李國(guó)慧，劉瑞花，李貴霞，張麗霞，張素領(lǐng)

(1.河北省兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050031;2.河北省老年病醫(yī)院藥劑科，河北 石家莊 050011)

骨肉瘤是兒童和青少年常見(jiàn)的骨惡性腫瘤,盡管早期手術(shù)和輔助化療使得患者預(yù)后有明顯的改善,但目前仍有20%～40%患者死于遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移,對(duì)于遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的患者,采用化療是惟一有效的治療方法,新輔助化療對(duì)提高骨肉瘤患者的5年生存率至關(guān)重要。相對(duì)于其他惡性腫瘤，治療骨肉瘤的化療藥物種類不多，而且目前供臨床使用的化療藥物效果都不太理想,因此篩選不良反應(yīng)小、治療療效高的抗癌藥物,已成為當(dāng)前熱門研究的課題。本研究運(yùn)用電鏡技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)探討苦參堿對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞MG63誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)，并對(duì)促凋亡因子caspase-3產(chǎn)生量的變化進(jìn)行檢測(cè)和分析，旨在進(jìn)一步闡明苦參堿抗癌的作用機(jī)制，為臨床使用苦參堿抗癌治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人骨肉瘤MG63細(xì)胞株由河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心保存，提供使用。

MG63細(xì)胞生長(zhǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基37℃飽和濕度5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 透射電鏡觀察：當(dāng)MG63細(xì)胞生長(zhǎng)到80%匯合時(shí)，加入終濃度為0.2、0.4、0.6g/L含苦參堿的培養(yǎng)基，對(duì)照組加入不含苦參堿藥物的培養(yǎng)基，用藥物培養(yǎng)作用72h后，收集細(xì)胞，用PBS洗2次，然后用體積分?jǐn)?shù)2.5% 的戊二醛4℃固定2h，經(jīng)PBS洗滌2次；用10g/L鋨酸后固定，經(jīng)PBS洗滌2次；丙酮系列脫水；最后用Epon812環(huán)氧樹(shù)脂包埋。KB-1型超薄切片機(jī)切片；醋酸鈾與檸檬酸鉛雙重染色；在透射電鏡(日立H-7500，日本)下觀察并照相。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：收集經(jīng)苦參堿作用72h的MG63細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞，冷PBS漂洗3次。預(yù)冷70%乙醇4℃冰箱固定，上機(jī)檢測(cè)前離心去固定液，0.5%胃蛋白酶消化，碘化丙錠(50mg/L Trinton X-100 1.0%)室溫避光染色，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，應(yīng)用軟件進(jìn)行分析。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)caspase-3蛋白的表達(dá)：收集經(jīng)苦參堿作用72h的MG63細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞，按常規(guī)方法進(jìn)行熒光標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，以熒光指數(shù)表示蛋白的表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1 電鏡觀察結(jié)果：電鏡下可見(jiàn)對(duì)照組MG63細(xì)胞表面有少許微絨毛，細(xì)胞體積較大，橢圓形，核大，不規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有線粒體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，還有游離的核糖體(圖1A)。0.6g/L苦參堿干預(yù)MG63細(xì)胞72h后，電鏡下可觀察到瘤細(xì)胞體積變小，細(xì)胞表面微絨毛消失，細(xì)胞核染色質(zhì)凝集邊聚，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，細(xì)胞表面出現(xiàn)空泡(圖1B)。

圖1 透射電鏡觀察結(jié)果

A.對(duì)照組細(xì)胞(×15 000)；B.0.6g/L苦參堿干預(yù)72h后的MG63細(xì)胞(×15 000)

Figure 1 Morphological observation by transmission electron microscopy in MG63 cells

A.Control cells(×15 000); B.Cells treated with 0.6g/L of matrine for 72h(×15 000)

2.2 細(xì)胞凋亡情況：0.2、0.4、0.6g/L的苦參堿處理細(xì)胞72h后，G0/G1期前面出現(xiàn)凋亡峰。MG63細(xì)胞凋亡率分別為(11.37±0.53)%、(14.28%±0.16)%、(24.59±0.23)%，與對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率(3.27±0.11)%比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。處理后各作用組的細(xì)胞G0/G1期比例增高，分別為(69.14±1.12)%、(75.31±0.33)%、(82.64±0.16)%，與對(duì)照組的(63.21±1.52)%比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 Caspase-3蛋白表達(dá)情況：0.2、0.4、0.6g/L苦參堿處理細(xì)胞72h后，caspase-3蛋白表達(dá)升高，MG63細(xì)胞的熒光指數(shù)分別為1.64±0.01、1.84±0.03、2.08±0.02，與對(duì)照組細(xì)胞熒光指數(shù)1.00±0.02比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討 論

當(dāng)前惡性腫瘤的發(fā)病率逐年增加，已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康的一大殺手，對(duì)惡性腫瘤的防治成為醫(yī)務(wù)工作者面臨的重要課題。目前抗癌藥物的研究已逐漸轉(zhuǎn)向天然動(dòng)植物，我國(guó)傳統(tǒng)的中醫(yī)中藥越來(lái)越受到人們的青睞?？鄥A是從中藥苦參的干燥根中提取的一類活性物質(zhì)，多年來(lái)的藥理和臨床研究發(fā)現(xiàn)苦參堿毒性小，具有抗病毒、抗炎、抗肝纖維化、保肝降酶、升高白細(xì)胞、強(qiáng)心、降壓、抗心率失常、提高機(jī)體免疫力等作用[1-2]，特別是抗癌作用的發(fā)現(xiàn)，引起了人們的普遍關(guān)注[3-4]?？鄥A治療骨肉瘤的研究尚處于起步階段。

腫瘤發(fā)生不僅是由于瘤細(xì)胞的過(guò)度增生，還與瘤細(xì)胞死亡過(guò)少、凋亡機(jī)制障礙有關(guān)[5]。細(xì)胞凋亡參與腫瘤起始過(guò)程，并對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展起負(fù)調(diào)控作用[6]。本研究結(jié)果顯示，MG63細(xì)胞在經(jīng)苦參堿作用后，電鏡下呈早期凋亡的特征，細(xì)胞膜微絨毛消失，可見(jiàn)出芽現(xiàn)象，細(xì)胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞核染色質(zhì)凝集邊聚，最終細(xì)胞核崩解為碎片，并連同其周圍的胞漿共同形成許多凋亡小體。本研究流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，與對(duì)照組相比，隨著苦參堿藥物濃度的增加，G0/G1期占細(xì)胞周期的比例逐漸增加，同時(shí)發(fā)現(xiàn)苦參堿組細(xì)胞G1期前面出現(xiàn)亞二倍體的凋亡峰，0.2、0.4、0.6g/L的苦參堿作用細(xì)胞72h后，MG63細(xì)胞凋亡率分別為(11.37±0.53)%、(14.28±0.16)%、(24.59±0.23)%，呈遞增趨勢(shì)。表明苦參堿能顯著抑制骨肉瘤MG63細(xì)胞的增殖，在阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程的同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

Caspase家族在細(xì)胞凋亡中具有重要作用，其中caspase-3最為關(guān)鍵，在正常情況下caspase-3以無(wú)活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)則轉(zhuǎn)化為有活性的caspase-3?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一些藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡中有caspase-3的活化[7-11]。本研究利用流式細(xì)胞技術(shù)觀察到經(jīng)不同濃度苦參堿作用的MG63細(xì)胞中caspase-3蛋白逐漸升高。說(shuō)明苦參堿作用MG63細(xì)胞過(guò)程中有caspase-3的活化，所以使苦參堿誘導(dǎo)MG63細(xì)胞的凋亡率增加。表明苦參堿誘導(dǎo)MG63細(xì)胞凋亡作用可能與促進(jìn)caspase-3基因的表達(dá)活性增加有關(guān)?？鄥A調(diào)控caspase-3基因表達(dá)的分子生物學(xué)機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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