王立如，徐紹清，沈生初，施 佩，王忠華

(1. 浙江省慈溪市林特技術(shù)推廣中心，浙江 慈溪 315300； 2. 浙江萬里學(xué)院 生物技術(shù)研究所，浙江 寧波 315100)

馬褂木，又稱為鵝掌楸(LiriodendronchinenseSarg.)，為木蘭科(Magnoliaceae)鵝掌楸屬樹種，是珍稀的第三紀(jì)孑遺樹。該屬目前僅存馬褂木和北美鵝掌楸(L.tulipifera)兩種[1]。在中國的12個省(區(qū))84縣(市)有天然分布[2]，被列入同級二級珍稀瀕危保護樹種[3]。另外還有中國著名林木育種學(xué)家葉培忠教授通過人工雜交方法育成的雜交馬褂木(L.chinense× L.tulipifera)[4]。

北美鵝掌楸為落葉喬木，樹高可達60 m，胸徑可達3.5 m以上[1]。該樹種綠樹濃蔭，葉形奇特，具有極高的觀賞價值。另外，該樹種材淡紅褐色，輕軟適中，紋理清晰，結(jié)構(gòu)細(xì)致，輕而強韌，硬度適中，是膠合板的理想原料，也是制家具、縫紉機板、收音機殼與室內(nèi)裝修的良材。

近20年來，國內(nèi)外眾多學(xué)者對鵝掌楸屬植物進行了大量的研究。國外主要是對北美鵝掌楸進行的研究相對比較深入，無論在表型性狀(果長、葉形)、材性、生長量等，還是在蛋白質(zhì)、DNA分子水平上都做了深入的研究[1，5]。國內(nèi)對于馬褂木的研究主要集中在地理分布特征[2，3]、生殖生物學(xué)[6，7]、交配系統(tǒng)[8]、遺傳結(jié)構(gòu)[9，10]、材性[11，12]、育種與繁殖[13-17]、光合作用[18，19]和病原菌[20]等方面。以DNA為基礎(chǔ)的多態(tài)性檢驗是遺傳多樣性檢測的強有力工具，RAPD分子標(biāo)記技術(shù)是常用方法之一，簡單、快速、靈敏。羅光佐等[21]利用RAPD標(biāo)記，對部分群體馬褂木的遺傳多樣性進行了研究。

本課題組自2000年開始引種鵝掌楸屬樹種，包括馬褂木、北美馬褂木、金邊馬褂木和雜交馬褂木等，其中金邊馬褂木是北美馬褂木的栽培品種。金葉馬褂木是2002年從金邊馬褂木的嫁接苗中發(fā)現(xiàn)的全葉為金黃色的芽變材料。目前存圃的8年生金葉馬褂木平均樹高11 m，胸徑12 cm，長勢健壯。本研究以8年生金葉馬褂木、金邊馬褂木、北美馬褂木為實驗材料，對金葉馬褂木的主要生物學(xué)特性進行比較分析，并結(jié)合RAPD技術(shù)進行分子鑒定，為確認(rèn)金葉馬褂木的遺傳變異提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗材料分別為8年生金葉馬褂木、金邊馬褂木、北美馬褂木，樣品采自浙江省慈溪市白沙街道農(nóng)業(yè)園區(qū)馬褂木種植基地。

1.2 方法

1.2.1 生物學(xué)特性調(diào)查

在金葉馬褂木等品種生長初期開始，間隔一定時間用數(shù)顯游標(biāo)卡尺和直尺測量各品種在不同時期葉片的寬度、長度，并以相機采集植株葉片圖像。用葉綠素測定儀SPAD-502(日本生產(chǎn))測定各品種在不同時期的葉綠素含量，進行比較分析。

1.2.2 預(yù)處理

將新鮮材料洗凈擦干后剪碎，放入預(yù)冷的研缽中，加入適量的PVP提取液以及2%的β-巰基乙醇進行快速研磨。研磨成均勻的糊狀后，取適量分裝入1.5 mL的Eppendorf管中，待用。

1.2.3 基因組DNA提取

3個品種的樣品基因組DNA的提取采用改良的CTAB法進行[22]，其步驟如下：1)向上面待用的EP管中加入800 μL預(yù)熱的CTAB提取緩沖液，混勻后65℃水浴1 h，12000 r/min離心15 min；2)取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)輕輕混勻，12000 r/min離心15 min，重復(fù)此步驟1次；3)取上清，加入2/3體積的異丙醇，放入-20 ℃冰箱40 min，沉淀DNA；4)加入200 μL 70%乙醇洗滌DNA 2～3次；5)將1.5 mL Eppendorf管倒置于通風(fēng)柜里，使DNA盡量干燥；6)加入適量的TE，溶解DNA；7)置于4℃冰箱保存，備用。

1.2.4 DNA純度和濃度檢測

DNA 濃度與純度的定性檢測采用瓊脂糖凝膠電泳的方法。取5 μL DNA 樣品，在1%的瓊脂糖下電泳。DNA 濃度與純度的定量檢測采用紫外分光光度法，DNA 的紫外吸收峰在260 nm 波長處。純的DNA 的OD260/OD280應(yīng)該≥1.8。

1.2.5 PCR擴增

選用上海生物工程公司RAPD擴增隨機引物，引物長度10 bp，經(jīng)初步篩選后，選用12個隨機引物，引物名稱與序列見表1。

表1 PCR反應(yīng)引物

本實驗中，RAPD 反應(yīng)總體積為20 μL，反應(yīng)體系見表2。

表2 PCR反應(yīng)體系

反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性45 s，36 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共45個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

1.2.6 PCR產(chǎn)物電泳及顯色

取5 μL PCR擴增產(chǎn)物，用1.2 %瓊脂糖凝膠上電泳，電泳條件為80 V穩(wěn)壓電泳1 h，溴酚蘭作電泳指示劑，緩沖液為1×TBE，紫外凝膠成像儀觀察，用凝膠成像設(shè)備攝像并通過與DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker比較分析結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2003 統(tǒng)計軟件分析和制圖，采用DPS軟件顯著性測定[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片大小變化

如圖1和圖2 所示，3個鵝掌楸屬品種葉片生長發(fā)育過程基本相同，3月底開始萌發(fā)，至5月上旬，為鵝掌楸屬品種葉片增大期，5月中旬開始進入緩慢生長期，6月8日金葉馬褂木、金邊馬褂木、北美馬褂木葉片寬度、長度分別為13.14 cm/11.62 cm、13.21 cm/11.55 cm、13.85 cm/12.2 cm。由此表明3個鵝掌楸屬品種葉片大小差異不大，其中金葉馬褂木、金邊馬褂木葉片比北美馬褂木葉片略小。從圖1和圖2還可看出，在4月16日，北美馬褂木葉片長度和寬度都顯著高于金葉馬褂木和金邊馬褂木，葉片長度F﹡﹡=32.573≥F0.01=4.02，葉片寬度F﹡﹡=23.457≥F0.01=4.02，而后兩者差異不大。這與各品種的基因型差異有關(guān)。

圖1 金葉馬褂木葉片寬度變化

圖2 金葉馬褂木葉片長度變化

2.2 葉片葉綠素含量和色澤變化

如圖3所示，3個鵝掌楸屬品種葉片葉綠素含量變化過程基本相同。即從萌芽展葉至5月上旬，3個鵝掌楸屬品種葉片的葉綠素含量都處于遞增期，5月中旬開始進入穩(wěn)定期，5月20日達到最高值。從對三者的比較可看出，金葉馬褂木葉片葉綠素含量與金邊馬褂木葉片周邊部分葉綠素含量差異不大，而金葉馬褂木葉片葉綠素含量明顯少于金邊馬褂木葉片中間部分和北美馬褂木葉片的葉綠素含量，4月16日F**=611.677≥F0.01=3.96；4月24日F**=661.99≥F0.01=3.97；5月5日F**=325.476≥F0.01=3.96；5月9日F**=84.622≥F0.01=4.03；5月20日F**=62.399≥F0.01=4.01；6月8日F**=196.754≥F0.01=3.94，差異達到極顯著性水平。

圖3 金葉馬褂木葉綠素含量變化

A1—2013年4月11日金葉馬褂木葉色；A2—2013年4月11日金邊馬褂木葉色；B1—2013年4月16日金葉馬褂木葉色；B2—2013年4月16日金邊馬褂木葉色；C1—2013年4月24日金葉馬褂木葉色；C2—2013年4月24日金邊馬褂木葉色；D1—2013年5月9日金葉馬褂木葉色；D2—2013年5月9日金邊馬褂木葉色。

圖4金葉馬褂木與金邊馬褂木的葉色變化對比

Fig 4 The difference of leaf color changes between tulip tree with golden leaves and with golden edge

2.3 3個鵝掌楸屬品種的RAPD分子鑒定

在12個RAPD隨機引物PCR擴增結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有2個RAPD引物OPO16和OPAU19在3個鵝掌楸屬品種中擴增出差異性條帶(圖5)。由圖5可見，上述兩種引物在金葉馬褂木中擴增出與北美馬褂木、金邊馬褂木不同的特異性條帶。因此，RAPD引物OPO16和OPAU19可初步作為區(qū)分金葉馬褂木與北美馬褂木、金邊馬褂木的DNA指紋標(biāo)記。

1～3泳道分別為北美馬褂木(1)、金葉馬褂木(2)和金邊馬褂木(3)樣品；M為標(biāo)記。

圖5 RAPD引物OPO16和OPAU19的PCR擴增結(jié)果

Fig 5 PCR amplification with primers OPO16 and OPAU19

3 結(jié)論與討論

鵝掌楸屬樹種樹形端正，葉形奇特，是優(yōu)美的庭蔭樹和行道樹種，其中馬褂木與懸鈴木(Platanus×acerifolia)、椴樹(Tiliasp.)、銀杏(Ginkgobiloba)、七葉樹(Aesculuschinensis)并稱“世界五大行道樹種”?；ǖS綠色，美而不艷，最宜植于園林中的安靜休息區(qū)的上。秋葉呈黃色，很美麗，可獨栽或群植，在江南自然風(fēng)景區(qū)中可與木荷(Schimasuperba)、山核桃(Caryacathayansis)、板栗(Castaneamollissima)等行混交林式種植。因其花形酷似郁金香(Tulipagesneriana)，故被稱為“中國的郁金香樹(Chinese Tulip Tree)”，是一種非常珍貴的盆景觀賞植物，對SO2等有毒氣體有抗性，可在大氣污染較嚴(yán)重的地區(qū)栽植。

本試驗所選的金葉馬褂木是金邊馬褂木的芽變種，其葉片特性與后者有較大的區(qū)別，即全葉為金黃色。其葉片大小、發(fā)育狀況與金邊馬褂木類似，但葉片葉綠素含量明顯低于后者。由此表明，金葉馬褂木極有可能是一種新的馬褂木種質(zhì)資源。

RAPD技術(shù)可快速、高效地獲得許多個或基因型的多位點DNA序列多態(tài)性信息，是極其有效的DNA遺傳標(biāo)記系統(tǒng)之一。本試驗采用該技術(shù)對金葉馬褂木進行了初步的分子驗證，已成功獲得了差異性標(biāo)記RAPD引物OPO16和OPAU19，為金葉馬褂木作為新的種質(zhì)提供了有力的分子證據(jù)。但RAPD技術(shù)的擴增結(jié)果受到多種因素的影響，如模板DNA、Mg2+、Taq酶、引物以及dNTPs等[24]，因此有必要開展馬褂木RAPD分子鑒定技術(shù)的參數(shù)優(yōu)化研究，為馬褂木的種質(zhì)資源評價與應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

參考文獻：

[1]王章榮,等編著. 鵝掌楸屬樹種雜交育種與利用[M]. 北京：中國林業(yè)出版社, 2005, 16-36.

[2]郝日明,賀善安,湯詩杰,等.鵝掌楸在中國的自然分布及其特點[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報.1995,4(1):1-6.

[3]賀善安,郝日明.中國鵝掌楸自然種群動態(tài)及其致危生境的研究[J].植物生態(tài)學(xué)報,1999,23(1):88-96.

[4]趙書喜.雜交馬褂木的引種與雜種優(yōu)勢利用[J].湖南林業(yè)科技,1989(2):20-21.

[5]王章榮.鵝掌楸屬雜交育種成就與育種策略[J].林業(yè)科技開發(fā),2008,22(5):1-4.

[6]徐 進,王章榮.鵝掌楸屬種間雜種與親本花粉壁的超微結(jié)構(gòu)的比較觀察[J].植物學(xué)通報,2005,22(1):35-38.

[7]黃雙全,郭友好,陳家寬.漸危植物鵝掌楸的授粉率及花粉管生長[J].植物分類學(xué)報,1998,36(4):23-29.

[8]李周岐,王章榮.用RAPD標(biāo)記檢測鵝掌楸屬種間雜交的花粉污染[J].植物學(xué)報,2001,43(12):1271-1274.

[9]董 純,譚德仁,汪長江,等.馬褂木(鵝掌楸)地理種源試驗研究報告[J].湖北林業(yè)科技,1999(01):3-10.

[10]李 斌,顧萬春,夏良放,等.鵝掌楸種源遺傳變異和選擇評價[J].林業(yè)科學(xué)研究,2001,14(3):237-244.

[11]李 斌,顧萬春,譚德仁,等.鵝掌楸種源材性遺傳變異與選擇[J].林業(yè)科學(xué),2001,37(2):42-50.

[12]季孔庶,王章榮,溫小榮.雜交鵝掌楸生長表現(xiàn)及其木材膠合板性能[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2005,29(1):71-74.

[l3]王章榮.中國馬褂木遺傳資源的保存與雜交育種前景[J].林業(yè)科技通訊,1997(09):8-10.

[14]王章榮.鵝掌楸屬(Liriodendron)雜交育種回顧與展望[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2003,27(3):76-78.

[15]程忠生,毛根松.馬褂木種子發(fā)芽試驗簡報[J].浙江林業(yè)科技,1997,17(3):20-25.

[16]陳金慧,張艷娟,李婷婷,等.雜交鵝掌楸體胚發(fā)生過程的起源及發(fā)育過程[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版,2012,36(1):16-20.

[17]葉金山,季孔庶.雜種馬褂木無性系插條生根能力的遺傳變異[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,1998,22(2):71-74.

[18]楊秀艷,季孔庶,王章榮,等.雜交鵝掌楸苗期光合特性的研究[J].西北林學(xué)院學(xué)報,2005,20(02):39-43.

[19]郭志華,張宏達,李志安,等.鵝掌楸(Liriodendronchinense)苗期光合特性的研究[J].生態(tài)學(xué)報,1999,19(2):22-27.

[20]王記祥,馬良進,張立欽,等.馬褂木褐斑病病原的鑒定[J].林業(yè)科學(xué),2013,49(6):189-191.

[21]羅光佐,施季森,尹終明,等.利用RAPD標(biāo)記分析北美鵝掌楸與鵝掌楸種間遺傳多樣性[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報,2000,9(2):9-13.

[22]王廷華,景 強,Pierre D.PCR理論與技術(shù)[M].北京:科學(xué)出版社,2006, 13.

[23]唐啟義,馮明光編著.實用統(tǒng)計分析及其DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)[M]. 北京：科學(xué)出版社, 2002：48-53.

[24]李建民,周志春,吳開云,等.RAPD標(biāo)記研究馬褂木地理種群的遺傳分化[J].林業(yè)科學(xué),2002,38(4):61-66.