藏雨軒，方 芳，朱杭飛，向國(guó)艷，張雲(yún)喬，李璦彤，郝 峰*

(吉林醫(yī)藥學(xué)院1.生物化學(xué)檢驗(yàn)教研室;2.免疫學(xué)教研室，吉林吉林132013)

鈣激活氯離子通道(calcium-activated chloride channels，CaCCs)是一類(lèi)在內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和神經(jīng)元等細(xì)胞廣泛表達(dá)的陰離子通道，在跨上皮液體轉(zhuǎn)運(yùn)、嗅覺(jué)信號(hào)傳導(dǎo)和平滑肌收縮等多種生理過(guò)程中扮演重要角色［1-2］，同時(shí)CaCCs 也是治療高血壓、腹瀉和某些特定腫瘤等疾病潛在的藥物靶點(diǎn)［3］?？缒さ鞍?6家族(transmembrane protein 16)共有10 個(gè)成員，目前已證實(shí)Ano1(anoctamin 1)是CaCCs 的分子基礎(chǔ)［4-5］，但對(duì)其他成員的作用還不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)探討Ano2(anoctamin 2)是否是CaCCs 的分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

限制性?xún)?nèi)切酶、T4 連接酶和Taq 酶(Takara 公司);引物合成和測(cè)序(上海生工公司);RT-PCR 試劑盒和Trizol(Invitrogen 公司);DNA 凝膠回收試劑盒(Qiagen 公司);FRT 細(xì)胞(大連醫(yī)科大學(xué)麻彤輝教授饋贈(zèng));兔源增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)抗體和羊抗兔二抗(中杉金橋公司);F-12 基本培養(yǎng)基、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、氯化銫(CsCl)、N-甲基-D 葡萄糖胺(NMDG)和尼氟滅酸(niflumic acid，NFA)(Sigma 公司);胎牛血清(四季青公司)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成:NCBI 查詢(xún)小鼠Ano2 基因(NM_153589)序列，設(shè)計(jì)位于開(kāi)放讀碼框架兩端的引物，去除下游引物終止密碼子后加入保護(hù)堿基和相應(yīng)酶切位點(diǎn)EcoR Ⅰ(GAATTC)和Kpn Ⅰ(GGT ACC)。上游引物:5'-CGAATTCCGTCTGAGCCGCA TGCACTTT-3';下游引物:5'-GCGGTACCTACATTGG TGTGCTGGGACC-3'。

1.2.2 RT-PCR 擴(kuò)增Ano2 基因:提取小鼠視網(wǎng)膜總RNA，僅轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板進(jìn)行PCR 反應(yīng)，94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃3.5 min，30 個(gè)循環(huán);72 ℃，10 min，PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收陽(yáng)性片段。

1.2.3 pEGFP-Ano2 的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化與鑒定:EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切Ano2 與pEGFP-N3 后，16 ℃連接過(guò)夜。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)DH5α，次日挑取陽(yáng)性克隆，搖菌擴(kuò)增，12 h 后提取質(zhì)粒，酶切正確后測(cè)序。

1.2.4 穩(wěn)定表達(dá)pEGFP-Ano2 細(xì)胞系的建立:將長(zhǎng)勢(shì)良好的FRT 細(xì)胞鋪6 孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待第2 天細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%，將0.5 μg 質(zhì)粒分別與1、1.5、2 和2.5 μL 脂質(zhì)體Lipofectamine 2000，混合進(jìn)行轉(zhuǎn)染，倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染pEGFP-Ano2 在Fisher 大鼠甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞(Fisher rat thyroid，F(xiàn)RT)中Ano2 的表達(dá)情況，選取轉(zhuǎn)染效率高的質(zhì)粒和脂質(zhì)體比例進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。36 h 后將轉(zhuǎn)染的FRT 細(xì)胞消化，按照1∶5∶10的比例傳代到3 個(gè)10 cm 培養(yǎng)板中，并加入含有1 000 ng/mL的G418 的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，挑取純度和表達(dá)量均較高的克隆到96 孔板繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)60%后擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.5 Western blot 檢測(cè)pEGFP-Ano2 的表達(dá):轉(zhuǎn)染后36 h，消化收集細(xì)胞并超聲裂解，將定量的蛋白樣品上樣進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，180 mA 2 h 電轉(zhuǎn)移至NC 膜，脫脂奶室溫封閉2 h，然后加EGFP 抗體、內(nèi)參β-actin 抗體和羊抗兔二抗搖晃孵育，TBST洗膜3 次，ECL(A 和B 顯色液等體積混合)化學(xué)發(fā)光試劑顯影，放入凝膠成像系統(tǒng)中拍照，用Quality one 軟件分析灰度值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，應(yīng)用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用t 檢驗(yàn)。

1.2.6 全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄Ano2 的電流:將轉(zhuǎn)染pEGFP-Ano2 的FRT 細(xì)胞消化置于倒置熒光顯微鏡載物臺(tái)，電極給予負(fù)壓吸引并擊破細(xì)胞膜，維持GΩ高阻抗封接，形成whole-cell patch。初始鉗制電壓為0 mV，施加從－100 mV 躍階到+100 mV 電壓(每20 mV一個(gè)step)，各記錄750 ms 電流變化，750 ms 后電壓變?yōu)椋?0 mV，繼續(xù)記錄200 ms，CaCCs 的抑制劑NFA 作為對(duì)照。配制600 nmol/L Ca2+溶液和0 nmol/L Ca2+溶液，配方詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)［6］。

2 結(jié)果

2.1 重組pEGFP-Ano2 真核表達(dá)載體雙酶切鑒定

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果約在4 700、2 700、7 400、7 400和4 000 bp 處有5 條清晰帶，與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。

圖1 重組質(zhì)粒電泳圖Fig 1 Electrophoregram of recombinant plasmid

2.2 重組pEGFP-Ano2 真核表達(dá)載體測(cè)序結(jié)果

結(jié)果表明所構(gòu)建重組質(zhì)粒上連有目的基因Ano2，經(jīng)分析上游及下游酶切位點(diǎn)分別為EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ，證實(shí)成功構(gòu)建重組pEGFP-Ano2 真核表達(dá)載體(圖2)。

2.3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化結(jié)果

0.5 μg 質(zhì)粒分別與1、1.5、2 和2.5 μL 脂質(zhì)體，混合進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，0.5 μg 質(zhì)粒與2.5 μL 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率最高(圖3)。

2.4 穩(wěn)定表達(dá)Ano2 的FRT 細(xì)胞

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-Ano2 的FRT 細(xì)胞膜呈現(xiàn)綠色，提示FRT 細(xì)胞成功表達(dá)pEGFP-Ano2(圖4)。

2.5 Western blot 檢測(cè)FRT 細(xì)胞中Ano2 的表達(dá)

轉(zhuǎn)染pEGFP-Ano2 的FRT 細(xì)胞出現(xiàn)EGFP-Ano2和β-actin 兩條帶，片段大小正確，吸光度:EFGPAno2/β-actin=0.26 ±0.03，對(duì)照組的FRT 細(xì)胞只出現(xiàn)β-actin 一條帶，吸光度:EFGP-Ano2/β-actin =0.13 ±0.02，明顯高于對(duì)照組(p＜0.05)(圖5)。

圖2 重組質(zhì)粒測(cè)序圖Fig 2 The sequencing results of recombinant plasmid

圖3 不同比例的質(zhì)粒與脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至FRT 細(xì)胞Fig 3 The different ratios of plasmid and lipofectamine in FRT cells (×200)

圖4 穩(wěn)定表達(dá)pEGFP-Ano2 的FRT 細(xì)胞Fig 4 FRT cells stably expressing pEGFP-Ano2(×400)

圖5 Ano2 在FRT 細(xì)胞中的表達(dá)Fig 5 The expression of Ano2 in FRT cells

2.6 全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)結(jié)果

在600 nmol/L Ca2+存在的情況下，電流隨電壓和時(shí)間的增加而增大，并記錄到尾電流(圖6A)。此時(shí)在穩(wěn)定表達(dá)Ano2 的FRT 細(xì)胞上施加不同電壓，加入CaCCs 的抑制劑NFA，Ano2 被NFA 抑制，電流明顯減小(圖6B)。對(duì)A 和B 進(jìn)行分析表明電流和電壓關(guān)系呈外向整流特性(圖6C)。0 nmol/L Ca2+存在的情況下，未記錄到電流變化。未轉(zhuǎn)染Ano2的FRT 細(xì)胞未記錄到電流變化(圖6D)。

3 討論

CaCCs 是一類(lèi)表達(dá)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上的陰離子通道，因其被胞質(zhì)中的Ca2+激活，同時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞中最多的Cl－而得名為CaCCs［1］，早在上世紀(jì)80年代初于非洲爪蟾卵母細(xì)胞上首次記錄到經(jīng)典的CaCCs 電流，相繼證實(shí)平滑肌、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞均有 CaCCs 表達(dá)［2-3］。TMEM16 其家族共有10 個(gè)成員，從A～K［4］，這個(gè)家族拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相似，目前已證實(shí)Ano1 是CaCCs 的分子基礎(chǔ)［5］。

圖6 電壓變化引起的鈣激活氯離子通道電流Fig 6 Calcium-activated chloride currents induced by voltage change

本實(shí)驗(yàn)以Ano2 為研究對(duì)象，從小鼠視網(wǎng)膜提取Ano2，并建立穩(wěn)定表達(dá)pEGFP-Ano2 的FRT 細(xì)胞模型。FRT 細(xì)胞具有生長(zhǎng)速度較快及貼壁能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)［3］，常常作為高通量篩選模型的工具細(xì)胞。EGFP 是優(yōu)化的綠色熒光蛋白的突變型蛋白，作為報(bào)告基因敏感度高，熒光顯微鏡下可實(shí)時(shí)觀察目的基因在活細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)表達(dá)［7］，構(gòu)建C 末端融合有EGFP 的Ano2 真核表達(dá)載體，EGFP 示蹤顯示Ano2在FRT 細(xì)胞中的表達(dá)與定位。EGFP 表達(dá)于FRT 細(xì)胞的胞質(zhì)，而將pEGFP-Ano2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至FRT 細(xì)胞，細(xì)胞膜呈綠色熒光，證實(shí)Ano2 表達(dá)于細(xì)胞膜上。膜片鉗技術(shù)可以直接觀察和分辨離子通道電流并且反映離子通道的電生理特性［8］。FRT 細(xì)胞膜上的Ano2 在600 nmol/L Ca2+存在時(shí)，電流呈Ca2+、時(shí)間和電壓依賴(lài)性，得到的I/V 曲線呈外向整流，與經(jīng)典的CaCCs 電流一致，且被CaCCs 的抑制劑NFA 抑制，證實(shí)Ano2 是CaCCs 的分子基礎(chǔ)。

總之，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)Ano2 是CaCCs 的分子基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的pEGFP-Ano2 真核表達(dá)載體和穩(wěn)定表達(dá)pEGFP-Ano2 的FRT 細(xì)胞系為深入研究Ano2在細(xì)胞增殖、遷移和凋亡等生理功能中的作用，尋找Ano2 參與離子轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵氨基酸及研究不同濃度和不同類(lèi)型二價(jià)陽(yáng)離子對(duì)CaCCs 的影響等奠定良好基礎(chǔ)。

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