張梁，韓煜暉，秦金花

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉生物化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230036）

發(fā)酵茶葉水浸出物對(duì)PC12神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用

張梁，韓煜暉，秦金花

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉生物化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230036）

采用高效液相色譜（HPLC）分析普洱茶、烏龍茶、綠茶和紅茶連續(xù)三次水浸泡物中茶多酚類及嘌呤類生物堿的含量。利用PC12神經(jīng)細(xì)胞損傷模型比較四種茶葉提取物對(duì)于PC12神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。采用熱90℃，30min/次，25倍量水，連續(xù)3次浸泡4種茶葉，第1次和第2次提取能夠獲得茶葉中的主要多酚類物質(zhì)。普洱茶、烏龍茶、綠茶和紅茶中前兩次總多酚類成分的提取率為99.38％、94.50％、87.49％、99.15％，而嘌呤類生物堿的提取率為97.57％、95.81％、88.01％、97.95％。PC12神經(jīng)細(xì)胞活性測(cè)試結(jié)果顯示各種茶葉提取物對(duì)谷氨酸導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞興奮性毒性損傷具有較好的保護(hù)作用，而對(duì)過(guò)氧化氫以及BSO導(dǎo)致的細(xì)胞損傷并無(wú)顯著影響。

茶葉；PC12神經(jīng)細(xì)胞；損傷；多酚

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是老年人中最常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病之一，是造成癡呆的主要原因，占癡呆患者總數(shù)的2/3以上，在65歲以上人群中，西方約有5％的人患此病，我國(guó)60歲以上人群AD的患病率為3％～5％[1]。AD病因?yàn)槎嘁蛩貐⑴c，發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。但是，一般認(rèn)為神經(jīng)細(xì)胞興奮性毒性和氧化損傷是阿爾茨海默病的兩個(gè)發(fā)病機(jī)理[2]。腦缺血缺氧后神經(jīng)細(xì)胞的死亡是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。細(xì)胞外液中谷氨酸積聚造成興奮毒性損傷是神經(jīng)元死亡的始動(dòng)因素，而由于過(guò)氧化物過(guò)度聚集導(dǎo)致的（·O2-）自由基，導(dǎo)致細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化等一系列鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，也會(huì)造成細(xì)胞的凋亡[3]。

PC12細(xì)胞株源于大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤，已被廣泛用于神經(jīng)細(xì)胞死亡方式及神經(jīng)毒方面的研究[4]。鑒于許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生都與興奮性氨基酸谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)比較了各種茶葉提取物對(duì)于谷氨酸神經(jīng)毒性的抑制作用。此外，GSH合成酶抑制劑丁胱亞磺酰亞胺（buthionine sulfoximine，BSO）以及過(guò)氧化氫造成神經(jīng)細(xì)胞損傷模型也被用于比較各種茶葉的神經(jīng)細(xì)胞損傷保護(hù)作用[5-7]。基于此，我們運(yùn)用體外培養(yǎng)神經(jīng)元的方法，初步觀察了各種茶葉提取物對(duì)培養(yǎng)神經(jīng)元存活的作用，同時(shí)在谷氨酸等多種神經(jīng)毒素的神經(jīng)毒損傷的基礎(chǔ)上觀察茶葉成分對(duì)該損傷是否具有保護(hù)作用。

1 材料和儀器

1.1 樣品

收集市面上主流的茶葉樣品，收集的樣品范圍包括了普洱熟茶、烏龍茶、綠茶和紅茶，各種茶葉樣品詳細(xì)情況如表1所示。

表1 各茶葉樣品來(lái)源Table1 Details of tea samples

1.2 藥品與試劑

兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、沒(méi)食子兒茶素（GC）、表沒(méi)食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（GCG）、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）、沒(méi)食子酸（GA）、咖啡堿（CA）、可可堿（THE）標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于98％。

乙腈（色譜純）為天津天津彪仕奇科技發(fā)展公司產(chǎn)品，自制雙蒸水。

1.3 儀器

高效液相色譜儀HP 1100系列（四元泵，在線脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，紫外檢測(cè)器）：美國(guó)Agilent公司；電子分析天平BP211D：瑞士Sartorius公司；無(wú)菌超凈工作臺(tái)：蘇州臨海凈化設(shè)備公司；二氧化碳培養(yǎng)箱（MCO-15AC）：日本SANYO公司；SUNRISE酶標(biāo)儀：奧地利TECAN Austria GmbH公司。

1.4 色譜條件

色譜柱AgilentZORBAXSB-AqC18（250mm×4.6mm，5μm），帶保護(hù)柱；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.6％甲酸水（B），運(yùn)行時(shí)間為60min，梯度洗脫條件如下：5∶95-30∶70（0～60min）；柱溫為30℃；流速為0.8mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。

1.5 樣品配置

取各種茶葉粗粉（過(guò)4號(hào)篩）2.0 g，精密稱定，置于具塞三角瓶中，加入25倍量水，90℃條件下浸泡30min，每隔10分鐘晃動(dòng)一次，取出，補(bǔ)重，室溫下放置20min，連續(xù)提取3次，分別取上清液過(guò)0.22μm微孔濾膜，續(xù)濾液進(jìn)樣5μL，HPLC檢測(cè)。

取各種茶葉提取液1mL，過(guò)0.22μm微孔濾膜，收集續(xù)濾液，于40℃條件下真空干燥，采用1mL的DMSO復(fù)溶，過(guò)0.22μm微孔濾膜，作為PC12神經(jīng)細(xì)胞活性測(cè)試樣品。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)與測(cè)試

細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)為10％新生牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，置CO2培養(yǎng)箱（37℃，5％CO2）培養(yǎng)，隔2天傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。PC12細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組及各茶葉組。上述各組細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)24 h，除對(duì)照組外，模型組給予終濃度為50μmol/L的H2O2（BSO或谷氨酸）；給藥組高中低濃度分別同時(shí)給予各種茶葉水提物，孵育2 h后，再給予終濃度為50μmol/L的H2O2（BSO或谷氨酸），繼續(xù)培養(yǎng)72 h，檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。細(xì)胞消化后配成單細(xì)胞懸液，以每孔105個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每組8復(fù)孔，于培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)，加入5 g/L的MTT 10μL，培養(yǎng)結(jié)束后，傾去培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 100μL，振蕩混勻，使結(jié)晶完全溶解，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于570 nm處測(cè)定其吸光度值（A值）。對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)率為100％，其余各組存活率=各濃度組A值/對(duì)照組A值×100％。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以x±s表示，細(xì)胞存活率表達(dá)水平組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 普洱茶、烏龍茶、綠茶與紅茶中連續(xù)浸泡液中主要多酚類成分及嘌呤類生物堿的含量分析

HPLC分析四種茶葉經(jīng)過(guò)三次熱水浸提后浸提液中主要多酚類和嘌呤類生物堿的水平。如下圖1所示，圖1-A中主要的多酚類物質(zhì)為沒(méi)食子酸和沒(méi)食子兒茶素，而其它多酚類成分在普洱熟茶中含量極低。經(jīng)過(guò)兩次提取，茶渣中主要的兒茶素類和沒(méi)食子酸類成分含量極低。一些兒茶素類成分，例如EGCG、GCG、ECG、EC等在檢測(cè)線以下未被檢測(cè)到。

圖1-B中主要的多酚類物質(zhì)為ECG、EGCG、EC和EGC，而GA在烏龍茶中含量較低。經(jīng)過(guò)兩次提取，茶渣中主要的仍然保留了部分的茶多酚類成分，總兒茶素和沒(méi)食子酸含量大于5％。與烏龍茶相比較，綠茶中前兩次的提取率更低，總多酚的提取率為87.49％，兩次熱水浸提之后，經(jīng)過(guò)兩次熱水提取之后的綠茶茶渣中多酚類含量總量超過(guò)10％。紅茶的熱水提取率與普洱茶相似，兩者同為發(fā)酵茶葉，紅茶中前兩次的多酚提取率為99.15％，兩次提取之后紅茶茶渣中可利用的多酚類物質(zhì)很少。

圖1 普洱茶、烏龍茶、綠茶和紅茶三次提取物中主要多酚類物質(zhì)及嘌呤類生物堿的含量Fig.1 The contents of major polyphenols and purine alkaloids in three extracts of pu-erh tea，oolong tea green tea and black tea

2.2 普洱茶、烏龍茶、綠茶與紅茶提取物對(duì)PC12神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用

各組PC12細(xì)胞活性的比較，經(jīng)過(guò)BSO，過(guò)氧化氫和谷氨酸損傷之后，各組的PC12細(xì)胞存活率分別為（65.77±2.12）％，（42.84±0.95）％和（49.28±1.29）％，明顯低于對(duì)照組（100％）（P＜0.01），表明這3種神經(jīng)細(xì)胞毒性劑導(dǎo)致了PC12細(xì)胞損傷。與模型組比較，給予茶葉提取物組的細(xì)胞存活率如圖2所示。

圖2 普洱茶、烏龍茶、綠茶和紅茶提取物對(duì)于BSO，H2O2和谷氨酸導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用Fig.2 The protective effects of pu-erh tea，oolong tea，green tea and black tea on PC12 cells in jury induced by BSO，H2O2and glutamate

各種茶葉提取物對(duì)于谷氨酸所導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞損傷具有較好的保護(hù)作用，而對(duì)于過(guò)氧化氫的過(guò)氧化損傷，以及BSO所導(dǎo)致的GSH合成酶抑制無(wú)明顯的保護(hù)作用。

如圖2所示，第1次，第2次和第3次茶葉提取物的PC12神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用與提取物中多酚類成分含量呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，而且普洱茶（A）、烏龍茶（B）和綠茶（C）的作用較強(qiáng)，而紅茶（D）的保護(hù)作用較弱。

3 小結(jié)

經(jīng)過(guò)兩次熱水浸泡提取之后，全發(fā)酵茶葉，后發(fā)酵茶葉，以及半發(fā)酵茶中多酚類成分以及嘌呤類生物堿提取殆盡。而未發(fā)酵茶葉綠茶中前兩次熱水的總提取率不足90％，經(jīng)過(guò)兩次熱水提取之后，綠茶茶渣中仍然含有10％左右的多酚類成分。結(jié)果提示在各種茶葉的深加工過(guò)程中，應(yīng)當(dāng)考慮茶葉類型對(duì)于茶葉提取效率的影響。

經(jīng)過(guò)熱水浸提之后的四種不同發(fā)酵程度的茶葉，其浸提液對(duì)于谷氨酸導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞毒性損傷都具有較好的保護(hù)作用。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)含量最高的一種神經(jīng)遞質(zhì)，急性細(xì)胞損傷會(huì)造成谷氨酸的大量釋放，從而對(duì)神經(jīng)元造成損傷。在許多神經(jīng)退行性疾病中，如帕金森病和阿爾茨海默病等，谷氨酸也發(fā)著極其重要的作用。四種茶葉提取物可以抑制谷氨酸造成Ca2+離子內(nèi)流神經(jīng)興奮性毒性。BSO作為一種GSH合成酶抑制劑可以提高腫瘤藥物的藥效，降低腫瘤細(xì)胞耐藥性。在本研究中，BSO作為GSH合成酶抑制劑，可以導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平下降，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示茶葉提取物對(duì)于過(guò)氧化氫和BSO所造成的神經(jīng)細(xì)胞損傷無(wú)顯著保護(hù)作用。

谷氨酸的神經(jīng)細(xì)胞興奮性毒性與多種神經(jīng)退行性疾病相關(guān)，茶葉提取物對(duì)于PC12細(xì)胞谷氨酸損傷的保護(hù)作用提示茶葉可能具有潛在的保健作用。雖然茶葉中多酚類成分差異較大，但各種茶葉提取物都具有較好的神經(jīng)細(xì)胞損傷保護(hù)作用，這可能與其中的咖啡堿有關(guān)。關(guān)于茶葉對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)理還需要進(jìn)一步的研究。

[1]田金洲,時(shí)晶,苗迎春,等.阿爾茨海默病的流行病學(xué)特點(diǎn)及其對(duì)公共衛(wèi)生觀念的影響[J].湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,11(1):3-7

[2]金桂芳,梅寒芳,楊紅.阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制及藥物治療進(jìn)展[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào),2006,22(6):697-700

[3]岳少杰,虞佩蘭.谷氨酸的興奮性神經(jīng)毒性作用與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷[J].國(guó)際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志,1994,21(4):205-208

[4]賀文彬,張俊龍,陳乃宏,等.補(bǔ)腎方含藥血清促進(jìn)PC12細(xì)胞增殖及其拮抗谷氨酸神經(jīng)毒作用的研究[J].中國(guó)藥學(xué),2005,14(2): 119-124

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[6]Bharat S,Cochran B C,Hsu M,et al.Pre-treatment with R-lipoic acid alleviates the effects of GSH depletion in PC 12 cells:implications for Parkinson's disease therapy[J].NeuroToxicology,2002,23 (4/5):479-486

[7]邱瑜,陳紅專,金正均.谷氨酸神經(jīng)細(xì)胞毒作用的新途徑——谷氨酸/胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)機(jī)制[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2000,16(3):251-253

The Protective Effects of Fermented Teas Aqueous Extracts on PC12 Cells Injury

ZHANG Liang，HAN Yu-hui，QIN Jin-hua
（Key Laboratory of Tea Biochemistry&Biotechnology，Ministry of Education，Anhui Agricultural University，Hefei230036，Anhui，China）

Using the HPLC method，the contents of major polyphenols and purine alkaloids were determined on consecutive extracts of pu-erh tea，oolong tea，green tea and black tea for three times.PC12 cells were also introduced for the studies on the protective effects of these tea extracts.Under the extraction condition of hot water at 90 centidegree for 30 min each time，four kinds of tea were consecutively extracted for three times.The combination of first and second extracts of pu-erh tea，oolong tea，green tea and black tea account for the99.38％，94.50％，87.49％，99.15％of total polyphenols，and for 97.57％，95.81％，88.01％and 97.95％of purine alkaloids.All of four kinds of tea extracts show great protective effects on the injury of PC12 induced by glutamate，rather than buthionine sμlfoximine（BSO）and H2O2.

Tea；PC12 cells；injury；polyphenols

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.04.001

2012-12-21

國(guó)家自然科學(xué)基金（31201335）；安徽省自然科學(xué)基金（1308085QC51）

張梁（1985—），男（漢），講師，博士，研究方向：茶葉化學(xué)成分與功效。