張徐俞王瑾瑜鄭廣順張俊琦盧存福

（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 分析測(cè)試中心 林木育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2.清華大學(xué)分析測(cè)試中心，北京 100084；3.中國(guó)科學(xué)院植物研究所，北京 100093）

鹽脅迫下沙冬青細(xì)胞端粒酶活性的變化與DNA穩(wěn)定性的關(guān)系

張徐俞1王瑾瑜2鄭廣順3張俊琦1盧存福1

（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 分析測(cè)試中心 林木育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2.清華大學(xué)分析測(cè)試中心，北京 100084；3.中國(guó)科學(xué)院植物研究所，北京 100093）

沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）是亞洲中部荒漠地區(qū)的常綠闊葉灌木，是古老的第三紀(jì)孑遺植物，具有極強(qiáng)的抗逆能力。旨在探究鹽脅迫下沙冬青細(xì)胞端粒酶活性變化與染色體DNA穩(wěn)定性的關(guān)系。結(jié)果表明，在100 mmol/L NaCl的低濃度鹽脅迫處理下，隨著處理時(shí)間的增加，端粒酶活性沒(méi)有增加，未出現(xiàn)明顯的DNA降解現(xiàn)象；當(dāng)在500 mmol/L高濃度鹽脅迫時(shí)，處理的初期端粒酶活性迅速的增加，但隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，端粒酶活性下降，此時(shí)DNA未明顯降解；當(dāng)移除NaCl脅迫，端粒酶活性增加1.4倍，DNA保持穩(wěn)定。因此推測(cè)，在鹽脅迫下，沙冬青細(xì)胞端粒酶活性的維持對(duì)避免細(xì)胞遭受不可逆損傷，保持染色體DNA穩(wěn)定性具有一定的作用。

沙冬青 鹽脅迫 端粒酶 DNA損傷

植物在生長(zhǎng)發(fā)育中時(shí)常受到不良環(huán)境脅迫的影響，如鹽漬、干旱、低溫等，其中鹽害在世界許多地區(qū)存在，嚴(yán)重影響農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)。鹽脅迫對(duì)植物造成的損傷主要包括滲透脅迫和離子毒害，而這兩種原初反應(yīng)的結(jié)果，即產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）［1］，活性氧具有很強(qiáng)的氧化能力，低濃度ROS則能誘導(dǎo)某些抗氧化酶基因的表達(dá)，提高酶活性，從而消除活性氧；高濃度ROS可直接作用

于 DNA，使細(xì)胞核內(nèi)DNA降解［2］。DNA損傷直接導(dǎo)致與細(xì)胞維持生理功能的某些基因失去表達(dá)活性，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞衰老［3］。Allsopp等［4］的研究表明，活性氧可以使DNA單鏈斷裂積累并導(dǎo)致端?？s短。

端粒酶是具有逆轉(zhuǎn)錄活性的核糖核蛋白，具有維持端粒長(zhǎng)度，保護(hù)和修復(fù)DNA損傷，維持細(xì)胞活力的功能［5］。在對(duì)人和動(dòng)物的研究表明，由細(xì)胞凋亡所引起的DNA損傷可在端粒酶的作用下修復(fù)。在細(xì)胞受到外界刺激而造成細(xì)胞內(nèi)DNA斷裂等損傷時(shí)，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因（TERT）則大量表達(dá)，修復(fù)DNA損傷，但其修復(fù)能力具有一定的限度［6，7］。煙草細(xì)胞中也存在同樣的修復(fù)現(xiàn)象，煙草細(xì)胞在受到重金屬鎘脅迫時(shí)發(fā)生凋亡，染色體濃縮且DNA發(fā)生片段化，但是如果能夠及時(shí)地移除這種脅迫，這種凋亡是可以修復(fù)的，并且這種修復(fù)同端粒酶活性的上升或維持有一定的關(guān)聯(lián)性［8］。

沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）是我國(guó)西北荒漠地區(qū)的常綠灌木，是亞熱帶地區(qū)第三紀(jì)殘遺物種，具有較強(qiáng)的抵抗干旱、寒冷、高溫、鹽堿等的特性，并已被確定為國(guó)家三級(jí)保護(hù)樹(shù)種［9，10］。沙冬青自然分布的地區(qū)含鹽量高達(dá)0.38%，其種子在濃度低于1.2% NaCl溶液中可以正常發(fā)芽，幼苗在0.9%鹽濃度下生存良好，因此沙冬青具有很強(qiáng)的耐鹽堿的特性，是植物抗逆研究的理想材料［11］。有關(guān)沙冬青抗逆分子機(jī)理的研究，目前主要集中在抗逆基因的克隆和功能驗(yàn)證［12-14］，但逆境脅迫下染色體DNA穩(wěn)定性與抗逆能力關(guān)系的研究，還未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)沙冬青細(xì)胞進(jìn)行鹽脅迫處理，檢測(cè)在不同濃度鹽脅迫下染色體DNA的穩(wěn)定性及端粒酶活性的變化，旨在探討端粒酶對(duì)維持逆境脅迫下染色體DNA穩(wěn)定性可能所起的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

沙冬青懸浮細(xì)胞：在 40 mL沙冬青液體培養(yǎng)基中（B5+1.0 mg/mL 6-BA+1.0 mg/mL NAA），按照1∶5的比例加入沙冬青細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)13 d，每2 d取樣一次，稱重，確定生長(zhǎng)特性。

1.2 方法

1.2.1 鹽脅迫處理 將沙冬青懸浮細(xì)胞在含NaCl 0、 100、300和500 mmol/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，然后再轉(zhuǎn)入不含鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d。每天取一次樣。

1.2.2 TTC法測(cè)定細(xì)胞活力 參照劉華等［15］TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）法測(cè)定紅豆杉細(xì)胞活力的方法，取100 mg不同濃度鹽處理的沙冬青愈傷加入離心管中，將愈傷用鑷子夾碎，在離心管中加入3 mL的TTC溶液，用錫箔紙包好避光，放22℃培養(yǎng)箱中培育12 h。用槍頭吸去TTC溶液，加入蒸餾水洗2-3次。離心機(jī)500×g離心3 min，收集細(xì)胞，然后加入3 mL 95%的酒精，懸浮細(xì)胞。置入60℃水浴鍋水浴10 min，冷卻至室溫后定容至3 mL，搖勻。分光光度計(jì)測(cè)定其在485 nm處的吸光值。

1.2.3 端粒酶蛋白提取和檢測(cè) 端粒酶的組成成分中含有RNA，極容易被降解，因此，應(yīng)該和提取RNA一樣，盡量在低溫條件下快速操作、必須使用RNase-free的耗材、桌面最好用固相RNase清除劑清潔。

參照Fitzgerald等［16］的方法，稱取0.3 g鹽處理后的沙冬青懸浮細(xì)胞，將材料放入預(yù)冷的研缽中迅速研磨，加入預(yù)冷的CHAPS buffer 800 μL，放在冰浴中裂解30 min，4℃ 16 000×g 離心20 min，離心后在超凈臺(tái)中取上清，加入10% W/V PEG8000［17］，放在冰上沉淀30 min，每隔3-5 min顛倒混勻一次，16 000×g離心10 min，去上清，再在沉淀中加入CHAPS裂解液200 μL，在冰上靜置裂解30 min，然后繼續(xù)4℃ 16 000×g離心10 min，-80℃保存。12%聚丙烯酰胺膠電泳，熒光染料染色，用自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀進(jìn)行掃描，Quality one軟件分析條帶。

1.2.4 DNA損傷的檢測(cè) 提取沙冬青細(xì)胞DNA，用瓊脂糖凝膠電泳及EB染色測(cè)定DNA穩(wěn)定性，紫外透射儀下觀察DNA 條帶，用自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀進(jìn)行掃描。

2 結(jié)果

2.1 沙冬青懸浮細(xì)胞培養(yǎng)及生長(zhǎng)特性

為了確定沙冬青懸浮細(xì)胞的繼代時(shí)間，將沙冬青愈傷組織放入40 mL液體培養(yǎng)基中（B5+1.0 mg/mL 6-BA+1.0 mg/mL NAA），繼代兩次后，再將其按照1∶5比例繼代到新培養(yǎng)基中，隔天測(cè)定細(xì)胞鮮重，得到S型生長(zhǎng)曲線。繼代3 d后，沙冬青懸浮

細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，7 d后進(jìn)入到靜止期（圖1）。

圖1 沙冬青懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.2 鹽脅迫下沙冬青懸浮細(xì)胞活力

將懸浮培養(yǎng)10 d的沙冬青懸浮細(xì)胞分別繼代于含0、100、300和500 mmol/L NaCl的液體培養(yǎng)基中，25℃，130 r/min懸浮培養(yǎng)3 d，每天取樣，3 d后將懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)入不含鹽的培養(yǎng)基中再懸浮培養(yǎng)3 d，每天取樣，測(cè)定6 d中所取細(xì)胞的細(xì)胞活力。

由圖2可知，沙冬青懸浮細(xì)胞的相對(duì)活力隨著生長(zhǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)不斷的增大。100 mmol/L NaCl處理的沙冬青懸浮細(xì)胞的相對(duì)活力，在鹽脅迫的3 d中，其活力不斷的下降，一旦移除鹽脅迫的條件，細(xì)胞活力有所上升。300 mmol/L NaCl處理的沙冬青懸浮細(xì)胞的相對(duì)活力，在鹽脅迫的3 d中，其活力迅速地減小，移除鹽脅迫后，細(xì)胞活力雖然有所回升，但很快又出現(xiàn)下降趨勢(shì)。500 mmol/L NaCl處理的沙冬青懸浮細(xì)胞與300 mmol/L NaCl處理的變化趨勢(shì)基本相當(dāng)，但是其下降的趨勢(shì)較300 mmol/L NaCl處理要迅速。在移除脅迫后，也沒(méi)有迅速的回升。由此可知，在鹽脅迫下，沙冬青懸浮細(xì)胞活力隨著鹽濃度的增加下降速度也越快，一旦移除脅迫條件后，低濃度的鹽脅迫下，細(xì)胞活力會(huì)回升。

圖2 鹽脅迫處理下沙冬青懸浮細(xì)胞活力變化

2.3 鹽脅迫下DNA的穩(wěn)定性

沙冬青懸浮細(xì)胞在鹽脅迫后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA降解程度。結(jié)果（圖3）顯示，在0 mmol/L NaCl處理下，剛繼代的懸浮細(xì)胞能檢測(cè)到不太明顯的DNA，基本檢測(cè)不到DNA拖尾條帶。在300 mmol/L和500 mmol/L NaCl處理下，出現(xiàn)輕微DNA拖尾條帶，移除NaCl脅迫后，DNA 拖尾反而變得較明顯，但主帶仍很清晰，在點(diǎn)樣孔中有明顯殘留，可能是由于蛋白或其它雜質(zhì)沒(méi)有去除干凈，且其條帶主帶較其它帶明顯，可能DNA濃度較大，導(dǎo)致雜質(zhì)較多，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。這些結(jié)果表明，在鹽脅迫及移除鹽脅迫的恢復(fù)期，染色體DNA由于遭受損傷加速降解。

圖3 瓊脂凝膠電泳檢測(cè)沙冬青懸浮細(xì)胞在不同濃度鹽脅迫下DNA穩(wěn)定性

2.4 鹽脅迫下沙冬青懸浮細(xì)胞端粒酶活性的變化

同測(cè)定細(xì)胞活力一樣，選擇了4個(gè)鹽濃度（0、100、300和500 mmol/L NaCl）來(lái)處理沙冬青懸浮細(xì)

胞，處理時(shí)間和處理方式都與細(xì)胞活力測(cè)定保持一致。在沒(méi)有鹽脅迫的情況下，端粒酶活性隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)基本保持穩(wěn)定。100 mmol/L NaCl處理下，端粒酶活性比沒(méi)有鹽脅迫的要高，而移除脅迫后端粒酶活性緩慢增加。當(dāng)NaCl的濃度增加到300和500 mmol/L時(shí)，在處理的初期端粒酶活性迅速增加，但隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，端粒酶活性下降，一旦移除脅迫，端粒酶活性恢復(fù)到對(duì)照或超過(guò)對(duì)照水平（圖4，圖5）。

圖4 不同濃度鹽脅迫下沙冬青懸浮細(xì)胞端粒酶活性的變化

3 討論

植物在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育周期中都會(huì)受到外界各種生物或非生物脅迫，這些傷害會(huì)對(duì)植物造成或大或小的損傷，包括生長(zhǎng)抑制、光合作用下降、能耗增加，衰老甚至死亡［18］，而對(duì)于細(xì)胞最直接的是其DNA損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［19］。擬南芥中由端粒縮短引起的細(xì)胞死亡是有某種類凋亡方式來(lái)完成的，這個(gè)機(jī)制可以通過(guò)染色體端粒片段檢測(cè)獲得［20］。在對(duì)人的研究中發(fā)現(xiàn)，端粒酶可以通過(guò)增加細(xì)胞分裂和減少細(xì)胞凋亡來(lái)增加細(xì)胞的壽命，同時(shí)端粒酶可以調(diào)節(jié)DNA損傷應(yīng)答，保證染色體末端DNA的穩(wěn)定性［21］。Fojtova等［8］對(duì)煙草細(xì)胞進(jìn)行鎘脅迫研究表明，在3 d脅迫處理時(shí)間內(nèi)，端粒酶活性一直增加，在移除鎘脅迫的3 d恢復(fù)期，端粒酶活性增加，細(xì)胞DNA損傷也獲得修復(fù)，細(xì)胞恢復(fù)活力；但一旦超出3 d這一臨界點(diǎn)，細(xì)胞DNA損傷就不能被修復(fù)，走向衰亡。因此，這也證明了端粒酶在細(xì)胞DNA損傷修復(fù)中起到了很重要的作用。

圖5 沙冬青懸浮細(xì)胞在不同濃度鹽脅迫下端粒酶相對(duì)活性的變化

本研究中，無(wú)論是低鹽（100 mmol/L NaCl）還是高鹽濃度（500 mmol/L NaCl）處理下，隨著處理時(shí)間的增加，均未出現(xiàn)明顯的DNA降解現(xiàn)象；低鹽濃度處理下，端粒酶活性較對(duì)照組高，而在500 mmol/L高濃度鹽脅迫時(shí)，處理的初期端粒酶活性迅速的增加，但隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，端粒酶活性下降，但DNA未明顯降解；當(dāng)移除500 mmol/L NaCl脅迫，端粒酶活性及DNA保持穩(wěn)定。因此推測(cè)，在鹽脅迫下，沙冬青細(xì)胞維持高的端粒酶活性對(duì)避免細(xì)胞遭受不可逆損傷，保持染色體DNA穩(wěn)定性可能具有一定的作用。

目前，植物端粒酶參與細(xì)胞凋亡修復(fù)的機(jī)制依然不是很清楚，研究報(bào)道極其有限。但前人及本研究暗示，深入研究端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶在植物非生物脅迫抗性損傷修復(fù)中的作用，可能會(huì)為揭示植物抗逆分子機(jī)理提供一條新的路徑。

4 結(jié)論

在低鹽和高鹽脅迫下，沙冬青細(xì)胞DNA都沒(méi)

有出現(xiàn)明顯的降解現(xiàn)象；端粒酶活性在100 mmol/L NaCl的低濃度鹽脅迫處理下無(wú)明顯變化，而在 500 mmol/L高濃度鹽脅迫時(shí)，在處理初期端粒酶活性迅速增加，但隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，端粒酶活性下降，當(dāng)移除脅迫，端粒酶活性迅速增加。沙冬青細(xì)胞端粒酶活性的維持對(duì)避免細(xì)胞遭受不可逆損傷，維持染色體DNA的穩(wěn)定性具有一定的作用。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Effects of Salt Stress on Telomerase Activity in Relation to DNA Stability of Ammopiptanthus mongolicus Cells

Zhang Xuyu1Wang Jinyu2Zheng Guangshun3Zhang Junqi1Lu Cunfu1
（1. College of Biological Sciences and Biotechnology，Analysis and Testing Center，National Engineering Laboratory for Tree Breeding，Beijing Forestry University，Beijing 100083；2. Analysis and Testing Center，Tsinghua University，Beijing 100084；3. Institute of Botany，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100093）

Ammopiptanthus mongolicus, the evergreen broadleaf shrub indigenous to the northwest desert of China, is a residual plant of the ancient subtropical area in the Tertiary Period and has been identified as the national tertiary protection species. This research was conducted to explore the relationship between DNA damage and telomerase activity of Ammopiptanthus mongolicus cells under salt stress. The results showed that telomerase activity was increased during the first 3 d of low salt（100 mmol/L NaCl）treatment. However, when culture cells were treated with 500 mmol/L NaCl, telomerase activity increased rapidly at the initial stage, while declined after 2 day salt stress. Telomerase activity increased 1.4-fold in the recovery phase when 500 mmol/L NaCl was removed from the growth medium. DNA damage was not obvious during the NaCl treatment time or in the phase when NaCl was removed from the growth medium. It is proposed that plants might have developed a highly efficient DNA repair system to cope with transient salt stress, and telomerase may play an important role in it.

Ammopiptanthus mongolicus Salt stress Telomerase DNA damage

2014-03-12

高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計(jì)劃資助項(xiàng)目（B13007），長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目（IRT13047），北京市教委共建項(xiàng)目（101009）、北京市公園管理中心課題（0710016），北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（6112016）

張徐俞，女，碩士研究生，研究方向：植物端粒、端粒酶；E-mail：zhang545437383@163.com

盧存福，男，教授，研究方向：植物分子細(xì)胞生物學(xué)；E-mail：lucunfu@bjfu.edu.cn