李巍，辛立波，於洪建，趙余慶，*

（1.沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧沈陽110016；2.天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司，天津300457）

蘋果露中多酚物質(zhì)的含量測(cè)定

李巍1，辛立波1，於洪建2，趙余慶1，*

（1.沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧沈陽110016；2.天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司，天津300457）

利用HPLC法對(duì)蘋果露中的生理活性成分進(jìn)行含量測(cè)定。HPLC法采用Kromasil C18（4.6mm×150mm）色譜柱，流動(dòng)相采用甲醇（A）-水（B）梯度洗脫，流速為1mL/min，柱溫為25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為290 nm，測(cè)定蘋果露中兒茶素和原花青素B2的含量，蘋果多酚采用分光光度法測(cè)定；結(jié)果表明：蘋果露中兒茶素和原花青素B2的平均含量分別為26.77mg/L和45.43mg/L，蘋果多酚為2.92mg/mL；兒茶素、原花青素B2和蘋果多酚在蘋果露中均能檢測(cè)到，且含量較高，為人們飲用蘋果露對(duì)人體的保健作用提供了理論依據(jù)。

蘋果露；兒茶素；原花青素B2；蘋果多酚；HPLC

蘋果中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分被列為我國(guó)四大水果之首[1]。近年來，蘋果種植面積和產(chǎn)量大幅度增加，全國(guó)蘋果總產(chǎn)量已超過2 000萬t/a，居世界首位，全國(guó)近10個(gè)省區(qū)都把蘋果產(chǎn)業(yè)作為當(dāng)?shù)氐闹еa(chǎn)業(yè)來發(fā)展[2]。隨著果品產(chǎn)量的迅速增加，人們對(duì)蘋果的綜合開發(fā)、利用的研究也日趨關(guān)注，蘋果多酚的開發(fā)與利用成為近年來人們關(guān)注的對(duì)象之一。蘋果多酚是蘋果中天然存在的一類重要生物活性物質(zhì)，蘋果多酚具有多種保健功能，如預(yù)防齲齒、預(yù)防高血壓、預(yù)防過敏反應(yīng)、抗腫瘤；抗突變、阻礙紫外線吸收等生理功能，另外還對(duì)化學(xué)性及藥物性肝損傷具有良好的保護(hù)作用，因此可用于保健食品及化妝品的制造[3-6]。蘋果多酚包括多種酚類物質(zhì)，可分為酚酸及其羥基酸酯類、糖類衍生物和黃酮類化合物，如兒茶素、表兒茶素、原花青素、二羥基查耳酮、黃酮醇配糖體等[7-8]。兒茶素是茶多酚的主要成分，現(xiàn)代藥理研究表明，兒茶素具有抗氧化、防輻射、護(hù)膚美容、減緩香煙毒害等多種功效[9]。原花青素B2屬于低聚花青素，它可以清除體內(nèi)的自由基和活性氧，能預(yù)防因人體血液中低密度脂蛋白氧化而引起的動(dòng)脈硬化等[10-12]，另外在制備防治糖尿病及血管并發(fā)癥藥物的應(yīng)用方面國(guó)內(nèi)已經(jīng)申請(qǐng)專利[13]。蘋果露是以天然優(yōu)質(zhì)濃縮蘋果汁為原料，經(jīng)過提純，制劑與食品工藝相結(jié)合制成的蘋果味營(yíng)養(yǎng)露。本品富含豐富的蘋果多酚、原花青素等對(duì)人體健康有益的功效成分。本研究運(yùn)用HPLC法及分光光度法對(duì)蘋果露中兒茶素、原花青素B2和蘋果多酚的含量進(jìn)行了測(cè)定，以期為科學(xué)地評(píng)價(jià)蘋果露的品質(zhì)和為人們飲用蘋果露對(duì)人體的保健作用提供理論依據(jù)。

1 儀器與試劑

高效液相色譜儀：knauer德國(guó)；UV-2800AH紫外可見分光光度計(jì)：上海尤尼可；Sartorius電子天平：北京賽多利斯。

原花青素B2、蘋果多酚標(biāo)準(zhǔn)品：天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司，≥98%；兒茶素：中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：878-200102；蘋果露：天津市壹杯紅生物技術(shù)有限公司；甲醇（色譜純）；雙重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 兒茶素和原花青素B2的測(cè)定

2.1.1 色譜條件

Kromasil C18色譜柱（150mm，4.6mm）；流動(dòng)相采用甲醇（A）：水（B）梯度洗脫，0～20min，22%A；24min，25%A；32min，30%A；39min，40%A；44min，50%A；55min，60%A；60min，80%A；65min～70min，100% A；流速為1mL/min；柱溫25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為290 nm；每次進(jìn)樣10μL，進(jìn)樣前使用0.22μm濾膜過濾。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

準(zhǔn)確稱取兒茶素對(duì)照品2mg和原花青素B2對(duì)照品2mg置于10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。精密吸取適量混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定峰面積值。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸。兒茶素：y=175 155x-905.47，r= 0.999 7表明兒茶素在0.2μg～1.2μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。原花青素B2：y=268 391x+27 862，r= 0.999 8表明原花青素B2在0.2μg～1.2μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取第二批蘋果露樣品10μL連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定色譜峰面積。結(jié)果顯示兒茶素和原花青素B2峰面積的RSD%分別為0.7%和0.9%。

2.1.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)

精密吸取第二批蘋果露樣品10μL共5份，進(jìn)樣，測(cè)定色譜峰面積。結(jié)果顯示兒茶素和原花青素B2峰面積的RSD%分別為0.8%和1.1%，表明本試驗(yàn)測(cè)定方法的重復(fù)性良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別在0、4、8、12、24 h精密吸取第二批蘋果露樣品10μL進(jìn)樣，測(cè)定色譜峰面積。結(jié)果顯示兒茶素和原花青素B2峰面積的RSD%分別為1.2%和1.3%，表明在此時(shí)間內(nèi)供試品溶液性質(zhì)穩(wěn)定。

2.1.6 加樣回收率試驗(yàn)

精取吸取第二批蘋果露樣品，共5份，分別加一定量的兒茶素和原花青素B2對(duì)照品，分別精密吸取10μL進(jìn)樣，測(cè)定，平均回收率分別為98.2%和101.5%， RSD%分別為1.3%和1.6%。

2.1.7 樣品的測(cè)定

吸取蘋果露樣品經(jīng)0.22μm濾膜超濾備用。取對(duì)照品和供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品和蘋果露樣品的HPLC圖譜Fig.1 Chromatograms of reference substances（A）and Apple-dew（B）

定量方法采用外標(biāo)法，結(jié)果見表1。

表1 蘋果露中兒茶素、原花青素B2和蘋果多酚測(cè)定結(jié)果Table1 Determination of catechin，Proanthocyanidin B2and apple-polyphenol

由表1中數(shù)據(jù)可知，三批蘋果露樣品中兒茶素和原花青素B2的平均含量分別為26.77mg/L和45.43mg/L。

2.2 蘋果多酚的測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取標(biāo)樣蘋果多酚，加95%乙醇配制成0.05、0.15、0.25、0.45、0.65mg/mL溶液，取3mL置于25mL具塞試管中，分別加入0.2mL 2%的NH4Fe（SO4）2[2mg NH4Fe（SO4）2用1mol/L的鹽酸定容到100mL]與6mL鹽酸正丁醇溶液（95mL正丁醇加5mL濃鹽酸），搖勻，置95℃水浴反應(yīng)40min，取出，立即冷卻，待用。檢測(cè)波長(zhǎng)：546 nm。以吸光度對(duì)質(zhì)量濃度進(jìn)行回歸，得原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=3.701 7x+0.186 5，r=0.999 7，結(jié)果表明原花青素在0.05mg/mL～0.65mg/mL范圍內(nèi)與吸光度的線性關(guān)系良好。

2.2.2 樣品溶液配制

精取蘋果露5mL，置于25mL量瓶中，用95%乙醇稀釋至刻度。取3mL稀釋的蘋果露樣品于25mL具塞試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)品制備的方法配制。

2.2.3 精密度試驗(yàn)

精密稱取樣品溶液3mL，連續(xù)測(cè)定5次吸光度值。結(jié)果顯示蘋果多酚吸光度值的RSD為0.1%。

2.2.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)

精密取樣品溶液共5份，制備供試品溶液，測(cè)定吸光度。結(jié)果蘋果多酚吸光度的RSD為0.2%。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別在0、4、8、12、24 h精密吸取樣品溶液，測(cè)定吸光度。結(jié)果蘋果多酚吸光度的RSD為0.5%，表明在24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

2.2.6 加樣回收率試驗(yàn)

取蘋果露樣品5份，分別加1mg蘋果多酚對(duì)照品，制備供試品溶液，測(cè)定，結(jié)果平均回收率為99.37%，RSD為2.7%。

2.2.7 樣品測(cè)定

取各批蘋果露樣品，制備供試品溶液，進(jìn)行測(cè)定，將結(jié)果代入蘋果多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算，結(jié)果見表1。由測(cè)定結(jié)果可以得到，三批蘋果露樣品中蘋果多酚含量分別為3.05、2.74、2.96mg/mL，蘋果露樣品中蘋果多酚平均含量為2.92mg/mL。

3 討論

通過對(duì)蘋果露進(jìn)行HPLC分析發(fā)現(xiàn)蘋果露中成分較為復(fù)雜，在保留時(shí)間在46.1min和47.8min有兩個(gè)紫外檢測(cè)器下顯示含量較高的成分，但未能對(duì)其進(jìn)行定性，我們將通過的接續(xù)的研究，運(yùn)用現(xiàn)代分析技術(shù)方法對(duì)其進(jìn)行定性和定量，以期為蘋果露的質(zhì)量控制及營(yíng)養(yǎng)保健作用提供進(jìn)一步的理論基礎(chǔ)。

蘋果多酚經(jīng)多年的研究、實(shí)驗(yàn)及開發(fā)應(yīng)用，以其優(yōu)越的性能為人們所青睞。蘋果多酚制品由于在水中或醇中具有良好的溶解性，被廣泛應(yīng)用到功能性食品和化妝品等領(lǐng)域。同時(shí)既可作為食品添加劑，又可作為防腐劑替代合成防腐劑，提高了其應(yīng)用的安全性。我國(guó)蘋果資源十分豐富，但蘋果加工的產(chǎn)品品種單一，果皮、果渣中的多酚物質(zhì)被廢棄，資源綜合利用和深加工程度低，因此，探討新的作用機(jī)理及研究新的方法，對(duì)開發(fā)蘋果多酚類產(chǎn)品將具有深遠(yuǎn)意義。

[1]邊文華.果品南北貨實(shí)用手冊(cè)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1982:1-2

[2]魯檑,郭寶星,李娟,等.蘋果果膠制備的優(yōu)化工藝研究[J].天然產(chǎn)物分離,2004,2(3):4-5

[3]唐傳核,彭志英.蘋果多酚的開發(fā)及應(yīng)用[J].中國(guó)食品添加劑, 2001(3):41-45

[4]Sylvain G,Bourvellec L C,Nathalie M,et al；Procyanidins are the most Abundant Polyphenols in Dessert Apples at Maturity[J]. Lebensm.-Wiss.u.-Technol；2002,35(3):289-291

[5]Picinelli A,Analysis of polyphennols in apple products[J].Z Lebensm Unters A,1997,204:48-51

[6]凌關(guān)庭.有“第七營(yíng)養(yǎng)素”之稱的多酚類物質(zhì)[J].中國(guó)食品添加劑,2000(1):28-37

[7]J J Mangas Alonso,D Blanco.High-performance Liquid chromatography of the neutral phenolic compounds of lowmolecular weight in apple juice[J].J.Agric Food Chem,1994,42:2732-2736

[8]Augustin Scalbert,Gary Williamson.Dietary intake and bioavailability of polyphenols[M].American SocietyforNutritional Science, 2000:2073-2083

[9]Ngoc TM.Lipoxygenase inhibitory constituents from rhubarb[J]. Arch Pharm Res.2008,31(5):598-605

[10]閆少芳,李勇,吳娟,等.葡萄籽提取物原花青素調(diào)節(jié)血脂作用及機(jī)理研究[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志,2003,15(4):302-304

[11]DEBASIS BAGCHI,CHANDAN K SEN,SIDHARTHA D RAY,et al.Molecular mechanisms of cardioprotection by a novel grape seed proanthocyanidin extract[J].Mutation Research,2008,872(7):523-524

[12]PACKER L,RIMBACH G,VIRGILI F.Antioxidant activity and biologic properties of a procyanidin rich extract from pine(Pinusmaritma)bark,pycnogenol[J].Free Radic Biol Med,1999,27(526):704-724

[13]於洪建,劉岱琳.原花青素B2在制備防治糖尿病及血管并發(fā)癥藥物的應(yīng)用:中國(guó),CN101125139[P].2008-02-20

Determination of Polyphenolic Compounds in Apple-dew

LI Wei1，XIN Li-bo1，YU Hong-jian2，ZHAO Yu-qing1，*
（1.School of Tradition Chinese Materia Medica，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang110016，Liaoning，China；2.Tianjin Jianfeng Natural Product Co.，Ltd，Tianjin，300457，China）

Phenolic compounds，i.e.，catechin，proanthocyanidin B2and appjfnol in Apple-dew were analyzed. Proanthocyanidin B2and catechin were determined by HPLC.Appjfnol was determined by spectrophotometric method.The average content of proanthocyanidin B2，catechin and appjfnol in Apple-dew was 45.43 mg/L，26.77mg/Land 2.92mg/mL，respectively.

Apple-dew；catechin；proanthocyanidin B2；appjfnol；HPLC

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.010.019

2013-05-13

國(guó)家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金（2007GB2A100022）；遼寧省博士啟動(dòng)資金（20111135）

李?。?981—），女（漢），講師，博士，研究方向：食品藥學(xué)。

*通信作者：趙余慶（1957—），男，教授，研究方向：食品藥學(xué)。