任 方，易 忠，郭會玲，魏玉榮，馬文戈，黃 炯＊

（1.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊 830000；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

口蹄疫病毒反向遺傳技術(shù)研究進(jìn)展

任 方1，2，易 忠1，郭會玲1，魏玉榮1，馬文戈1，黃 炯1＊

（1.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊 830000；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一種高度接觸性傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須報告的傳染病之首，其暴發(fā)會嚴(yán)重影響畜牧業(yè)發(fā)展、人民生活以及國民經(jīng)濟。但目前對口蹄疫病毒的了解仍存在盲區(qū)，口蹄疫疫苗還有許多不足。病毒反向遺傳學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展為口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)的深入研究與新型疫苗及其生物制品的研制提供了一種新的高效的技術(shù)方法。論文就國內(nèi)外運用反向遺傳學(xué)技術(shù)對口蹄疫病毒分子致病機理研究及利用反向遺傳學(xué)操作技術(shù)研制新型FMD疫苗進(jìn)行綜述，并且展望口蹄疫病毒反向遺傳學(xué)研究新動向。

口蹄疫病毒；感染性cDNA克??；反向遺傳學(xué)

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）引起的偶蹄動物的烈性高度接觸性傳染病。FMDV隸屬于小RNA病毒科（Picornaviridae）口蹄疫病毒屬（Aphthovirus），有 A、O、C、SAT 1、SAT 2、SAT 3和Asia l共7個不同的血清型。

近年來，F(xiàn)MDV的結(jié)構(gòu)和功能尚未完全闡明，而反向遺傳學(xué)技術(shù)則為我們探知病毒提供了一種高效的方法。目前，利用反向遺傳學(xué)技術(shù)不僅成功獲得了FMDV的感染性分子克隆，而且還可以運用此項技術(shù)研究FMDV的基因結(jié)構(gòu)與功能，病毒復(fù)制與表達(dá)調(diào)控機理、病毒與宿主的相互作用關(guān)系等，從而可以應(yīng)用于病毒防控的研究，基因治療的研發(fā)，新型疫苗的開發(fā)等。特別是反向疫苗的研究，為疾病的防控提供了新的方法［1］?？傊?，反向遺傳學(xué)技術(shù)為FMDV的研究領(lǐng)域開創(chuàng)了一片新天地。

1 不同基因?qū)Σ《痉肿拥挠绊?/h2>

病毒致病的第一步是病毒與細(xì)胞受體結(jié)合。對于FMDV細(xì)胞受體的研究一直在進(jìn)行之中，反向遺傳學(xué)技術(shù)為此研究提供了高效的技術(shù)支持。Sa-Carvalho D等［2］構(gòu)建了A12株的嵌合病毒，通過對核衣殼蛋白基因的長度比例不斷增加的試驗研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MDV的VP3與硫酸肝素結(jié)合可以吸附感染細(xì)胞，但需要衣殼表面帶正電荷氨基酸殘基的參與。Leippert M等［3］在構(gòu)建了O1K株基因組全長感染性cDNA分子的基礎(chǔ)上，將細(xì)胞表面整聯(lián)蛋白受體識別 VP1的精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸（Arg-Gly－Asp，RGD）RGD三肽基序及其附近引入定點突變，證實在病毒吸附過程中FMDV RGD基序的重要地位。Zhao Q等［4］在構(gòu)建豬源FMDV感染性cDNA重組基因中，用KGE序列替換了RGD序列，然后將含有此突變位點的P1編碼區(qū)與牛源FMDV的對等基因置換，獲得了嵌合病毒。將嵌合病毒接種豬后，豬產(chǎn)生相應(yīng)的疾病癥狀，之后發(fā)現(xiàn)基因組中仍保留KGE序列，這表明此FMDV突變株既不利用RGD序列識別受體，又不使用硫酸肝素途徑感染細(xì)胞，這揭示FMDV至少還有另外一個受體分子。Li P等［5］研究 Asia1型FMDV，分別拯救出了含有RDD（RGD中的G突變?yōu)镈），RSD（RGD中的G突變?yōu)镾）與RGD的全長cDNA的病毒。感染動物后發(fā)現(xiàn)含有RDD比含有RGD的毒株感染力與致病力高至10倍左右。通過測序表明不同代次的病毒中RGD與RDD穩(wěn)定存在，這不僅說明了RDD基序可代替RGD進(jìn)行感染，而且進(jìn)一步證明了FMDV可能存在另一個受體分子的。

近年來，F(xiàn)MD疫情頻繁發(fā)生，新的變異株不斷出現(xiàn)，且有向全球蔓延的趨勢，而基因組的變異往往會影響到病毒毒力、抗原性以及宿主嗜性等多方面的變化。目前，原有的病毒基因型的研究已經(jīng)不能滿足當(dāng)前對復(fù)雜多樣的變異株的防控。因而，人們通過反向遺傳學(xué)技術(shù)，找出當(dāng)今變異株的突變位點，由此可分析出病毒的來源與各地病毒之間的親緣關(guān)系，為FMD的防控奠定了理論基礎(chǔ)。Valdazo-Gonzalez B等［6］人應(yīng)用反向遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建出了2011年在保加利亞暴發(fā)的FMDV全基因序列，研究此病毒的來源與傳播的特點，構(gòu)建了進(jìn)化樹，由此分析了此病毒的來源以及各地病毒之間的親緣關(guān)系，并且成功的預(yù)測了隨后將出現(xiàn)的FMDV流行毒株，為FMD多表型遺傳譜系的防控提供了基礎(chǔ)。在1997年中國臺灣暴發(fā)的FMD與1999年在中國大陸暴發(fā)的FMD的病毒是不同的基因型，在自然狀態(tài)下，大陸的FMDV毒株僅感染牛羊，而在臺灣的FMDV毒株卻對豬表現(xiàn)高致病性。后來發(fā)現(xiàn)大陸的FMDV毒株在遺傳地位上與臺灣豬源病毒在一個進(jìn)化支中［7］。這兩次FMD的暴發(fā)都嚴(yán)重影響到了畜牧業(yè)的發(fā)展，也同時造成了巨大的經(jīng)濟損失。

2 新型病毒載體的研究

病毒載體是一種新型的分子生物學(xué)工具，可以應(yīng)用于基因結(jié)構(gòu)與功能的探索、病毒復(fù)制與感染的研究，疫苗與基因治療的開發(fā)等［8］。FMDV基因組具有多個穩(wěn)定表達(dá)外源基因的位點并且可控性強，可作為病毒載體。Piccone M E等［9］成功拯救了3株在L蛋白的Lab和Lb之間分別插入流感病毒血凝素HA﹑Flag和Tc標(biāo)簽的FMD重組病毒，經(jīng)過細(xì)胞水平地檢測得到拯救病毒外源基因的表達(dá)，說明L蛋白的突變并沒有影響到細(xì)胞中病毒的感染能力與L蛋白的功能，為重組標(biāo)記毒株的構(gòu)建提供了新的思路。高度保守的 Arg-Gly-Asp（RGD）基序存在于VP1的G-H環(huán)中，G-H環(huán)跨度大約是VP1的140～160位的20個氨基酸殘基，其環(huán)狀結(jié)構(gòu)與FMDV的吸附力與抗原性密切相關(guān)，在VP1序列中插入外源片段引起人們的關(guān)注。Seago J等［10］在 VP1G-H 環(huán)中155～156位氨基酸中插入HA與Flag標(biāo)簽，通過蝕斑試驗表明含有標(biāo)簽的重組病毒的毒力降低，但可接受蛋白進(jìn)行融合表達(dá)。Lawrence P等［11］將Flag標(biāo)簽成功的插入VP1的G-H環(huán)上游區(qū)域中，通過蝕斑試驗表明插入標(biāo)簽后重組病毒的毒力降低，并且通過免疫熒光檢測到外源基因Flag在VP1中的表達(dá)。FMDV 3A蛋白影響病毒感染性與嗜性，并且與其他小RNA病毒相比較長，人們一直在探索其自身結(jié)構(gòu)功能以及接受外源基因的能力。LI P等［12］通過研究發(fā)現(xiàn)雖然編碼3A蛋白N-末端的親水性區(qū)域高度保守，但是，C-末端結(jié)構(gòu)域可以自然地產(chǎn)生不同的缺失，Li等人基于這些特性，推斷編碼3A蛋白的85～102和133～143的區(qū)域?qū)MDV的復(fù)制都是非必需區(qū)，并且適合外源基因的插入。研究人員用Flag標(biāo)簽與皰疹病毒（HSV）D蛋白的抗原表位替換了3A中92～102位序列后，成功構(gòu)建出2株重組病毒。經(jīng)過免疫熒光法，Western blot和序列分析等檢測表明重組病毒與親本病毒有著相似的毒力與復(fù)制動力學(xué)。并且，重組病毒在BHK-21細(xì)胞中連續(xù)傳代后仍能穩(wěn)定地表達(dá)，在免疫小鼠后可產(chǎn)生具有誘導(dǎo)標(biāo)記的特異性抗體。

3 新型口蹄疫生物制品的研制

運用反向遺傳學(xué)技術(shù)對FMDV的研究，都是為了能夠更好地了解FMD的暴發(fā)，流行途徑，從而有效的控制FMD。而如今，新型FMD生物制品的研制為防控疫病的暴發(fā)提供了一條有效地途徑。

Fowler V L等［13］以 O／C 型的 VP1G-H 環(huán)替換A12-119毒株VP1G-H環(huán)，構(gòu)建出了標(biāo)記疫苗，在接種牛體后發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)產(chǎn)生了中和抗體，而且在免疫后21d仍能夠完全保護動物免受病毒的攻擊。這項研究不僅驗證了病毒VP1G-H環(huán)在免疫中的重要性而且說明了改變宿主識別位點而構(gòu)建的嵌合病毒制備的滅活疫苗具有很大的發(fā)展空間。Li S等［14］成功拯救出缺失編碼3A中91～104氨基酸的FMDV AsiaⅠ型感染性分子克隆，經(jīng)過動物試驗后發(fā)現(xiàn)其毒力與復(fù)制動力學(xué)與親本病毒相似，但構(gòu)建的突變病毒只能在BHK-21細(xì)胞中復(fù)制，在小牛腎細(xì)胞中卻不能夠復(fù)制。此試驗表明利用反向遺傳構(gòu)建的缺失免疫表位的FMDV突變毒株可作為候選的滅活疫苗避免了常規(guī)疫苗毒力返祖的潛在危險，此試驗為研制新型弱毒疫苗奠定了基礎(chǔ)。

針對新衍生出的多個表型的遺傳譜系的病毒間缺乏交叉免疫保護力的這一現(xiàn)象，曹偉軍等［15］成功構(gòu)建出含有預(yù)期突變的FMDV O／HN／93株全長cDNA克隆，拯救出了對流行毒具有免疫優(yōu)勢的FMDV O／HN／93株，為研究抗菌譜廣的侯選疫苗毒株提供了理論依據(jù)。針對FMDV O型毒株中東－南亞拓?fù)湫?（ME-SA）、東南亞拓?fù)湫停⊿EA）可以被當(dāng)前疫苗所免疫，而中國拓?fù)湫停–HY）的一些變種難以產(chǎn)生免疫保護作用，給我國豬FMD的防控帶來了極大的困難，LI P等［16］構(gòu)建了一個FMDV疫苗株全長cDNA感染性克隆，并且將抗原位點l、3和4進(jìn)行了一些氨基酸替換，成功建出新的重組疫苗毒株，發(fā)現(xiàn)與野生毒株具有相似的生長特性，且免疫動物后發(fā)現(xiàn)，對于傳統(tǒng)疫苗不提供保護的變異的CHY型病毒也會產(chǎn)生免疫效應(yīng)，即重組的疫苗毒株比野生毒株的抗菌譜廣，免疫原性好。

目前，有學(xué)者構(gòu)想在FMDV感染性cDNA分子的基礎(chǔ)上插入其他病毒的抗原序列，生產(chǎn)出雙價苗，可以一苗防兩病。Tong W等［17］用FMDV VP1處141aa-160aa 和 200aa-213aa 處 的 序 列 替 換 了PRRSV-HuN4-F112（豬繁殖與呼吸綜合征病毒）NSP2處508aa-532aa對應(yīng)的基因，并將構(gòu)建的全長cDNA克隆轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞36h后，將收集的細(xì)胞培養(yǎng)液上清接種至單層Marc-145細(xì)胞中出現(xiàn)明顯的CPE現(xiàn)象并重新獲取重組病毒。將拯救的病毒通過免疫熒光鑒定表明外源基因成功的在該病毒中表達(dá)。經(jīng)過測驗發(fā)現(xiàn)獲救的重組PRRSV的滴度與其直接親本病毒rHuN4-F112-delta 508aa-532aa相似，但比rHuN4-F112高。Jeeva S等［18］提出了用豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的復(fù)制子載體表達(dá)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白。他們構(gòu)建了含有FMDV P1-2A、3C基因的PRRSV K418DM的復(fù)制子載體，經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化入MARC-145細(xì)胞（非洲綠猴腎上皮細(xì)胞）。使用針對FMDV P1-2A、3C和PRRSV N的單克隆抗體對體外所表達(dá)出的蛋白進(jìn)行免疫熒光檢測，證實了相關(guān)蛋白的分泌表達(dá)。

張曉霞等［19］成功構(gòu)建了抗FMDV單鏈抗體cDNA T7噬菌體展示文庫，此文庫的成功構(gòu)建為FMD的快速診斷提供了一條新的途徑。Uddowla S等［20］構(gòu)建了一個安全的FMD負(fù)標(biāo)記疫苗平臺，構(gòu)建了多株多點突變和多片段缺失的FMDV感染性分子克隆，將多株成功拯救出的病毒免疫動物后，一方面發(fā)現(xiàn)與親本病毒比較，毒力存在一定程度的下降，這為目前FMD滅活疫苗的生產(chǎn)提供一種新型的替代毒株。另一方面，免疫動物后誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體，可以區(qū)分不同毒株，這為目前ELISA檢測FMD提供了一個新的﹑更加準(zhǔn)確的輔助材料。

4 結(jié)語

如今雖然人們對于FMDV的結(jié)構(gòu)與功能、病毒與宿主的相互作用及致病機理等有了一定的了解，但是還存在許多不清楚的地方，特別是基因組中不同結(jié)構(gòu)共同影響病毒毒力與感染性等方面還未深入的研究，而反向遺傳學(xué)為此方面的研究提供了技術(shù)支持。當(dāng)前，應(yīng)用反向遺傳學(xué)將外源基因插入FMDV的研究證實FMDV有作為病毒載體的潛質(zhì)，有關(guān)方面的探索被越來越多的學(xué)者所關(guān)注?，F(xiàn)階段小片段插入FMDV基因的研究已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但較大的外源片段插入的研究還相對滯后，需要更進(jìn)一步的研究。與此同時，依賴于反向遺傳學(xué)研發(fā)新型疫苗，可能會為FMD的防控提供一種更加高效的方法。FMDV與其他病毒抗原序列的結(jié)合生產(chǎn)出的雙價苗，一苗防兩病為高效疫苗的開發(fā)提供了一種新的思路。不僅如此，針對近幾年不斷出現(xiàn)的新的變異株，人們通過反向遺傳學(xué)技術(shù)不僅研制出抗原譜廣的、免疫原性好的候選疫苗毒株，而且還成功的推測了將要產(chǎn)生的變異毒株。這無疑為控制FMD疫情的發(fā)生與流行提供了最佳的方法。當(dāng)前人們正在試圖確認(rèn)反向遺傳疫苗遺傳的穩(wěn)定性與工業(yè)生產(chǎn)的可行性，并且正在不斷開發(fā)新的高效的反向遺傳疫苗。毋庸置疑，反向遺傳學(xué)的興起，極大地推動了FMDV的研究并對FMD疫情防控起到舉足輕重的作用。

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Advance in Reverse Genetics Technology of Foot-and-mouth Disease Virus

REN Fang1，YI Zhong1，GUO Hui-ling1，WEI Yu-rong1，MA Wen-ge1，HUANG Jiong1

（1.InstituteofVeterinaryMedicine，XinjiangAcademyofAnimalScience，Urumqi，Xinjiang，830000，China；2.CollegeofVeterinaryMedicine，XinjiangAgriculturalUniversity，Urumqi，Xinjiang，830052，China）

Foot-and-mouth disease（FMD）is an infectious disease caused by foot-and-mouth disease virus（FMDV）.Office International Des Epizooties（OIE）has listed foot-and-mouth disease as the first disease of the most important animal epidemic diseases.If FMD breaks out，it shall seriously affect the development of animal husbandry，and the national economy.But now，we still have the blind spot for the footand-mouth disease virus＇s understanding.There are many insufficiencies for the foot-and-mouth disease vaccine.The rapid development of viral reverse genetics technology has provided one new and effective technical method for the research of the foot-and-mouth disease virus structure and the research of the new vaccine and biological preparations.This article reviewed the domestic and foreign research of FMDV molecular pathogenic mechanism and the new FMD vaccine preparation by reverse genetics technology，at last prospected the new trend of foot-and-mouth disease virus reverse genetics.

Foot-and-mouth disease virus；infectious cDNA clone；reverse genetics

S852.659.6

A

1007-5038（2014）11-0084-04

2014-02-21

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201103008）

任 方（1989－），女，新疆烏魯木齊人，碩士研究生，從事動物病毒病研究。＊通訊作者