劉冬梅 費永濤 王盼 陳谷 肖性龍 吳暉 唐語謙

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640)

在蔬菜加工中產(chǎn)量最大的品種是發(fā)酵蔬菜，盡管有2000多年悠久歷史，但是工業(yè)化程度低，存在食鹽含量高和亞硝酸鹽超標(biāo)兩個突出問題.亞硝酸鹽是一種潛在的致癌物，攝入過量的食鹽對健康不利，因此研究降低食鹽和亞硝酸鹽含量的方法，對生產(chǎn)安全的發(fā)酵蔬菜有重要的意義［1-2］.筆者課題組的前期研究表明，添加純種Lactobacillus casei subsp. rhamnosus 719的蔬菜發(fā)酵，能很好地抑制亞硝酸鹽的產(chǎn)生［3］，也可以大幅度降低其中的食鹽含量［4］;還從自然發(fā)酵的蔬菜中篩選得到一株乳酸菌DMDL 9010，添加到蔬菜中進行純種發(fā)酵很好地抑制其中亞硝酸鹽的積累，同時在不添加食鹽的情況下，在24h內(nèi)能完成蔬菜發(fā)酵過程.

應(yīng)用于菌種鑒定的分子生物學(xué)技術(shù)中，最常用的方法有16S rDNA法、重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng)(REP-PCR)指紋分析法、限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)分析法、DNA-DNA雜交法［5-9］等.分類學(xué)家普遍將16S rDNA相似性大于97%和99%作為鑒別微生物到屬和種的依據(jù)［10］，然而Fox等［11］利用16S rDNA法鑒定3株16S rDNA序列相似性達到99.5%的芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，通過DNA雜交試驗才確認為3株為不同的菌種;因此單獨利用16S rDNA進行菌種鑒定是不準(zhǔn)確的.PCRRFLP法可以用于種到屬的鑒別［5］，當(dāng)16S rDNA的序列相似性達到96%以上時，PCR-RFLP法就分辨不開，即酶切圖譜難以分辨［12］.REP-PCR法簡單，分辨力強，能鑒別16S rDNA序列相似性在99.5%以上的菌株，但是此法易被污染以及產(chǎn)生錯誤，同時還需多重對照［13］.DNA-DNA雜交在細菌分類鑒定過程中起著重要的作用，已成為菌種鑒定與分類的標(biāo)準(zhǔn)，國際細菌學(xué)分類委員會于1987年規(guī)定，不同細菌的基因組DNA雜交同源性在75%及以上，同時雜交分子的熱解鏈溫度差在5℃以內(nèi)時，則屬于同一菌種［14］，然而，這種方法的局限性在于配對雜交耗時較長，同時需要同位素的參與，還需要建立一個新的中心數(shù)據(jù)庫［15］.因此，本研究在16S rDNA以及生理生化特征兩種傳統(tǒng)鑒別方法的基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)的方法鑒定了一株能有效抑制蔬菜中亞硝酸鹽的菌株DMDL 9010.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種來源

乳桿菌(Lactobacillus sp.)DMDL9010菌株，由華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院食品安全試驗室分離篩選得到，首次被鑒定為戊糖乳桿菌(名稱為Lactobacillus pentosus DMDL 9010)，并于 2011年 8月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC NO. 5172.干酪乳桿菌鼠李糖亞種(Lactobacillus casei subsp.rhamnosus 719，簡稱LCR 719)由華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院食品安全教研室保存，保加利亞乳桿菌LB 1.83(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)和嗜熱鏈球菌ST 1.204(Streptococcus thermophilus)購自廣東省微生物研究所菌種保藏中心，植物乳桿菌LP 8140購自CGMCC.

1.1.2 主要試劑及儀器

MRS培養(yǎng)基、瓊脂，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;DNA提取試劑盒、TBE電泳緩沖液、DNA Marker(D-2000)，購自Takara公司;20%SDS，購自廣州市鼎盈貿(mào)易有限公司;95%乙醇、碘液、異丙醇，購自天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心;亞硝酸鈉，購自天津市福晨化學(xué)試劑廠;其余試劑為進口或國產(chǎn)的分析純或生化試劑.主要儀器:電泳儀，北京六一儀器廠生產(chǎn);快速基因擴增儀(PCR)，杭州博日科技有限公司生產(chǎn).

1.2 實驗方法

1.2.1 亞硝酸鹽的檢測

參考國標(biāo)GB/T5009.33—2010《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的鹽酸萘乙二胺法測定亞硝酸鹽含量，稍有修改，不經(jīng)過沉淀蛋白質(zhì)的步驟，直接加2mL對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5min后各加入1 mL鹽酸萘乙二胺溶液(2 g/L)，加水至刻度，混勻，靜置15min測定反應(yīng)液的吸光度.

1.2.2 降解亞硝酸鹽的反應(yīng)

在15 mL試管中，加入10 mL含有10.000 mg/L NaNO2已滅菌的液體MRS培養(yǎng)基，接入5%(體積比)的DMDL 9010的種子液，于37℃密閉狀況下，靜置培養(yǎng)24h后滅菌，取樣，按照1.2.1中方法分析亞硝酸鹽含量(各做3個平行).亞硝酸鹽含量表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差.

1.2.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定

(1)菌株的16S rDNA鑒定

取過夜培養(yǎng)的菌液0.1～1.5 mL，12000 r/min室溫離心1min，棄上清液，沉淀重懸于0.6 mL的溶菌酶溶液中，顛倒混勻5～10次后置于37℃保溫40min，利用試劑盒提取菌種基因組DNA;利用其模板DNA進行PCR擴增，擴增體系見表1.PCR擴增條件為:95℃預(yù)變性5min;94℃變性30s;56℃退火30s，72℃延伸2 min，30個循環(huán);72℃延伸5 min.電泳檢測回收并將擴增得到的片段進行DNA測序，通過與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列BLAST比對，進行16S rDNA鑒定.同時，利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，了解該菌與已知菌的同源性以及在進化過程中的位置.

表1 菌株DMDL 9010的16S rDNA PCR反應(yīng)體系1)Table 1 16S rDNA PCR reaction system of strain DMDL 9010

(2)乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定

由于傳統(tǒng)鑒定方法不能準(zhǔn)確地將親緣關(guān)系較近的乳酸菌鑒別出來，筆者分析比較植物乳桿菌與戊糖乳桿菌在NCBI中的基因組序列，找到高度保守的一段編碼L-乳酸脫氫酶1的DNA序列，通過序列比對找出植物乳桿菌與戊糖乳桿菌ldhL1基因上游和下游的相似DNA序列，設(shè)計兩對引物:F1，TATC-CGTACTGTGTTTCCTC;R1，ACTAGAACCAACAGCGCCGT;F2，TAGGTGGCCTTTTCGGTAGC;R2，CTCGTCTATAGCAGACGGGC.利用設(shè)計的引物進行PCR擴增，反應(yīng)體系見表1.ldhL1基因上游DNA片段PCR擴增的退火溫度為58℃，下游DNA片段PCR擴增的退火溫度為59℃，延伸時間都是1.5min，經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并利用DNA回收試劑盒回收兩段DNA片段，然后對兩段DNA序列進行測序，并利用生物信息學(xué)方法，將兩段序列利用BLAST與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知的序列進行比對，分析比對結(jié)果同時結(jié)合該菌的生理生化特征來鑒別菌株DMDL 9010.

1.3 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)和繪圖均采用Microsoft Excel 2003數(shù)據(jù)分析軟件.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株DMDL 9010降解亞硝酸鹽的效果

利用5株菌DMDL 9010、LCR 719、LB 1.83、ST 1.204、LP 8140降解MRS中亞硝酸鹽，經(jīng)過24 h的降解后，DMDL 9010降解效果最好，能將體系中10.000mg/L亞硝酸鹽降解至檢測不出來，LP 8140降解效果最差，仍殘留(6.489±0.052)mg/L，經(jīng)LCR 719、LB 1.83、ST 1.204降解后體系中亞硝酸鹽的含量分別為(0.872±0.048)、(4.798± 0.555)、(3.274±0.308)mg/L.DMDL 9010的降解效果與LCR 719、LB 1.83、ST 1.204和LP 8140相比，具有顯著性(P≤0.001).可見DMDL 9010具有非常良好的亞硝酸鹽降解效果，將其用于蔬菜發(fā)酵中也有非常好的效果.

2.2 菌株DMDL 9010的16S rDNA分子鑒定

用DNA提取試劑盒提取該菌的基因組DNA，以基因組DNA為模版進行PCR擴增，然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳對擴增的DNA產(chǎn)物進行分析，結(jié)果如圖1所示.利用PCR成功獲得1500 bp左右的條帶，然后將16SrDNA的片段送到Takara公司進行測序，序列長為1441bp，將16SrDNA基因序列利用BLAST軟件同GenBank數(shù)據(jù)庫中已知的乳桿菌屬內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)菌株進行多序列比對，同時繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2.

圖1 PCR后DMDL 9010菌株的16S rDNA電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of PCR-amplified 16S rDNA of strain DMDL 9010

圖2 基于16S rDNA基因序列建立的乳桿菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of Lactobacilli based on 16S rDNA gene sequence

通過比對發(fā)現(xiàn)，菌株DMDL 9010的16S rDNA序列與植物乳桿菌和戊糖乳桿菌相似度達到99%，由此可以推斷此菌株可能是植物乳桿菌或是戊糖乳桿菌.由圖2可見，兩種菌在進化的過程中有著較近親緣關(guān)系.因此對16S rDNA序列分析不能提供足夠的信息來鑒別它們，需要做進一步的生理生化鑒定.

2.3 菌株DMDL 9010的生理生化特征分析

對分離菌株進行的生理生化實驗結(jié)果見文獻［16］.

經(jīng)過對菌株DMDL 9010的生理生化特征進行分析，同時結(jié)合16S rDNA分子鑒定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其與《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［17］中硬壁菌門(Firmicutes)桿菌綱(Bacilli)乳桿菌目(Lactobacillales)乳桿菌科(Lactobacillaceae)的生理生化特征一致［17］.這進一步驗證了16S rDNA分子生物學(xué)鑒定菌株方法的準(zhǔn)確性及有效性.對該分離菌進行糖醇發(fā)酵試驗，其中阿拉伯糖、纖維二塘、果糖、鼠李糖的發(fā)酵結(jié)果為陰性，半乳糖、葡萄糖、麥芽糖、核糖、山梨糖、蔗糖、海藻糖、木糖、棉籽糖、七葉靈、甘露糖的發(fā)酵結(jié)果為陽性.通過《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌和戊糖乳桿菌只有在是否能利用鼠李糖上有區(qū)別，戊糖乳桿菌標(biāo)注是“d”，即80%～90%菌株陽性，植物乳桿菌是陰性.此外，有文獻報道利用DNA-DNA雜交的方法成功地鑒別出植物乳桿菌與戊糖乳桿菌［18］.因此，在對各種糖的利用方面，筆者得出結(jié)論:是否能利用木糖和甘油產(chǎn)酸可以作為鑒別兩種菌的生理生化指標(biāo)，3株戊糖乳桿菌中能在以鼠李糖為單一碳源生長的有1株，14株植物乳桿菌中有7株能利用鼠李糖，這與《伯杰細菌鑒定手冊》存在矛盾，不能達成一致.可見，單一的生理生化指標(biāo)在菌種鑒定方面有局限性.鑒于以上分析，利用新的鑒定方法來區(qū)別兩種親緣關(guān)系比較近的乳酸菌菌株顯得非常必要.

2.4 利用保守L-乳酸脫氫酶1編碼基因序列的分子生物學(xué)鑒定

筆者以ldhL1上下游序列為依據(jù)對菌株DMDL9010進行分子生物學(xué)鑒定相關(guān)結(jié)果，如圖3-6所示.采用ldhL1上下游序列的原因及對相關(guān)結(jié)果的分析如下.

圖3 PCR擴增ldhL1上下游DNA片段Fig.3 The upstream and downstream DNA product of ldhL1 amplified by PCR1，2—ldhL1下游片段;3，4—ldhL1上游片段;5—DNA標(biāo)準(zhǔn)品DL 2000

圖4 菌株DMDL 9010的ldhL1上游DNA序列與NCBI中植物乳桿菌序列比對結(jié)果Fig.4 Alignment of ldhL1 upstream DNA sequence in strain DMDL 9010 with that of L.plantarum in NCBI

圖5 菌株DMDL 9010的ldhL1上游序列與NCBI中戊糖乳桿菌序列比對Fig.5 Alignment of ldhL1 upstream DNA sequence in strain DMDL 9010 with that of L.pentosus in NCBI

鑒于植物乳桿菌與戊糖乳桿菌在進化上有較高相似性以及物種間的同源性，16S rDNA序列比對結(jié)果相似度為100%，同時兩種菌的生理生化性質(zhì)不能提供足夠可靠的鑒別證據(jù)，無法有效地鑒別兩種菌，但通過DNA序列分析發(fā)現(xiàn)兩種菌具有高度保守的一段基因ldhL1(L-乳酸脫氫酶1編碼基因)，兩種菌的ldhL1基因相似度達到90%以上，在進化過程中有較高的保守性［19］.同時對NCBI數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)測序的6株植物乳桿菌亞種(L.plantarum ST-III、L.plantarum WCFS1、L.plantarum 16、L.plantarum P-8、L.plantarum JDM1、L.plantarum ZJ316)與2株戊糖乳桿菌亞種(L.pentosus IG1、L.pentosus MP-10)的乳酸脫氫酶1的上游序列和下游序列差異性進行分析，發(fā)現(xiàn)6株L.plantarum和兩株L.pentosus的上游序列由一段非編碼序列和部分peptidyl-tRNA水解酶編碼序列組成，對這兩段序列在NCBI中DNA序列進行BLAST，發(fā)現(xiàn)兩段序列分別在L.plantarum和L.pentosus菌種內(nèi)具有較高的保守性(序列相似性99%)并且在兩株菌之間差異較大(序列相似性只有78%).然后，同樣地對它們的下游序列進行分析，6株植物乳桿菌的乳酸脫氫酶1序列下游有一段非編碼序列和部分cell surface protein編碼序列，兩段序列在L.plantarum中是高度保守的(序列相似性99%)，而2株戊糖乳桿菌的上游序列是一段非編碼序列，BLAST發(fā)現(xiàn)具有種內(nèi)保守性(序列相似性99%)，并且兩種菌的下游序列相似性較低.因此，利用兩種菌共有的L-乳酸脫氫酶編碼序列，即ldhL1的上游序列以及下游序列的不同作為鑒別兩種親緣關(guān)系較近乳酸菌的方法.利用引物L(fēng)ps1-F、Lps1-R和Lps2-F、Lps2-R分別經(jīng)過PCR擴增得到ldhL1上游序列和下游序列，然后利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖3，電泳條帶較亮，較清晰.

將PCR擴增得到的片段進行測序，得到上游序列917 bp和下游序列843 bp.使用BLAST軟件與NCBI數(shù)據(jù)庫中的DNA序列進行相似性比對，將PCR擴增得到的片段進行測序，得到上游序列917bp和下游序列843bp.使用BLAST軟件與NCBI數(shù)據(jù)庫中的DNA序列進行相似性比對，上游序列與植物乳桿菌(L.plantarum)比對結(jié)果如圖4所示.通過上游相似性比較發(fā)現(xiàn)，序列相似性為99%，identities 917/920，Gaps3/920(0%)，Score 1679 b，即:在序列920bp中有917bp是相同的，只有3bp是不同的，得分是1679 b.同時，與L.pentosus序列的比對結(jié)果見圖5，序列相似性78%，identities 719/926，Gap 32/926，Score只有534b.菌株DMDL 9010的上游序列比對結(jié)果顯示，序列的位置在ldhL1的附近，序列包括部分peptidyl-tRNA水解酶編碼序列以及一段非編碼序列，與前面分析一致，同時由序列相似度可以初步判定菌株DMDL 9010為植物乳桿菌，而非戊糖乳桿菌.

圖6是菌株DMDL 9010的下游序列與植物乳桿菌的比對結(jié)果，分析發(fā)現(xiàn)兩株菌的序列相似性為99%，identities 840/845，Gaps4/845，Score 1530b，而與戊糖乳桿菌的序列比對發(fā)現(xiàn)相似性較低，在NCBI中BLAST沒有戊糖乳桿菌出現(xiàn).上述比對結(jié)果與之前分析一致，與植物乳桿菌相似較高的序列由cell surface protein和一段保守的非編碼序列組成，同時與戊糖乳桿菌比對相似性較低.因此，可以鑒定菌株DMDL 9010是植物乳桿菌.

圖6 菌株DMDL 9010的ldhL1下游序列與NCBI中植物乳桿菌序列比對ig.6 Alignment of ldhL1 downstream DNA sequence in strain DMDL 9010 with that of L.plantarum in NCBI

3 結(jié)論

從泡菜中分離到的菌株DMDL 9010具有很好的降亞硝酸鹽的能力.利用傳統(tǒng)的16S rDNA分子生物學(xué)鑒定方法和生理生化特征將分離的新菌株DMDL 9010鑒定到種的水平，但是無法在植物乳桿菌與戊糖乳桿菌之間做出準(zhǔn)確的鑒別.筆者利用生物信息學(xué)的分析方法，找到這兩種菌在進化過程中較為保守的序列，即L-乳酸脫氫酶1編碼序列，以此為標(biāo)記用PCR擴增其上游與下游相似度較低序列，對PCR產(chǎn)物進行測序以及序列比對分析，鑒定菌株DMDL 9010為植物乳桿菌.在傳統(tǒng)菌種鑒定方法的基礎(chǔ)上，本研究利用分子生物學(xué)以及生物信息學(xué)的方法鑒定了親緣關(guān)系較近的植物乳桿菌與戊糖乳桿菌，為鑒別親緣關(guān)系較近的菌株提供了一條新的思路.還需要對DMDL 9010的降解亞硝酸鹽的關(guān)鍵酶進行研究，以闡明植物乳桿菌降解亞硝酸鹽的機理.

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