穗槐植株根區(qū)土壤微生物的種類(lèi)在不同石油污染脅迫水平下的變化無(wú)規(guī)律性。

2.2 土壤微生物呼吸強(qiáng)度分析

土壤微生物呼吸作用是土壤微生物生命活動(dòng)中釋放CO2的過(guò)程，其強(qiáng)弱變化是反映微生物活性及土壤生化強(qiáng)度的總指標(biāo)[24-25]。本試驗(yàn)采用酸堿滴定法對(duì)石油污染脅迫下不同植株根區(qū)土壤樣品的呼吸強(qiáng)度進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，在無(wú)石油污染脅迫時(shí)，油松植株根區(qū)土壤微生物呼吸強(qiáng)度低于無(wú)植株對(duì)照土壤；當(dāng)石油污染脅迫水平遞增到15 g/kg時(shí)，栽有植株的根區(qū)土壤微生物呼吸強(qiáng)度均略高于無(wú)植株對(duì)照土壤；當(dāng)石油污染脅迫水平為20 g/kg時(shí)，栽有植株的根區(qū)土壤微生物呼吸強(qiáng)度明顯高于無(wú)植株對(duì)照土壤。說(shuō)明試驗(yàn)所栽植的4種植株對(duì)根區(qū)土壤微生物生長(zhǎng)有刺激作用，且這種刺激作用在高水平石油污染脅迫下表現(xiàn)得更為明顯，這與區(qū)系分析中所得到的“試驗(yàn)植株能夠增加石油污染脅迫下土壤微生物多樣性”的結(jié)論相一致。

圖1 不同石油污染脅迫水平對(duì)4種植株根區(qū)土壤微生物呼吸強(qiáng)度的影響

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，不同水平石油污染脅迫對(duì)各處理土壤微生物呼吸強(qiáng)度的作用不同。其中，無(wú)植株土壤微生物呼吸強(qiáng)度在0～5 g/kg石油污染脅迫水平內(nèi)上升，其后逐漸減弱；油松與沙棘植株根區(qū)土壤微生物呼吸強(qiáng)度隨石油污染脅迫水平的增加表現(xiàn)出相似的變化趨勢(shì)：在0～10 g/kg石油污染脅迫水平，植株根區(qū)土壤微生物呼吸強(qiáng)度出現(xiàn)輕微波動(dòng)，高于10 g/kg石油污染脅迫水平后逐漸上升，在15 g/kg 石油污染脅迫水平下達(dá)到最大值，其后隨石油污染脅迫水平的升高而下降；刺槐根區(qū)土壤微生物呼吸強(qiáng)度在0～10 g/kg石油污染脅迫水平逐漸下降，在10～20 g/kg石油污染脅迫水平逐漸增加；紫穗槐根區(qū)土壤微生物呼吸強(qiáng)度隨石油污染脅迫水平升高而增加，至10 g/kg石油污染脅迫水平時(shí)達(dá)到最大值，其后隨石油污染脅迫水平升高而降低(圖1)。

2.3 土壤微生物功能多樣性分析

2.3.1 土壤微生物對(duì)碳源利用的整體特征AWCD可以從功能代謝水平上揭示微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性，是反映土壤微生物群落對(duì)碳源利用整體情況及利用活性的重要指標(biāo)[26]。本研究用各植株根區(qū)土壤微生物平均吸光度值 (AWCD) 隨培養(yǎng)時(shí)間變化的趨勢(shì)，來(lái)表征不同石油污染脅迫水平下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性，各植株根區(qū)土壤微生物群落培養(yǎng)過(guò)程中AWCD在不同石油污染脅迫水平下的變化趨勢(shì)見(jiàn)圖2～7。

圖2 無(wú)石油污染脅迫條件下不同植株根區(qū)土壤微生物群落培養(yǎng)過(guò)程中AWCD的變化

圖4 不同石油污染脅迫水平下油松根區(qū)土壤微生物群落培養(yǎng)過(guò)程中AWCD的變化

圖6 不同石油污染脅迫水平下沙棘根區(qū)土壤微生物群落培養(yǎng)過(guò)程中AWCD的變化

圖2為無(wú)石油污染脅迫條件下不同植株根區(qū)土壤微生物群落培育過(guò)程中AWCD的變化趨勢(shì)。由圖2可知，在無(wú)石油污染脅迫條件下，油松植株根區(qū)的AWCD明顯低于無(wú)植株的對(duì)照；沙棘植株根區(qū)的AWCD接近無(wú)植株的對(duì)照；刺槐與紫穗槐植株根區(qū)的AWCD均高于無(wú)植株的對(duì)照，說(shuō)明刺槐與紫穗槐植株在一定程度上促進(jìn)了根區(qū)土壤微生物對(duì)碳源的利用。

由圖3～7可以看出，不同石油污染脅迫水平下各處理的AWCD隨培養(yǎng)時(shí)間不斷增加；在不同石油污染脅迫水平下，各植株根區(qū)土壤微生物碳源利用的整體情況存在差異?？傮w上，各植株根區(qū)土壤微生物在5～10 g/kg石油污染脅迫水平下對(duì)碳源的利用能力較強(qiáng)，20 g/kg石油污染脅迫水平下碳源利用的能力較弱。結(jié)合微生物區(qū)系及呼吸強(qiáng)度的結(jié)果，推測(cè)造成這一現(xiàn)象的原因可能是，5～10 g/kg的石油污染脅迫為微生物生長(zhǎng)提供了更多的碳源物質(zhì)，從而刺激了微生物生長(zhǎng)，但高水平的石油污染脅迫對(duì)微生物產(chǎn)生了一定程度的毒害作用，使微生物利用碳源的能力有所減弱。

2.3.2 微生物多樣性指數(shù)(H′) 的比較 多樣性指數(shù)可表征不同土壤微生物群落利用碳源類(lèi)型的多少，即功能多樣性[27]。在不同石油污染脅迫水平下，各植株根區(qū)土壤微生物培養(yǎng)96 h時(shí)對(duì)碳源利用的H′見(jiàn)表3。由表3可以看出，在不同石油污染脅迫水平下，栽有植株的根區(qū)土壤微生物H′除油松、沙棘在10～15 g/kg石油污染脅迫水平時(shí)略低于無(wú)植株的對(duì)照外，在其余條件下均高于無(wú)植株對(duì)照。表明試驗(yàn)中所栽植株均能夠有效提高根區(qū)土壤微生物的多樣性，在石油污染脅迫下，其對(duì)根區(qū)土壤微生物的多樣性具有保護(hù)作用。

表 3 不同石油污染脅迫水平下4種植株根區(qū)土壤微生物對(duì)碳源利用的H′

2.3.3 刺槐根區(qū)土壤微生物對(duì)6大類(lèi)型碳源的利用特征AWCD值與H′在總體上反映了土壤中微生物群落的變化情況，但不能闡釋土壤中微生物群落碳源代謝的微觀信息。本研究進(jìn)一步對(duì)土壤中微生物群落利用的碳源進(jìn)行分類(lèi)，并以相對(duì)吸光度值ΔC分析不同處理土樣中微生物群落對(duì)6大類(lèi)型碳源的利用情況，以此反映土壤微生物的代謝功能[28]。由于ECO生態(tài)測(cè)試板培養(yǎng)96 h時(shí)，微生物對(duì)碳源的利用 (即ΔC) 的變化趨于穩(wěn)定，因此對(duì)碳源利用特征的描述選取96 h的ΔC進(jìn)行表征[29]。由于在同一石油污染脅迫水平下，刺槐植株根區(qū)土壤微生物較其他3種植株既表現(xiàn)出代表性的變化趨勢(shì)，又具有更高活力，所以以刺槐植株根區(qū)土壤微生物的碳源利用特征為例進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 不同石油污染脅迫水平下刺槐根區(qū)土壤微生物對(duì)6類(lèi)碳源的利用情況

由圖8可以看出，隨石油污染脅迫水平的提高，刺槐根區(qū)土壤微生物對(duì)碳水化合物類(lèi)群的利用率逐漸降低，表明石油污染脅迫對(duì)根區(qū)土壤微生物利用碳水化合物類(lèi)碳源產(chǎn)生了抑制作用；刺槐根區(qū)土壤微生物對(duì)多聚物類(lèi)及胺類(lèi)的利用趨勢(shì)類(lèi)似，均先隨石油污染脅迫水平增加而提高，在10 g/kg石油污染脅迫水平時(shí)ΔC達(dá)到最大值，其后隨石油污染脅迫水平的增加利用率有所降低，表明一定水平的石油污染脅迫刺激了根區(qū)土壤中多聚物類(lèi)群及胺類(lèi)群微生物的生長(zhǎng)，但過(guò)高水平的石油污染脅迫則會(huì)產(chǎn)生抑制作用；刺槐根區(qū)土壤微生物對(duì)羧酸類(lèi)與酚酸類(lèi)碳源利用的ΔC在5 g/kg石油污染脅迫水平時(shí)最大，20 g/kg石油污染脅迫水平時(shí)最小，酚酸類(lèi)群此時(shí)的ΔC甚至為0，表明20 g/kg高石油污染脅迫水平對(duì)根區(qū)土壤中羧酸類(lèi)群與酚酸類(lèi)群微生物的生長(zhǎng)產(chǎn)生了極強(qiáng)的抑制作用?？傮w上，一定水平的石油污染脅迫能夠促進(jìn)根區(qū)土壤微生物對(duì)碳源的利用，但15～20 g/kg石油污染脅迫水平會(huì)對(duì)根區(qū)土壤微生物利用碳源產(chǎn)生抑制作用，其中20 g/kg石油污染脅迫水平對(duì)微生物類(lèi)群產(chǎn)生的毒害作用最大，推測(cè)20 g/kg石油污染脅迫水平可能已經(jīng)達(dá)到部分根區(qū)土壤微生物耐受的上限。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在同一石油污染脅迫水平下，刺槐根區(qū)土壤微生物利用不同碳源的程度有明顯差異：無(wú)石油污染脅迫條件下的優(yōu)勢(shì)群落結(jié)構(gòu)為碳水化合物類(lèi)群>多聚物類(lèi)群>氨基酸類(lèi)群；5 g/kg石油污染脅迫水平下的優(yōu)勢(shì)群落結(jié)構(gòu)為碳水化合物類(lèi)群>多聚物類(lèi)群>酚酸類(lèi)群；10 g/kg石油污染脅迫水平下的優(yōu)勢(shì)群落結(jié)構(gòu)為多聚物類(lèi)群>碳水化合物類(lèi)群>胺類(lèi)群；15～20 g/kg 石油污染脅迫水平下的優(yōu)勢(shì)群落結(jié)構(gòu)為碳水化合物類(lèi)群>多聚物類(lèi)群>氨基酸類(lèi)群(圖8)。由此可以看出，在同一石油污染脅迫水平下，刺槐植株根區(qū)土壤微生物偏向利用碳水化合物類(lèi)和多聚物類(lèi)碳源，推測(cè)該部分碳源可能是某些根區(qū)土壤微生物生長(zhǎng)的必需物質(zhì)。

2.3.4 土壤微生物功能多樣性的主成分分析 Biolog ECO生態(tài)測(cè)試板共有31種不同的碳源，即31個(gè)變量。如果評(píng)估微生物功能多樣性變化的過(guò)程中考慮全部變量，往往會(huì)使分析過(guò)程更為復(fù)雜，因此利用主成分分析法，通過(guò)對(duì)變量的分析整合，將其合并為若干個(gè)綜合變量，這些綜合變量具有較高的方差貢獻(xiàn)率，提取綜合變量中的若干個(gè)主成分就可以對(duì)整個(gè)樣本進(jìn)行分析，以此達(dá)到降維并降低評(píng)估復(fù)雜性的目的[30]。本研究選取刺槐根區(qū)土壤微生物培養(yǎng)96 h后測(cè)得的吸光度值進(jìn)行主成分分析，以貢獻(xiàn)率最高的主成分 (PC1和PC2) 在空間中的位置，描述不同石油污染脅迫水平下根區(qū)土壤微生物功能多樣性的差異，結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 不同石油污染脅迫水平下刺槐根區(qū)土壤微生物功能多樣性的主成分分析

在PCA中，31個(gè)主成分因子中前13個(gè)因子的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)99.505%，從中提取可以聚集單一碳源變量數(shù)據(jù)變異的前2個(gè)主成分PC1和PC2，其累計(jì)方差貢獻(xiàn)率分別為33.70%，21.68%，因此認(rèn)為這2個(gè)主成分可以表征不同石油污染脅迫水平下刺槐根區(qū)土壤微生物群落代謝能力的基本輪廓。由圖9可見(jiàn)，不同石油污染脅迫水平下的刺槐根區(qū)土壤微生物功能多樣性在主成分坐標(biāo)體系中分布差異明顯。PC1的方差貢獻(xiàn)率最大，可將10 g/kg石油污染脅迫水平與0，20 g/kg石油污染脅迫水平明顯區(qū)分；其中，10 g/kg石油污染脅迫水平處于PC1的正端，在PC1軸上值達(dá)1.64。PC2可將0 g/kg石油污染脅迫水平與其他石油污染脅迫水平區(qū)分；其中，僅0 g/kg石油污染脅迫水平處于PC2正軸方向，在PC2軸上的值為1.74。

單一碳源在主成分PC1和PC2上的載荷因子，反映了主成分與該單一碳源利用的相關(guān)系數(shù)，載荷因子越大，表示該單一碳源對(duì)主成分的影響越大。表4顯示了不同石油污染脅迫水平下刺槐植株根區(qū)土壤微生物對(duì)31種碳源的利用情況在PC1及PC2上的載荷因子。由表4可知，單一碳源對(duì)PC1貢獻(xiàn)最大的6種碳源分別為2類(lèi)氨基酸 (L-苯丙氨酸、L-絲氨酸)、3類(lèi)多聚物 (吐溫40、吐溫80、肝糖)、1類(lèi)羧酸 (D-半乳糖醛酸)，可見(jiàn)影響PC1的碳源主要為多聚物類(lèi)和氨基酸類(lèi)；單一碳源對(duì)PC2貢獻(xiàn)最大的6種碳源包含4類(lèi)碳水化合物 (N-乙酰-D-葡萄糖胺、β-甲基-D-葡萄糖苷、α-D-乳糖、D-纖維二糖)、1類(lèi)氨基酸 (L-精氨酸)、1類(lèi)羧酸 (衣康酸)，可見(jiàn)影響PC2的碳源主要為碳水化合物類(lèi)。

表4 刺槐植株根區(qū)土壤微生物對(duì)31種碳源利用情況的主成分載荷因子

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，5～10 g/kg石油污染脅迫水平增加了土壤微生物的種類(lèi)，且在該石油污染脅迫水平下土壤微生物對(duì)碳源的利用能力較強(qiáng)。岳冰冰等[31]的Biolog微平板分析結(jié)果顯示，石油污染明顯提高了土壤微生物群落的代謝活性，馬會(huì)強(qiáng)等[13]的研究也有類(lèi)似的結(jié)果。李慧等[32]的研究認(rèn)為，石油污染可顯著提高土壤微生物 (細(xì)菌、放線菌、真菌) 的數(shù)量。本試驗(yàn)再次證實(shí)，一定水平的石油污染脅迫對(duì)土壤微生物多樣性具有促進(jìn)作用。同時(shí)，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，10 g/kg以上石油污染脅迫水平，對(duì)各植株根區(qū)土壤微生物的碳源利用具有抑制作用。原因可能是，高水平石油污染脅迫自身的毒害作用及其對(duì)原本適合大部分微生物生長(zhǎng)的土壤理化條件的改變作用，使大部分微生物生長(zhǎng)受到抑制，植株根區(qū)土壤中的大部分微生物難以適應(yīng)這種高水平的石油污染脅迫。

本研究發(fā)現(xiàn)，栽有植株的根區(qū)土壤微生物多樣性及碳源利用能力整體高于無(wú)植株對(duì)照土壤，說(shuō)明4種供試植株對(duì)土壤微生物多樣性具有一定的保護(hù)作用，這種保護(hù)作用在高水平石油污染脅迫下表現(xiàn)更為明顯，這一結(jié)論對(duì)環(huán)境保護(hù)及污染環(huán)境的修復(fù)具有重要的指導(dǎo)意義。推測(cè)供試植株對(duì)土壤微生物多樣性形成保護(hù)作用的原因可能為，植株根系降解了部分石油污染物質(zhì)，減弱了石油污染對(duì)土壤中微生物的脅迫作用，維護(hù)了微生物的生長(zhǎng)環(huán)境。本研究還發(fā)現(xiàn)，4種供試植株根區(qū)土壤微生物對(duì)石油污染脅迫具有不同的響應(yīng)；其中，栽植刺槐的植株根區(qū)土壤微生物多樣性最為豐富，因此認(rèn)為刺槐植株在石油污染土壤修復(fù)中占有優(yōu)勢(shì)。

4 結(jié) 論

4種供試植株均能提高石油污染脅迫下根區(qū)土壤微生物的多樣性，其中刺槐植株對(duì)根區(qū)土壤微生物多樣性的保護(hù)作用最強(qiáng)。因此從微生物角度來(lái)看，在石油污染土壤生物修復(fù)中選擇栽植刺槐植株將會(huì)具有較為理想的效果；5～10 g/kg石油污染脅迫水平能促進(jìn)土壤微生物對(duì)碳源的利用，增加土壤微生物的種類(lèi)，15～20 g/kg石油污染脅迫水平降低了土壤微生物的多樣性，對(duì)微生物生長(zhǎng)產(chǎn)生毒害作用。

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