劉桓江 綜述，張 柳，王文雅 審校

（河北聯(lián)合大學附屬醫(yī)院骨科，河北唐山063000）

低位腰痛是椎間盤退變患者就診的最常見起因，也是影響成年人生活和工作能力的重要因素[1]。椎間盤切除術和脊柱融合術是常用的緩解疼痛的方法，但并不能恢復椎間盤的功能[2]。椎間盤源性的疼痛是由椎間盤炎癥、神經(jīng)支配增多以及椎間盤負荷過度引起的。椎間盤疾病的生物學療法近來被廣泛研究，修復和重塑椎間盤主要通過以下3條途經(jīng)：生物分子療法、細胞療法、組織工程方法。以下將總結(jié)各種方法最新的研究進展，并且重點總結(jié)其應用優(yōu)勢和局限性。

1 生物分子療法

合成代謝和分解代謝的平衡是維持健康椎間盤內(nèi)環(huán)境的重要因素，打破平衡會導致細胞外基質(zhì)的流失。生物分子療法的目的是誘導細胞減少分解因子的產(chǎn)生，或者增加合成因子的產(chǎn)生，從而促使細胞外基質(zhì)再生。生物分子和基因療法能夠在蛋白和基因水平改變細胞生物合成。若使這些方法有效，必須在組織中有大量的可利用細胞，使靶分子得到重組表達。由于這些原因，既往研究認為分子生物學療法在椎間盤退變的早期階段更有效。以下是幾種分子生物學方法治療椎間盤退變的研究。

1.1 促進基質(zhì)合成代謝 生長因子通過刺激基質(zhì)合成進而調(diào)節(jié)椎間盤細胞新陳代謝。轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor-β，TGF-β）和骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMPs）能夠通過調(diào)節(jié)椎間盤細胞中糖胺聚糖、蛋白多糖、Sox9和2型膠原的含量促進軟骨的形成[3-4]。當把動物的髓核細胞培養(yǎng)在含有TGF-β和BMP-2的培養(yǎng)基中時，二者能正向調(diào)節(jié)1型膠原、糖胺聚糖及2型膠原mRNA的表達[5]。血小板衍生因子（platelet derived growth factor，PDGF）、成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和胰島素樣生長因子（insulinlike growth factor，IGF-1）這3種蛋白分裂素，已經(jīng)被證實能刺激牛髓核細胞增殖。最近，Kim等[6]證實IGF-1在牛的髓核細胞中能夠增強合成代謝，并能提高BMP-7的作用。Gruber等[7]研究發(fā)現(xiàn)，當退變的纖維環(huán)細胞處于IGF-1和PDGF中時，細胞凋亡加強。Wang等[8]把BMP-7和動物椎間盤細胞培養(yǎng)在藻酸鹽凝膠中，證實能促進蛋白多糖合成。Masuda等[9]在動物的椎間盤退變模型中注射BMP-7，椎間盤的生物化學成分得到修復。Imai等[10]將人重組BMP-7注射進動物的椎間盤中，增加了椎間盤高度。相對于重組生長因子而言，合成肽可能是一種更有效更安全的生物分子。已證實Link N是一種具有類似生長因子功能的合成肽，能有效刺激糖胺聚糖基因表達并且抑制蛋白酶的表達[11-12]。

1.2 基因療法 由于生物分子半衰期較短，所以研究一種長效的治療方法顯得尤為重要?；虔煼ㄒ呀?jīng)被用作一種增強椎間盤細胞新陳代謝的方法。慢病毒載體和腺病毒相關載體（adenoviral-associated vectors，AAV）已經(jīng)被應用于修復椎間盤組織。Leckie等[13]發(fā)現(xiàn)，AVV2能引起椎間盤細胞產(chǎn)生BMP-2或TIMP-1蛋白，延緩退變。但是在這些載體應用于臨床之前其本身的免疫原型和其基因產(chǎn)物的長期療效仍然是一個亟待解決的問題。

1.3 抑制基質(zhì)分解代謝 促炎因子已經(jīng)被證實能促使椎間盤退變，并且與退變時間相關。退變椎間盤細胞產(chǎn)生的IL-1和腫瘤壞死因子α（TNF-α），均是蛋白酶的間接產(chǎn)物，而且基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和蛋白聚糖酶能夠分解基質(zhì)。最近Sinclair等[14]在體外實驗中證實可溶性TNF-α受體能明顯減弱TNF-α在人椎間盤細胞中的作用，并且在一定程度上可以下調(diào)NO、PGE2和IL-6。Chubinskaya等[15]在一個大鼠椎間盤退變模型中證實BMP-7通過降低蛋白酶和細胞因子及疼痛相關蛋白水平使分解代謝降低。在椎間盤退變過程中siRNA分子能抑制干擾蛋白。在動物椎間盤退變模型中，Seki等[16]證實單獨注射蛋白聚糖酶siRNA能抑制退變并且能重塑髓核組織。這些療法的重點是提高髓核細胞的代謝功能而不增加細胞數(shù)量，但是細胞功能降低、營養(yǎng)缺乏、低氧及衰老這些因素都會使療效下降。因此生物療法聯(lián)合細胞或生物材料成為新的趨勢。

2 細胞療法

退變的椎間盤細胞失去自身修復能力，所以細胞移植能夠提供健康細胞用來再生細胞外基質(zhì)。有學者認為椎間盤退變起始在髓核，因此合成蛋白多糖、膠原和基質(zhì)蛋白的各種細胞之間具有較高關聯(lián)性。此類細胞具有成熟椎間盤細胞、關節(jié)軟骨細胞和間充質(zhì)干細胞（MSCs）的所有表型[17]。

2.1 椎間盤細胞 分化的椎間盤細胞能合成必需的細胞外基質(zhì)分子，用于治療或重建椎間盤微環(huán)境。在沙鼠等椎間盤退變模型中，椎間盤細胞能限制基質(zhì)破壞，促進椎間盤高度恢復，并能合成新的蛋白多糖和1、2型膠原[18]。Benz等[19]發(fā)現(xiàn)，羊的椎間盤能自發(fā)修復，但是椎間盤細胞的注入加速了修復過程。在臨床試驗中，通過微創(chuàng)術將移植細胞注入到患者體內(nèi)，疼痛癥狀明顯緩解。在注入細胞2年后，相對那些單純做椎間盤切除術的患者椎間盤液體含量增加。但這種方法需要獲得椎間盤細胞，因此這就會導致2次創(chuàng)傷性手術，增加了感染和損傷神經(jīng)根的概率。況且，在體外培養(yǎng)時，從患者退變組織獲得的椎間盤細胞分化能力不強，并且喪失了產(chǎn)生糖胺聚糖和2型膠原的能力[20]。盡管椎間盤細胞能通過生物分子或者3D培養(yǎng)再分化，但是這并不能達到正常細胞水平[21-22]。由于這些原因，軟骨細胞和間充質(zhì)干細胞成為新的研究方向。

2.2 軟骨細胞 近來，在豬去髓核模型中，將培養(yǎng)的自體軟骨細胞運送到體內(nèi)3個月后，軟骨形成密度增加，并且在移植12個月后細胞活力上升[23]。Arana等[24]在體外實驗中發(fā)現(xiàn)軟骨組織通過調(diào)節(jié)炎性反應能刺激髓核細胞合成。然而軟骨細胞產(chǎn)生的蛋白多糖與膠原的比值比髓核細胞低。與髓核細胞相似，軟骨細胞移植也面臨一樣多的問題（如二次創(chuàng)傷和供體組織的缺乏），因此軟骨細胞可能并不是最好的細胞療法。

2.3 間充質(zhì)干細胞 Jin等[25]認為，MSCs是椎間盤修復更好的選擇，因為這些細胞有單獨分化的能力并且能在椎間盤基質(zhì)中產(chǎn)生蛋白多糖和膠原。MSCs的獲取途徑很多，可以提供合適的自體細胞來源。而且能在體外擴增到臨床所需要的數(shù)量并能以未分化祖細胞的形式注射到體內(nèi)，分化成與椎間盤細胞相類似的表型。在動物的退變模型中，與沒有注射組相比，MSCs注射組最小化了椎間盤高度的降低，并使GAG的水平在16周后增加，而干細胞組和髓核細胞注射組差異無統(tǒng)計學意義[26]。在體外實驗中，當與健康髓核細胞共同培養(yǎng)時，MSCs分化成一種類似髓核細胞的表型，有抑制糖胺聚糖和SOX9的作用。當MSCs與退變的髓核細胞一起培養(yǎng)時，髓核細胞能產(chǎn)生更多的蛋白多糖和膠原。最近的研究發(fā)現(xiàn)MSCs和髓核細胞的主要聯(lián)系是二者膜成分的雙向改變[27-29]。MSCs不僅具有促進基質(zhì)合成作用，還可以降低椎間盤中的炎性反應[30]。在體外培養(yǎng)中，干細胞能誘導髓核細胞抑制基質(zhì)退變的相關分子基因的表達，如MMPs和炎癥因子。干細胞的免疫調(diào)節(jié)作用，包括其表達Fas配體（免疫細胞中一種跨膜蛋白）的能力，是通過合成抗免疫反應因子（尤其是TGF-β）來降低免疫反應的[31]。然而對體內(nèi)干細胞產(chǎn)生抗免疫反應因子的機制還不是完全明白。自體MSCs療法是有效的，能明顯緩解疼痛降低殘疾率，并且沒有并發(fā)癥，能使椎間盤中液體含量明顯增加，然而椎間盤高度在治療12個月后沒有增加。這與先前的動物實驗結(jié)果一致，MSCs能抑制椎間盤脫水的過程并能誘導水分的獲取。自體MSCs注入到兩位椎間盤退變患者2年后，其疼痛癥狀減輕并且椎間盤液體含量增多。然而這些研究周期較短，并且患者數(shù)量較少，難以確定感染和其他并發(fā)癥的發(fā)生風險。然而MSCs抑制的長期療效和分化能力還需要進一步研究。

3 組織工程療法

單純地將生物分子和細胞共同注射進椎間盤雖然可以再生組織，但是退變早期細胞和基質(zhì)流失嚴重，此時需要大量的因子和細胞。因此組織工程將細胞、運載支架、生物力學和生物化學條件相結(jié)合，其優(yōu)點是可整合并重塑椎間盤結(jié)構及功能。

3.1 仿生學方法模擬椎間盤組織 支架結(jié)構作為細胞附著和引導組織生長的一種支撐，如果惰性植入則只提供生理支撐，沒有轉(zhuǎn)變細胞生物活性的作用；如果活性植入，會產(chǎn)生生物活性分子引導細胞生物合成。理想的支架既可以提供生物力學作用，又可以使新基質(zhì)沉積而增強負荷能力。水凝膠支架可以保持新沉積的蛋白多糖含量。含藻酸鹽和瓊脂糖并以水凝膠為基礎的培養(yǎng)基已經(jīng)應用于髓核培養(yǎng)。水凝膠由透明質(zhì)酸組成，可以保持髓核表型，并維持其生物力學。最近的研究的熱點是如何提高支架材料性能，嘗試聯(lián)合膠原分子或聚合凝膠的方法提高拉力并壓縮機械組成。EP依附于纖維環(huán)和髓核纖維，并且與椎體相鄰近。Fernando等[32]用一種混合模型，證實EP能提供一種黏附力，能夠減弱在骨與椎間盤連接處的負荷。EP細胞含有特殊因子，能刺激蛋白多糖合成，并能抑制TNF-α，說明髓核與EP在內(nèi)環(huán)境中存在交聯(lián)。另外，在組織生長和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中，人造生物反應器能被用于再生其物理功能。See等[33]將MSCs培養(yǎng)在含絲的支架中，其周圍被一個硅做的椎間盤包繞，形成一種類似椎間盤結(jié)構的東西。將其培養(yǎng)在一種自定義的生物反應器中，持續(xù)壓縮椎間盤4周，這種結(jié)構被徑向拉伸，導致2型膠原和細胞外基質(zhì)增加，使之與內(nèi)層纖維環(huán)相似。因此，生物反應器可以應用于工程組織，其性能更接近于正常的組織。

3.2 臨床移植的障礙 組織工程仍然處于起步階段，組織工程治療中支架材料的切開移植勢必損傷原本完整的纖維環(huán)結(jié)構，引起炎性反應，從而加重椎間盤退變。另外載體支架的仿生學性能并未達到我們的期望，在今后的研究中組織工程將會完善這些問題，為臨床治療提供更有力的保障。

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