姜辰 韓園 唐娟娟 劉文濤 張廣欽

以嗎啡為代表的阿片類藥物具有強效的鎮(zhèn)痛作用，是臨床上治療重度疼痛的重要藥物，但是多次給藥以后，其鎮(zhèn)痛作用極易耐受，這顯著抑制了阿片類藥物的有效使用。嗎啡耐受的機制尚不明確，以往認為嗎啡耐受主要是由神經元機制所介導。最近的證據表明，膠質細胞的活化，尤其是小膠質細胞的活化，在嗎啡的耐受過程中同樣起著重要作用?；罨男∧z質細胞分泌大量炎癥因子，如白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)，敏化脊髓背角的神經元進而大大減弱了嗎啡的鎮(zhèn)痛作用[1,2]。

核因子κB(NF-κB)廣泛存在于真核細胞，是一多功能的核轉錄因子，它參與免疫應答、炎癥反應、調控細胞的增殖與凋亡[3]。NF-κB核轉位后，會促進免疫細胞炎癥因子生成增多。吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)是一種抗氧化劑，它是NF-κB特異性的抑制劑，主要通過抑制NF-κB P65亞單位，或抑制IκB的降解，減少NF-κB的核移位來抑制NF-κB的活性。

最近有文獻報道，嗎啡耐受模型中，脊髓背角中的小膠作者單位：211198 中國藥科大學臨床藥學教研室(姜辰 張廣欽)；徐州醫(yī)學院，江蘇省麻醉學重點實驗室(韓園)；南京中醫(yī)藥大學，生理學教研室(唐娟娟);南京醫(yī)科大學，江蘇省神經退行性疾病重點實驗室(劉文濤)

質細胞伴隨著NF-κB核轉位的增多現象，提示小膠質細胞中的NF-κB可能參與嗎啡耐受進程。但是抑制NF-κB能否減輕嗎啡導致的小膠質細胞活化缺少直接證據。作者應用實時定量PCR方法檢測嗎啡對BV-2細胞前炎癥因子mRNA水平的影響，并給予NF-κB特異性的抑制劑-PDTC進行干預，考察PDTC對嗎啡引起B(yǎng)V-2細胞炎癥因子合成的影響。

1 材料

1.1藥物 嗎啡，沈陽第一制藥廠，東北制藥集團公司(中國)。PDTC，sigma(美國)。

1.2細胞BV-2小鼠源小膠質細胞，購自上海中國科學院。

1.3儀器 7300 Real-time PCR 系統(tǒng)(Applied Biosystems, Warrington, 英國)。

2 方法與結果

2.2細胞培養(yǎng) BV-2細胞在5%CO2和95%O237℃潮濕環(huán)境含10%胎牛血清(Hyclone, USA)和1%青鏈霉素(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)的培養(yǎng)基(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中培養(yǎng)。實驗前24 h，將培養(yǎng)基換成0.5%胎牛血清高糖DMEM。

2.3PDTC對嗎啡誘導的BV-2細胞炎癥因子釋放的影響 實驗采用實時定量PCR檢測mRNA水平。具體方法如下：BV-2細胞隨機分為對照組、嗎啡模型組、嗎啡PDTC治療組和PDTC組。模型組嗎啡200μM培養(yǎng)6 h；PDTC治療組采用PDTC 30μM在嗎啡前30 min預給藥，與嗎啡共培養(yǎng)6 h；PDTC組給予PDTC 30μM培養(yǎng)6 h。培養(yǎng)的細胞應用Trizol法抽提各組細胞RNA，Real-time PCR應用7300 Real-time PCR 系統(tǒng)。表1中列出特異性IL-1β、IL-6、TNF-α和GAPDH引物序列。實時PCR實驗方案如下：95℃ 10 min，40個循環(huán)：60℃ 60s，95℃ 15 s，溶解曲線60～90℃保證擴增為單一產物。以Ct值進行結果分析，采用相對量法與內參GAPDH比較。計算公式為：2-ΔCT, Δ Ct=Ct gene-Ct control。

表1 IL-1β、IL-6、TNF-α和GAPDH mRNA實時PCR引物序列

結果可見，與對照組比較，BV-2細胞炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平均可被嗎啡處理誘導升高(P< 0.01，見圖1、圖2、圖3)，PDTC顯著抑制了這一升高(P< 0.05，見圖1、圖2、圖3)，并且PDTC基礎給藥不影響B(tài)V-2細胞炎癥因子mRNA水平(P> 0.05，見圖1、圖2、圖3)。結果表明，PDTC能抑制嗎啡誘導的小膠質細胞炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的合成。

注：***P<0.01與未處理對照組比較，#P< 0.05與嗎啡造模組比較

注：**P<0.01與未處理對照組比較，#P< 0.05與嗎啡造模組比較

注：**P<0.01與未處理對照組比較，##P<0.01與嗎啡造模組比較

3 討論

在這篇研究中，作者發(fā)現嗎啡可以在體外直接導致小膠質細胞系BV-2細胞的IL-1β、IL-6和TNF-α合成增多，并且PDTC可以顯著抑制嗎啡導致炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α合成增多。

脊髓小膠質細胞活化在嗎啡耐受的發(fā)展中起著重要作用。嗎啡處理能誘導脊髓小膠質的顯著活化，強烈活化的小膠質細胞能分泌大量促炎癥細胞因子和炎癥趨化因子，例如IL-1β、IL-6和TNF-α，這些最終調節(jié)脊髓突觸傳遞，導致背角神經元興奮性的增加；另一方面，神經元的興奮性增高，可以通過釋放NO、興奮性氨基酸，如谷氨酸等，進一步活化周圍的小膠質和星形膠質細胞形成正反饋，進而導致強烈持久的神經炎癥[4,5]。研究發(fā)現，鞘內注射米諾環(huán)素(小膠質細胞抑制劑)或抑制炎癥細胞因子的釋放均能顯著抑制嗎啡耐受的發(fā)展，增強嗎啡鎮(zhèn)痛作用。因此控制小膠質細胞的活化和炎癥因子的生成具有重要意義。

NF-κB是小膠質細胞內一類重要的轉錄調節(jié)因子[6]。在細胞應激等條件，NF-κB由IKKβ等激活而發(fā)生核轉位，進而誘導促炎細胞因子(尤其是IL-1β)合成。作者首次證實：NF-κB抑制劑PDTC可顯著減少嗎啡誘導的炎癥因子的生成，這一研究提示：PDTC可能對于增強嗎啡鎮(zhèn)痛作用具有積極作用，但是關于PDTC改善嗎啡鎮(zhèn)痛作用的詳細分子機制，仍需更深層次的研究和探討。

綜上所述，本文證實了PDTC能通過抑制NF-κB核轉位顯著降低嗎啡導致的小膠質細胞炎癥因子合成。該研究可能為減少阿片類藥物的副反應，增強鎮(zhèn)痛效果提供新的思路和靶標。

[1] F. Ferrini, T. Trang, T.A. Mattioli, et al. Morphine hyperalgesia gated through microglia-mediated disruption of neuronal Cl(-) homeostasis. Nat Neurosci, 2013(16):183-192.

[2] T. Berta, T. Liu, Y.C. Liu, et al. Acute morphine activates satellite glial cells and up-regulates IL-1beta in dorsal root ganglia in mice via matrix metalloprotease-9. Mol Pain, 2012(8):18.

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[4] Shavit Y, Wolf G, Goshen I, et al. Interleukin-1 antagonizes morphine analgesia and underlies morphine tolerance. Pain, 2005(115): 50-59.

[5] Sun J, Liu S, Mata M, et al. Transgene-mediated expression of tumor necrosis factor soluble receptor attenuates morphine tolerance in rats. Gene therapy, 2012(19):101-108.

[6] Rius J, Guma M, Schachtrup C, et al. NF-kappaB links innate immunity to the hypoxic response through transcriptional regulation of HIF-1alpha. Nature, 2008(453):807-811.