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蛹蟲草多糖提取及其免疫功能研究進展

2014-03-25 12:14占鵬飛徐森華施國方李玉峰馮建琴費建明
蠶桑通報 2014年2期
關(guān)鍵詞:蟲草多糖

占鵬飛,徐森華,施國方,李玉峰,馮建琴,費建明

(湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江 湖州 313000)

蛹蟲草多糖提取及其免疫功能研究進展

占鵬飛,徐森華,施國方,李玉峰,馮建琴,費建明

(湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江 湖州 313000)

蛹蟲草多糖作為一種生理活性物質(zhì),能促進T淋巴細胞、巨噬細胞、白細胞的增殖分化,產(chǎn)生各種免疫活性因子,發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用;還具有保護肝臟、腎臟、降血糖、抗衰老等作用,近年來日益受到人們的重視。本文概述了蛹蟲草多糖的提取方法及其免疫功能的研究狀況。

蛹蟲草多糖;提取;免疫功能

蛹蟲草(Cordyceps militaris),亦稱北冬蟲夏草,是寄生于夜蛾科等蛹體上的不同于冬蟲夏草的另一種蟲草。蛹蟲草的藥用價值較高,據(jù)《新華本草綱目》記載:“蛹蟲草味甘,性平,有益肝腎,補精髓,止血化痰功能?!庇嘘P(guān)研究表明,蛹蟲草含有蟲草酸、蟲草素、蟲草多糖和超氧化物歧化酶等生物活性物質(zhì),蛋白質(zhì)、脂類、糖類、維生素及對人體有益的微量元素含量也十分豐富[1,2]。

蛹蟲草中含有豐富的功能性成分蟲草多糖,現(xiàn)代免疫藥理學(xué)研究表明,蛹蟲草多糖能引起T淋巴細胞、自然殺傷(NK)細胞、單核細胞和巨噬細胞的活化及增殖,并分泌各種淋巴因子。蟲草多糖主要是通過活化免疫因子和促進細胞因子生成等途徑對免疫系統(tǒng)發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用[3-4],多年來科學(xué)家對其提取、純化及應(yīng)用進行了廣泛的研究。本文就蛹蟲草多糖提取及其免疫功能研究作一概述。

1 蛹蟲草多糖的提取

1.1 一般提取法

多糖的提取通常采用水煮醇沉的常規(guī)方法,蛹蟲草多糖提取一般先用乙醚脫脂,再經(jīng)熱水提取、乙醇沉淀得粗多糖。不同研究者用的提取方法不同,所得粗多糖得率也不同,此提取方法簡單、方便但所獲得的目標產(chǎn)物純度不太高,需進一步純化。

季暉等[5]取人工蟲草菌絲干粉200 g,經(jīng)100%乙醇、70%乙醇索氏提取后,殘渣用熱水反復(fù)提取(10 h×5次),提取液用自來水透析2 d,再用無離子水透析2 d,合并未透析部分稍加濃縮后,加入2倍體積的乙醇,離心收集乙醇沉淀,沉淀物用水洗滌濃縮后真空干燥,即得粗多糖,產(chǎn)率6.67%。

馬成堅等[6]取蛹蟲草膠囊粉末100 g,置于索氏提取器中,加無水乙醚100 ml于圓底燒瓶中,連續(xù)回流提取至無色。藥渣風(fēng)干后用8倍量沸水回流提取2次,每次30 min,趁熱過濾,合并濾液,并將濾液濃縮至15 ml,加乙醇至含醇量80%,于冰箱中靜置過夜,離心過濾,并加0.2%活性炭脫色。沉淀分別用無水乙醇、丙醇依次洗滌3次,每次5 ml,置60℃烘干,得灰白色粗多糖。

姚桂卿等[7]取無雜菌的蛹蟲草發(fā)酵物壓濾,將菌絲體與發(fā)酵液分開,菌絲體加5倍體積的水,90℃~95℃浸煮10 h,浸煮4~5次,浸煮液抽濾,濾液合并,減壓濃縮至一定體積,離心棄去濾渣,向上清液中加3倍體積95%乙醇沉淀過夜,離心,收集沉淀,加丙酮、乙醚反復(fù)洗滌,然后置真空干燥器中抽真空干燥,得粗多糖黃色粉末,得率2.8%。鐘艷梅等[8]對蟲草發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)干燥、粉碎、脫脂、樹脂處理后,進行索氏提取,并除雜、濃縮、離子交換柱分離后確定了最佳的提取分離條件:料水比為1∶16,離子柱pH為3.5,洗脫流速為1滴/s。

袁建國等[9]對蟲草多糖的提取進行了研究,研究表明分步提取,提取率可達85%以上,將提取液濃縮加入3倍體積的95%工業(yè)酒精,攪拌靜止沉淀,離心,收集沉淀物。該沉淀物脫水、烘干,得棕褐色粉末狀粗多糖;將粗多糖加水溶解、過濾,取蟲草多糖清液,調(diào)節(jié)濃度至10~15%,通過交換樹脂處理,收集多糖部分液體,將其真空濃縮加酒精沉淀,經(jīng)脫水,干燥后即為脫鹽蟲草多糖。

魯曉巖[10]將子實體干燥樣品磨碎,索氏抽提后,抽提液加活性碳脫色,過濾,80℃水浴濃縮后,加乙醇配置成80%乙醇液,冰箱靜置,過濾,洗滌,將沉淀溶解于80℃水中,然后冷卻再采用Sevag法反復(fù)去蛋白,于水浴上揮發(fā)去有機相,冷卻,定容后得到多糖產(chǎn)品。

余曉斌等[11]通過SAS-RSREG程序計算出回歸方程中各系數(shù),然后以蟲草多糖沉析量回歸模型進行數(shù)學(xué)分析,確定了乙醇,發(fā)酵液(體積比)為3.8∶1,醇析時間為11.7 h,pH值為7.65,蟲草多糖醇析量為11.35 s/L。

1.2 微波輔助提取法

微波輔助提取技術(shù)具有快速、溶劑用量少、提取率高、成本低、質(zhì)量好等優(yōu)點,是天然產(chǎn)物提取中一種非常有發(fā)展?jié)摿Φ男滦图夹g(shù)。比索氏提取法用時短;比超臨界提取法所需的設(shè)備要求低。

譚放等[12]從蛹蟲草深加工綜合利用的角度,利用微波輔助提取多糖,重點考察了液料質(zhì)量比、提取時間、微波功率、物料粒度等因數(shù)對多糖提取效果的影響,將蛹蟲草粉先脫脂再微波提取、濃縮、脫色、沉析、過濾、干燥最終得到蟲草多糖,得到了微波場協(xié)同提取蛹蟲草多糖的最佳工藝條件,具體工藝如下:稱取50 g蛹蟲草粉,用石油醚脫脂后,晾干,加入450 g水,靜置10 min濕潤物料,微波450 w輻射1 min,間隔1 min后再輻射1 min,如此問隔輻射直至總輻射時間達到4 min,過濾。按同樣條件重復(fù)提取操作1次。合并提取液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮到100 ml左右,加入95%的乙醇450 ml以析出沉淀,過濾,用乙醇洗滌多次,沉淀真空干燥后即得多糖,產(chǎn)率15.2%,多糖含量61.6%。結(jié)果表明微波場對蛹蟲草多糖的提取明顯的協(xié)同作用,能降低提取劑的用量、縮短提取時問和提高多糖產(chǎn)率,具有省時、高效、節(jié)能等優(yōu)點,從而降低提取成本,在很多方面優(yōu)于傳統(tǒng)的直接加熱提取法。

2 蛹蟲草多糖的免疫功能

蛹蟲草多糖具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖和提高免疫能力等多種藥理活性,其治療慢性腎炎、急慢性腎功能衰竭、肝損傷、腫瘤、高血脂和高血糖等多種疾病的功用引起眾多學(xué)者的關(guān)注。

2.1 蛹蟲草多糖對免疫器官的作用

鄭賢林等[13]用氫化可的松造模肝損傷小鼠,使其血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic-oxaloacetic transami?nase,AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic-pyruvic transami?nase,ALT)活性顯著升高,通過灌胃給予蛹蟲草菌絲體多糖,發(fā)現(xiàn)小鼠血清AST和ALT活性顯著下降,且呈劑量相關(guān)性。實驗表明蛹蟲草多糖可明顯提高抗氧化劑的水平,降低肝組織丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量,從而減輕了因脂質(zhì)過氧化加劇而造成的肝細胞損傷;肝臟石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)蛹蟲草多糖明顯減輕了氫化可的松引起的肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂、肝竇淤血及肝索排列紊亂等病理變化,顯示出其對氫化可的松造成的肝細胞損傷具有明顯的保護作用。黃軍民、盧建華[14]在四氯化碳(CCl4)損傷的肝細胞中加入蟲草多糖后,發(fā)現(xiàn)隨著劑量加大,細胞培養(yǎng)上清中的肝酶活性逐漸降低,提示其能減輕肝細胞損傷,減少ALT與AST的釋放;并且CP能降低肝細胞內(nèi)的MDA含量,提示CP能有效對抗CCl4引起的脂質(zhì)過氧化作用,減少脂質(zhì)過氧化物的形成。

呂小波等[15]研究發(fā)現(xiàn):蟲草多糖能提高慢性腎功能衰竭大鼠血清超氧化物歧化酶(Superoxide Dis?mutase,SOD酶)活力,同時降低MDA含量,增強機體清除自由基的能力,抑制脂質(zhì)過氧化,進而有效預(yù)防慢性腎功能衰竭的發(fā)生和發(fā)展,改善腎功能,糾正代謝紊亂,促進腎單位的修復(fù)與再生。尹鴻萍等[16]實驗發(fā)現(xiàn),蛹蟲草多糖能夠防治腺嘌呤誘發(fā)的慢性腎功能衰竭,有效預(yù)防慢性腎衰的發(fā)生、發(fā)展,改善腎功能。陳濤等[17]發(fā)現(xiàn)蟲草多糖能夠治療大鼠腎臟部分切除誘發(fā)的慢性腎功能衰竭,改善腎功能,試驗證實蛹蟲草子實體中多糖組分能顯著降低慢性腎衰竭大鼠血尿素氮、肌酐,明顯減輕腎臟的病理損害。

2.2 蛹蟲草多糖對細胞因子的作用

細胞因子是指在細胞間傳遞信息、對細胞起活化作用、并可由多種細胞產(chǎn)生的可溶性多肽分子。蛹蟲草多糖在促進細胞因子的產(chǎn)生方面所起的作用日益受到人們的重視。

靖大道等[18]研究發(fā)現(xiàn),蛹蟲草多糖可單獨或協(xié)同植物血凝素(Phytohaemagglutinin,PHA)誘導(dǎo)人白介素2受體(Interleukin-2,IL-2R)的表達,促進可溶性IL-2R的生成,但對PHA誘生的IL-2、干擾素-γ Interferon-γ,IFN-γ)活性有選擇性抑制作用,其協(xié)同或抑制作用均呈劑量依賴性。有關(guān)研究表明,蛹蟲草多糖在10~50 mg/L濃度時能刺激人外周血單核細胞分泌腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α),在0.1~10 mg/L濃度時能刺激單核細胞生成可溶性白細胞介素-2受體(Soluble interleukin-2 re?ceptor,SIL-2R),且在一定的濃度范圍內(nèi),TNF-γ及SIL-2R的水平隨北蟲草多糖濃度的增加而升高[19]。

方步武等[20]用蛹蟲草多糖治療牛血清白蛋白免疫損傷肝纖維化模型大鼠,結(jié)果表明其能顯著減少轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming growth factor-p,TGF-p)生成與分泌,能夠明顯降低TGF-p mRNA表達。蟲草多糖正是通過影響細胞之間的傳遞介質(zhì)——細胞因子來增加機體內(nèi)抗體(如免疫球蛋白G和免疫球蛋白M)的含量[21]。

2.3 蛹蟲草多糖對腫瘤細胞的免疫作用

蛹蟲草多糖對腫瘤細胞的免疫作用也是蟲草多糖研究的一個熱點。Zhans等[22]觀察到蛹蟲草多糖能顯著增強移植了B16黑素瘤株小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力,促進脾淋巴細胞的增殖,顯著抑制B16細胞向肝肺轉(zhuǎn)移。

袁建國等[23]將S180瘤株配成生理鹽水液,小鼠右前肢腋窩下皮下接種,連續(xù)9 d蛹蟲草多糖灌胃給藥,每日1次,環(huán)磷酰胺腹腔注射,隔日1次,連續(xù)給藥5次,末次給藥6 h后剖取腫瘤稱重,蟲草多糖375 mg/kg時抑瘤率可達45.71%,750 mg/kg蟲草多糖與45 mg/kg環(huán)磷酰胺共同作用比單獨使用環(huán)磷酰胺抑瘤率提高6.84%。趙躍然等[24]以荷瘤BALB/c小鼠為模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)蟲草多糖依量效關(guān)系明顯抑制S180腫瘤生長,增加外周血酸性α-醋酸萘酯酶(Acid αnaphthyl acetate esterase,ANAE)細胞百分率,增強遲發(fā)型超敏反應(yīng)(Delayed type hypersensitivity,DTH)及膜輔因子蛋白(Membrane cofactor protein,Mcp)的吞噬活性。藏其中等[25]研究發(fā)現(xiàn)蟲草多糖對S180細胞的抑制率為16~33%。至于蟲草多糖抑制腫瘤的作用機制,有研究認為是通過刺激細胞因子產(chǎn)生和激活免疫細胞來實現(xiàn)的,也有認為蟲草多糖類成分具有促進免疫細胞的增殖、分泌,增強免疫細胞的功能,是通過宿主介導(dǎo)而發(fā)揮抗腫瘤作用。此外,免疫逃逸是機體免疫功能喪失對腫瘤細胞監(jiān)視作用的重要原因,免疫逃逸現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于腫瘤細胞分泌一種抑制物質(zhì),使其主要組織相容性復(fù)合物(Major histoeompatibility complex,MHC)基因表達下調(diào),或?qū)λ拗鱐細胞分泌的細胞因子反應(yīng)性下降所致。冬蟲夏草提取物可提高腫瘤細胞表面型MHC的表達,使宿主免疫可對MHC-型抗原表達下調(diào)的腫瘤細胞發(fā)揮有效的免疫監(jiān)視作用[26]。

2.4 蛹蟲草多糖的抗氧化及延緩衰老的作用

蛹蟲草多糖能顯著增強肝臟SOD酶活性,促進SOD酶活力,有明顯的抗氧化、清除氧自由基和羥自由基的作用,對延緩衰老有顯著意義[27]。研究證實,蛹蟲草多糖能促進SOD酶活力,具有明顯抗衰老作用。對老年性癡呆的有效率為37.14%,明顯優(yōu)于維生素E同時能提高老齡大鼠SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)活性和明顯降低體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物含量,從而提示蛹蟲草多糖的抗衰老作用是通過抗氧化作用實現(xiàn)的。

李連德等[28]采用從蛹蟲草深層發(fā)酵產(chǎn)物中提取的多糖進行果蠅抗衰老試驗,結(jié)果表明,不同來源的蟲草多糖對果蠅壽命均有不同程度的延長作用,從而證明蟲草多糖有延緩衰老的作用。有的效果還十分顯著,來源于地生枝頂孢的胞內(nèi)、胞外多糖效果最好,并且延壽的效果隨純度的增大而提高。王菊鳳等[29]研究了蛹蟲草多糖對果蠅種群期望壽命的影響。結(jié)果表明:蛹蟲草多糖能顯著提高果蠅種群的期望壽命。0.15%濃度組在果蠅的各個年齡階段的生命期望值都比對照組相應(yīng)的年齡階段高出30%以上,50 d年齡組高出70%多;60 d年齡組則高出100%;且用各種濃度的蛹蟲草多糖喂養(yǎng)的果蠅在老齡后生命力很強,說明蛹蟲草多糖對老齡果蠅的生命有明顯促進作用。

蛹蟲草多糖對皮膚光老化具有保護作用[30]。皮膚老化是機體衰老的重要組成部分,它包括兩個過程:內(nèi)在老化和光老化。蛹蟲草多糖可以使皮膚真皮層厚度保持正常水平,減少炎癥細胞的浸潤,阻止皮脂腺不規(guī)則地增生和纖維組織的疏松紊亂和斷裂,維持正常的纖維細胞形態(tài),防止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少,使羥脯氨酸含量及膠原蛋白含量明顯增加,從而維持皮膚的光澤及彈性,延緩衰老。李華等[31]用8-甲氧補骨脂素聯(lián)合紫外線制備皮膚成纖維細胞氧化模型,探討了蛹蟲草多糖對小鼠皮膚成纖維細胞抗氧化能力的影響。通過檢測對照組、模型組和蛹蟲草多糖保護組的細胞內(nèi)MDA、SOD、過氧化氫酶(Cata?lase,CAT)、GSH-Px含量和測定線粒體跨膜電位的破壞情況,發(fā)現(xiàn)模型組細胞的自由基含量較對照組增多,自由基清除酶系統(tǒng)活力下降,蛹蟲草多糖保護組的自由基含量較模型組低,自由基清除能力也有所改善;線粒體跨膜電位的破壞程度也有所改善。表明蛹蟲草多糖可通過保護線粒體功能增加皮膚成纖維細胞的抗氧化能力,可能為蛹蟲草多糖抗光老化的機制之一。

3 前景與展望

蛹蟲草作為我國傳統(tǒng)名貴的強壯滋補品,在歷史上很早就引起重視和應(yīng)用,近年來由于國家的重視和商業(yè)經(jīng)濟的需求,對蛹蟲草的研究、生產(chǎn)和應(yīng)用取得了迅速的發(fā)展。蛹蟲草多糖作為蟲草中含量最高的生理活性物質(zhì),也是其主要活性成分之一,所以隨著對蛹蟲草多糖研究的不斷深入,利用蛹蟲草多糖開發(fā)的功能性食品添加劑、保健品或藥品的市場前景為人們所看好。對蛹蟲草多糖開展的研究,雖然分離純化的多糖各不相同,但都從不同角度肯定了蛹蟲草多糖的免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤、保護腎臟、肝臟、延緩衰老、抗疲勞等功能,因此,蛹蟲草多糖被業(yè)內(nèi)認為是較好的免疫促進劑之一。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展,利用家蠶、蠶蛹培養(yǎng)蛹蟲草子實體成為獲取蛹蟲草多糖的一條新的途徑。因此,蛹蟲草多糖用于保健食品和醫(yī)藥產(chǎn)品有著廣泛的前景,并將為人類的健康長壽發(fā)揮出重要作用。

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Research Progress on Polysaccharide Extraction of Cordyceps Militaris and Immune Function

ZHAN Peng-fei,XU Sen-hua,SHI Guo-fang,LI Yu-feng,FENG Jian-qin,FEI Jian-ming
(Huzhou Academy of Agricultural Sciences,Huzhou 313000 Zhejiang,China)

Polysaccharide of ccordyceps militaris is a kind of physiological active substances,which can promote prolifer?ation and differentiation of T lymphocytes,macrophages and white blood cells and protect liver,kidney,hypoglycemic, anti-aging effect.In recent years,researcher paid more and more attention on it.This paper outlined the methods extrac?tion and immune function.of polysaccharide of cordyceps militaris.

polysaccharide of cordyceps militaris;extraction;immune function

S886.9

A

0258-4069[2014]02-010-05

湖州市自然科學(xué)資金項目(2012YZ02)

占鵬飛(1982-),男,江西上饒人,農(nóng)藝師,碩士,主要從事家蠶新技術(shù)、新資源開發(fā)研究等。E-mail:fei2533817@163.com

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仙茅多糖對氟尿嘧啶增效減毒作用
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