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（1中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2中國農業(yè)大學農學與生物技術學院，北京 100193）

適用于轉錄組測序的大白菜小孢子總RNA提取方法篩選

林 燕1，2李 菲1張淑江1張 慧1章時藩1孫日飛1*張振賢2

（1中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2中國農業(yè)大學農學與生物技術學院，北京 100193）

為了找到適用于轉錄組測序要求的大白菜小孢子總RNA提取方法，以出胚率較高的吉紅82為試材，以熱激誘導處理后的小孢子為研究對象，比較分析了TRIzol法、改良CTAB法及超純試劑盒法3種方法的RNA提取效果。結果表明：TRIzol法（磨樣）和改良CTAB法提取的RNA濃度較高，但完整性較差；超純RNA提取試劑盒法提取的RNA質量最高，且完整性好，能夠滿足轉錄組測序的要求。

大白菜；小孢子；RNA提??；轉錄組測序

自Nitsch和Norreel（1973）首先成功應用游離小孢子培養(yǎng)技術獲得煙草小孢子胚和再生植株之后，植物游離小孢子培養(yǎng)技術開始成為培育純合雙單倍體（double haploid，DH）的重要技術手段。目前已在甘藍型油菜（Zaki & Dickinson，1995；Zhao et al.，1996）、大白菜（栗根義 等，1993；姜立榮等，1996）、小麥（Reynold，1993；Kunz et al.，2000）、玉米（Pescitelli et al.，1990；Massonneau et al.，2005）等作物上進行了許多游離小孢子胚胎發(fā)生機制的研究，并利用生物技術手段鑒定出一些經(jīng)熱激誘導后在小孢子胚胎發(fā)生中特異表達的基因和蛋白質。但至今為止只有從甘藍型油菜中提取出來的BBM基因被公認為具有胚胎發(fā)生能力（Pechan et al.，1991；Boutilier et al.，2002）。一些在胚胎發(fā)生過程中特異表達的基因是否起作用，其作用機理又是什么仍有待驗證。在小孢子胚胎發(fā)生這一特殊的發(fā)育過程中還存在著許多目前研究中沒有關注到或沒有被挖掘到的重要作用基因和信號調控途徑，進一步加大游離小孢子胚胎發(fā)生機理的研究力度，盡快找到胚胎發(fā)生過程中的重要功能基因并弄清其調控表達途徑勢在必行。

前人利用mRNA差異顯示技術（mRNA differential display reverse transcription PCR，DDRTPCR）（Liang & Pardee，1992）、抑制消減雜交技術（suppression substractive hybridization，SSH）（Diatchenko et al.，1996）、基因表達系列分析技術（serial analysis of gene expression，SAGE）（Velculescu et al.，1995）和基因芯片技術（gene chip）等對小孢子胚胎發(fā)生過程中的基因差異表達情況進行了研究，也取得了一定的進展。高通量測序平臺的轉錄組測序技術（RNA-seq）能夠在單核苷酸水平對任意物種的整體轉錄活動進行檢測，具有定量更準確、可重復性更高、檢測范圍更廣、分析更可靠等優(yōu)點；同時，該技術還能發(fā)現(xiàn)未知轉錄本和稀有轉錄本，精確地識別可變剪切位點以及cSNP，提供最全面的轉錄組信息（Alagna et al.，2009；McCarthy et al.，2012；Dobin et al.，2013）。目前，轉錄組測序技術已被越來越多的應用到基因轉錄水平的研究中，成為基因差異表達研究最為高效、準確的手段之一，并大有替代之前應用范圍較廣的mRNA差異顯示技術、抑制消減雜交技術、基因表達系列分析技術和基因芯片技術等的趨勢。因此，應用轉錄組測序技術開展小孢子胚胎發(fā)生的相關研究是了解胚胎發(fā)生相關基因的表達模式、弄清胚胎發(fā)生機制的有效手段。

轉錄組測序技術對RNA質量要求較高：植物樣本RNA濃度≥400 ng·μL-1，總量＞20 μg，OD260/OD280為1.8～2.2，OD260/OD230＞1.8，28 S/ 18 S≥1.5，RIN≥6.5。小孢子在早期發(fā)育的細胞形態(tài)階段進行RNA提取相對于普通植物組織來說有一定的難度，并且在實際研究過程中一次能夠收集到的樣品量也不多。而轉錄組測序技術較目前常用的抑制消減雜交、基因芯片等差異基因研究手段，以及定量表達等表達模式研究手段（Maraschin et al.，2005；Tsuwamoto et al.，2007；Sánchez-Díaz et al.，2013；?ur et al.，2014）來說對RNA的質量要求更高。因此找到適用于少量小孢子樣品的高質量RNA提取方法是轉錄組測序及相關分子生物學研究的基礎。本試驗以出胚率較高的大白菜吉紅82為試材，以熱激誘導處理后的小孢子為研究對象，比較分析了TRIzol法、改良CTAB法和超純RNA提取試劑盒法3種方法提取的RNA的質量，以期找到能夠滿足轉錄組測序要求的RNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以易出胚的大白菜吉紅82（中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所白菜育種課題組提供）為試材，2012年12月上旬育苗，2013年1月中旬定植于中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所日光溫室，3月中旬至5月中旬取花蕾進行小孢子培養(yǎng)。

TRIzol購自Invitrogen公司，超純RNA提取試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司（CWbio. Co.，Ltd.，Cat#CW0588）；氯仿、異丙醇、無水乙醇等均為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 游離小孢子培養(yǎng) 取健壯、無病害花蕾，鏡檢后挑選小孢子處于單核靠邊期（培養(yǎng)的最佳時期）的花蕾，先用70%酒精消毒30 s，再用7%飽和次氯酸鈉溶液表面消毒15 min，無菌水沖洗3次后放于研缽中，加少量B5-13洗滌培養(yǎng)基，用研錘輕輕擠壓使小孢子游離于溶液中，用孔徑為300目的尼龍網(wǎng)紗過濾，收集濾液，1 200 r·min-1離心3次，每次4 min，離心后棄上清液，將收集到的小孢子懸浮于過濾滅菌的NLN-13基本培養(yǎng)基，調整孢子濃度為1×105個·mL-1，分裝于60 mm×15 mm培養(yǎng)皿，每皿2～3 mL，用石蠟膜封口，33 ℃熱激誘導24 h。

1.2.2 RNA提取 收集33 ℃熱激誘導處理24 h后的小孢子，1 200 r·min-1離心3次，每次4 min，離心后棄上清液，留下的沉淀立即進行RNA提取或在液氮中凍透后存于-70 ℃冰箱備用。試驗中使用的量筒、試劑瓶等玻璃制品以及研缽、藥勺、移液槍頭、離心管等均用0.1% DEPC處理；雙蒸水經(jīng)0.1% DEPC處理過夜后再高壓滅菌（121 ℃，30 min），其他化學試劑均用DEPC處理水配置；電泳槽及電泳托、梳子等凝膠電泳用品用3%雙氧水浸泡數(shù)小時后用再蒸餾水沖洗。

采用3種方法進行RNA提取。A，TRIzol法，勻漿化處理又分為2種：A1，收集小孢子細胞5×106～10×106個，直接加入1 mL TRIzol試劑，反復吸打幾次混勻；A2，收集等量（小孢子細胞5×106～10×106個）樣品，置于預冷的研缽中，加入液氮迅速研磨（先用研錘將冷凍住的樣品小心地用力碾壓幾次，待樣品呈小顆粒狀時再由慢及快進行研磨），待液氮揮發(fā)后立即將充分研磨的粉末狀樣品移入1.5 mL的EP管中，加入1 mL TRIzol試劑，在旋渦振蕩器上充分混勻。其余步驟嚴格按照說明書操作，提取的RNA立即進行檢測或在液氮中凍透后存于-70 ℃冰箱備用。B，改良CTAB法，參照黃雪梅等（2009）的方法稍加改動。C，超純RNA提取試劑盒法，嚴格按照說明書的提取步驟進行操作。

1.2.3 RNA質量檢測 采用Nanodrop 2000檢測總RNA濃度及OD值，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA條帶的清晰度和完整性；采用Agilent 2100檢測28 S/18 S值及RIN值。

2 結果與分析

2.1 RNA電泳結果分析

由圖1可以看出，3種方法提取的RNA都能看到28 S和18 S兩條帶，但是用TRIzol法直接進行細胞裂解（A1）提取的RNA條帶不明亮，而且發(fā)生嚴重的拖尾和彌散現(xiàn)象，說明該方法提取的RNA濃度較低，完整性較差；用TRIzol法磨樣（A2）后提取的RNA條帶較清晰，28 S的亮度比18 S高，明顯好于A1，但有輕微的拖尾現(xiàn)象；改良CTAB法（B）提取的RNA條帶清晰，但存在明顯的拖尾現(xiàn)象；超純RNA試劑盒法（C）提取的RNA條帶無拖尾、彌散現(xiàn)象，28 S和18 S兩條帶明亮且亮度比約為2∶1，說明其完整性好。

圖1 不同方法提取的RNA電泳檢測結果

2.2 RNA質量及濃度分析

從表1可以看出，3種方法提取的RNA的OD260/OD230和OD260/OD280值都符合標準，說明純度較好，沒有污染。用TRIzol法直接進行細胞裂解（A1）提取的RNA濃度較低，RIN值為2.97，說明RNA降解嚴重，完整性差；用TRIzol法磨樣（A2）后提取的RNA濃度較高，28 S/18 S＞1.5，但是RIN值為5.53，略低于轉錄組測序要求；改良CTAB法（B）提取的RNA濃度和總量均能達到要求，但28 S/18 S值為1.10，RIN值也偏低；超純RNA提取試劑盒法（C）提取的RNA質量最高，總量遠超過20 μg，RIN值達到6.90，能夠滿足文庫構建和轉錄組測序的要求。

表1 不同方法提取的RNA質量

3 結論與討論

RNA提取是分子生物學研究的技術基礎，不同植物由于其生理特性不同，適宜的RNA提取方法亦不同，即使同種植物的不同組織適宜的提取方法也不盡相同（李宏和王新力，1999；楊占軍 等，2009）。植物游離小孢子為液體培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)，相對于普通植物組織來說RNA提取有一定難度，而且在實際研究過程中每個處理能夠收集到的樣品量也不多，樣品中殘留的水分還會對液氮研磨產生一定影響。本試驗中，每個處理收集小孢子數(shù)為5×106～10×106個，置于預冷的研缽中，加入液氮后會凍住，因此應先用研錘將冷凍的樣品小心地用力碾壓幾次，待樣品呈小顆粒狀時再由慢及快研磨成粉末狀，以防因研磨力度過大導致樣品濺出而造成浪費，影響RNA提取效果。

轉錄組測序等分子生物學研究技術對RNA的質量和濃度要求較高，因此急需找到一種適合游離小孢子RNA提取的方法以滿足相關研究工作的要求。TRIzol的主要成分是酚，主要作用是裂解細胞，可以在破壞細胞使RNA釋放出來的同時保護RNA的完整性；同時，TRIzol里加入了可以抑制RNA酶的胍鹽。在核酸物質得到釋放的同時，細胞中的蛋白也被釋放出來，而氯仿可以使蛋白變性，降低蛋白的溶解度，同時還可以去除植物色素和蔗糖。加入氯仿后離心，RNA存在于上層水樣層中，收集上層水樣層后采用異丙醇沉淀來還原RNA。由于異丙醇主要沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，對5 S RNA、tRNA及多糖不產生沉淀，所以RNA電泳的標志性3條帶中5 S RNA帶很不清楚。最后加入乙醇的主要作用是洗滌異丙醇，也可以溶解一部分蛋白，而痕量乙醇很容易揮發(fā)掉。本試驗中，按普通植物組織提取法先進行液氮研磨再勻漿處理，得到的RNA濃度、純度和完整性都比較好，可以用于RT-PCR、southern等相關研究，但是RNA的完整性還達不到轉錄組測序的要求。而TRIzol法中針對懸浮細胞裂解提取RNA的方法目前主要應用于動物細胞和細菌，并不適合植物小孢子細胞，這可能是因為植物細胞壁影響了裂解效果造成的。

改良CTAB提取液中高濃度的NaCl以及CTAB和β-巰基乙醇共同作用都可以去除多糖等代謝雜質，因此其最突出的作用特點是能夠有效去除多酚、多糖等次生代謝物（胡根海和喻樹迅，2007；王春暉 等，2013）。小孢子培養(yǎng)過程中會產生一部分次生代謝產物，而且培養(yǎng)基中含有大量糖分，因此改良CTAB法可能對消除這些成分的影響起到一定的作用。另外，CTAB通對植物細胞的裂解去污作用以及與β-巰基乙醇共同對蛋白的強烈變性作用，可以使核酸徹底被釋放出來。該方法操作簡單且費用較低，但準備提取液等試劑比較繁瑣，RNA提取所需要的時間也比較長。

本試驗中選用的試劑盒具有獨特的Shredder分離柱，能有效過濾高粘度的植物裂解物，同時采用硅膠吸附柱對RNA進行純化，多聚糖等污染物可被有效去除，提取的RNA純度高；利用無RNase的DNase在柱上進行消化去除后無DNA殘留；Buffer中加入β-巰基乙醇還可以使蛋白強烈變性，避免污染。因此，使用該試劑盒提取的RNA濃度和純度均較高。另外，超純試劑盒法通過過柱離心的方法分離細胞碎片以及去除雜質，不需要多次有機溶劑溶液抽提，簡單快捷；加上所有Buffer都是小量包裝，這些都在一定程度上降低了污染。此方法也不需要低溫環(huán)境，比較方便。

本試驗對3種RNA提取方法進行了比較，發(fā)現(xiàn)TRIzol法直接裂解細胞進行RNA提取效果比較差，不適用于大白菜小孢子RNA提取。超純RNA提取試劑盒法提取的RNA質量高、完整性好，能夠滿足轉錄組測序的要求。但是本試驗所選取的方法有限，而且RNA提取受環(huán)境和操作等因素的影響也比較大，有必要對更多的RNA提取方法進行篩選，在實際操作中對環(huán)境和操作因素也應格外注意，以期找到更加高效、便捷且費用較低的RNA提取方法，為轉錄組測序等技術的應用奠定堅實的基礎。

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Screening of Methods to Extract Total RNA from Micro-spore of Chinese Cabbage Suitable for Transcriptome Sequencing

LIN Yan1，2，LI Fei1，ZHANG Shu-jiang1，ZHANG Hui1，ZHANG Shi-fan1，SUN Ri-fei1*，ZHANG Zhen-xian2

（1Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China；2College of Agronomy and Biotechnology，China Agricultural University，Beijing 100193，China）

In order to find out micro-spore extracting method suitable for transcriptome sequencing，this study took Chinese cabbage‘Jihong 82’as experimental material and micro-spore induced with heat shock as research object．This study compared and analyzed the RNA extraction effects by 3 different methods：TRIzol method，improved CTAB method and ultrapure kit method．The results showed that RNA concentrations extracted by TRIzol method and improved CTAB method were higher，but the RNA integrity was lower．Quality of RNA extracted by ultrapure kit method was the highest，and the RNA inegrity was also good．Therefore，RNA obtained by this method was suitable for satisfying the requirement of transcriptome sequencing．

Chinese cabbage；Micro-spore；RNA extraction；Transcriptome sequencing

林燕，女，博士研究生，專業(yè)方向：大白菜遺傳育種，E-mail：sdau_yan@163.com

*通訊作者（Corresponding author）：孫日飛，男，研究員，博士生導師，專業(yè)方向：大白菜遺傳育種，E-mail：sunrifei@caas.cn

2014-03-21；接受日期：2014-05-16